李 輝 趙 峰 計 峰 張宏福*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,合肥 230036;2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,動物營養(yǎng)學國家重點實驗室,北京 100193)

仿生消化系統(tǒng)測定鴨飼料原料代謝能的重復性與精密度檢驗

李 輝1,2趙 峰2計 峰1張宏福2*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,合肥 230036;2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,動物營養(yǎng)學國家重點實驗室,北京 100193)

本試驗通過采用仿生消化系統(tǒng)測定常用鴨飼料原料(玉米、豆粕、棉籽粕和小麥麩)干物質(zhì)消化率與代謝能的變異,探討該系統(tǒng)測定鴨飼料原料代謝能的重復性與精密度,為確立基于仿生消化系統(tǒng)定量測定飼料養(yǎng)分的生物學效價方法提供參考。重復性試驗采用單因素完全隨機設(shè)計,其中同一套仿生消化系統(tǒng)的重復性試驗每一飼料原料設(shè)3個處理(批次),每個處理10個重復。不同套仿生消化系統(tǒng)間的重復性試驗每一飼料原料設(shè)3個處理(儀器),每個處理10個重復。試驗結(jié)束后分別測定每個重復的干物質(zhì)消化率和代謝能。結(jié)果表明,同一套仿生消化系統(tǒng)不同批次間玉米、豆粕、棉籽粕和小麥麩干物質(zhì)消化率與代謝能的批內(nèi)變異系數(shù)、批間變異系數(shù)和總變異系數(shù)均小于1.40%,不同套仿生消化系統(tǒng)間玉米、豆粕、棉籽粕和小麥麩干物質(zhì)消化率與代謝能的儀器內(nèi)變異系數(shù)、儀器間變異系數(shù)和總變異系數(shù)均小于1.64%。通過對4種鴨飼料原料干物質(zhì)消化率和代謝能進行正態(tài)性檢驗及95%置信區(qū)間分析,重復觀測數(shù)據(jù)中玉米、豆粕、棉籽粕和小麥麩干物質(zhì)消化率的最大絕對偏差分別控制在0.94%、1.00%、1.02%和0.88%以內(nèi),其中85%的觀測數(shù)據(jù)最大絕對偏差均不高于0.75%;代謝能最大絕對偏差分別控制在0.18、0.29、0.18和0.24M J/kg,其中85%的觀測數(shù)據(jù)最大絕對偏差均不高于0.22MJ/kg。從本試驗的重復性及精密度看,采用該仿生消化系統(tǒng)測定鴨飼料原料代謝能可以達到較高的定量水平。

鴨飼料原料;代謝能;仿生消化系統(tǒng);重復性;精密度

飼料的營養(yǎng)價值特別是可消化養(yǎng)分參數(shù)是優(yōu)化飼料配方首先需要建立的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。然而,傳統(tǒng)生物學飼料養(yǎng)分的消化試驗存在著耗資、費時、費力,系統(tǒng)誤差大和重復性差等一系列問題,這已成為飼料營養(yǎng)價值評定工作中的重要技術(shù)瓶頸[1-2]。隨著動物消化生理學、生物化學以及酶學等研究的深入,前人在通過模擬飼料養(yǎng)分在動物體內(nèi)的酶水解規(guī)律的基礎(chǔ)上提出了一些體外測試方法并取得了一些進展,但由于在測定酶活時不可避免地會受到來自手工測試環(huán)境的系統(tǒng)誤差,從而導致這一技術(shù)路線受到質(zhì)疑,特別是不同畜禽消化道內(nèi)的酶譜變異規(guī)律不同,更導致了以酶法為主要手段的體外消化系統(tǒng)的設(shè)計與普及一直停滯不前[3-6]。然而通過體外模擬飼料養(yǎng)分在動物體內(nèi)的消化程度以實現(xiàn)對飼料養(yǎng)分消化率的估測已逐漸被丹麥、荷蘭、法國等發(fā)達國家所認同[7-8],但尚鮮見程控專門化的測試工具,重復測定的相對標準偏差仍然居高不下[9]。針對傳統(tǒng)酶法的技術(shù)瓶頸問題,動物營養(yǎng)學國家重點實驗室開發(fā)出了電腦程控自動模擬豬禽飼料養(yǎng)分消化的單胃動物仿生消化系統(tǒng)、標準酶試劑盒以及分離不消化物質(zhì)的專用裝置,由該裝置測定的19個棉籽粕樣品的鴨代謝能與排空強飼法測定的鴨代謝能較為接近[10]。由此可見,基于仿生消化系統(tǒng)的飼料養(yǎng)分生物學效價的評定方法有望成為一種快速、標準化方法。為了檢驗仿生消化系統(tǒng)能否達到飼料養(yǎng)分生物學效價定量測定的基本要求,本試驗通過采用3套仿生消化系統(tǒng)分別測定不同批次間及不同套仿生消化系統(tǒng)間常用鴨飼料原料干物質(zhì)消化率與代謝能的變異,探討仿生消化系統(tǒng)測定鴨飼料養(yǎng)分生物學效價的重復性與精密度,為確立鴨飼料養(yǎng)分生物學效價的仿生評定方法提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用玉米(產(chǎn)地為北京)、豆粕(產(chǎn)地為河北)、棉籽粕(產(chǎn)地為山東)和小麥麩(產(chǎn)地為北京)4種常用鴨飼料原料為試驗材料,采用四分法取樣后用萬能粉碎機粉碎并過40目篩,充分混合均勻,貯存于樣品瓶中-20℃保存?zhèn)溆谩?種飼料原料的營養(yǎng)水平見表1。

表1 4種飼料原料的營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Tab le 1 Nutrient levels of 4 kinds of feedstuffs(DM basis) %

1.2 試驗設(shè)計

采用單因素完全隨機設(shè)計,同一套仿生消化系統(tǒng)的重復性試驗每一飼料原料設(shè)3個處理(批次),每個處理10個重復。不同套仿生消化系統(tǒng)間的重復性試驗每一飼料原料設(shè)3個處理(儀器),每個處理10個重復。

1.3 透析袋的處理與緩沖液的制備

將透析袋(MEMBRA-CEL MD 44-14,美國Viskase公司生產(chǎn),截留分子量為14 000 u)剪成25 cm左右的小段,于質(zhì)量濃度為2%NaHCO3和1mm ol/L EDTA(pH 8.0)混合溶液中煮沸10 min,然后用去離子水徹底清洗透析袋,再置于1mm ol/L EDTA(pH 8.0)溶液中煮沸 10 m in,冷卻后4℃保存?zhèn)溆?確保透析袋始終浸泡在溶液內(nèi))。按照鄭衛(wèi)寬[10]的試驗方法,在42℃下配制pH 2.0的鹽酸溶液作為胃消化期的緩沖液,配制含青霉素、鏈霉素各 50萬單位雙抗的 0.2 mo l/L pH 6.5和7.9的磷酸鹽緩沖液,分別作為小腸消化前期(小腸前段)和后期(小腸中后段)的緩沖液。

1.4 仿生消化系統(tǒng)仿生消化過程的參數(shù)設(shè)置與操作規(guī)程

通過仿生消化系統(tǒng)控制軟件Ver 1.0(軟著登字第0154149號),設(shè)置水浴鍋溫度為43℃,空氣浴搖床溫度為42℃,搖床轉(zhuǎn)速為180 r/m in,蠕動泵流速為425 m L/min。模擬胃消化時長4 h,小腸消化前期和后期各時長7.5 h,殘液排出時長3 m in,清洗液體積1 200 m L,清洗4次。

仿生消化操作的具體方法是:首先將1 000m L 0.05 m ol/L的KOH溶液裝于清洗瓶中,運行清洗程序(清洗消化時長0.05 h,殘液排出時長2 m in,清洗液用量300 m L,清洗時長2 m in,清洗1次),然后換上去離子水再將儀器管道清洗2次,最后排空管道積水,完成清洗過程。與此同時,將已處理好的透析袋洗凈裝于模擬消化管中,固定后一端用翻口硅膠塞密封,用去離子水沖洗透析袋內(nèi)部3～4次。稱取一定量的飼料樣品(能量飼料約為2 g,蛋白質(zhì)飼料和粗飼料約為1 g,均精確到0.000 2 g,同時另稱取2份分別用于干物質(zhì)含量和總?cè)紵裏嶂档臏y定),無損失地轉(zhuǎn)移至裝有透析袋的模擬消化管中,再加入20m L模擬胃液(含1 550 U/m L胃蛋白酶),并用帶有注射口的翻口硅膠塞密封。將模擬消化管置于仿生消化系統(tǒng)中,連接消化管路,點擊控制軟件的開始試驗菜單。胃消化期完成后,儀器自動暫停,用移液器在每個模擬消化管的注射口準確加入2 m L模擬小腸液,繼續(xù)進行小腸階段消化。消化完畢后,取出模擬消化管,按清洗程序?qū)x器管道進行洗清。結(jié)束后退出程序,關(guān)閉電源。同時將透析袋中內(nèi)容物用去離子水小心沖洗到已知絕干重的培養(yǎng)皿中,65℃烘干至無水痕后,再105℃烘干至恒重,用全自動氧彈計測定殘渣的總?cè)紵裏嶂怠?/p>

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)單因素完全隨機試驗設(shè)計,用SAS 9.0的MEANS模塊對基本統(tǒng)計量進行分析,GLM模塊對數(shù)據(jù)進行方差分析,以Duncan氏法進行多重比較。結(jié)果以平均值±標準差表示。其中數(shù)據(jù)計算及統(tǒng)計模型如下:

總變異系數(shù)(CVtotal)=

式中:M1為飼料樣品干物質(zhì)重量(g);M2為殘渣干物質(zhì)重量(g);E1為飼料樣品總?cè)紵裏嶂?J);E2為殘渣總?cè)紵裏嶂?J);Y ij為干物質(zhì)消化率或代謝能;為第i個組的均值;為樣本總均值;G為組數(shù),N為樣本總數(shù),N i為第i個組樣本量;μ為總平均數(shù),αi為組間效應,εij為隨機誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 同一套仿生消化系統(tǒng)不同批次間鴨飼料原料干物質(zhì)消化率和代謝能的變異

由表2可知,同一測定批次的10個重復內(nèi),玉米、豆粕、棉籽粕和小麥麩干物質(zhì)消化率的最大絕對偏差分別為1.03%、0.63%、0.67%和0.72%,批內(nèi)變異系數(shù)分別為 0.66%、0.58%、1.18%和 0.78%;代謝能的最大絕對偏差分別為0.30、0.31、0.21和0.21 MJ/kg,批內(nèi)變異系數(shù)分別為 0.89%、0.99%、1.22%和1.25%。不同測定批次間,玉米、豆粕、棉籽粕和小麥麩平均干物質(zhì)消化率的最大絕對偏差分別為0.21%、0.09%、0.35%和 0.38%,批間變異系數(shù)分別為0.20%、0.11%、0.80%和0.63%;平均代謝能的最大絕對偏差分別為0.05、0.09、0.02和0.08MJ/kg,批間變異系數(shù)分別為0.29%、0.49%、0.24%和 0.70%。3個批次的10個重復測定中,玉米、豆粕、棉籽粕和小麥麩干物質(zhì)消化率的總變異系數(shù)分別為0.65%、0.56%、1.37%和0.97%,代謝能的總變異系數(shù)分別為0.89%、1.05%、1.19%和1.38%。從不同測定批次干物質(zhì)消化率和代謝能平均值的多重比較統(tǒng)計結(jié)果看,棉籽粕干物質(zhì)消化率以及小麥麩干物質(zhì)消化率和代謝能存在測定批次間的顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 不同套仿生消化系統(tǒng)間鴨飼料原料干物質(zhì)消化率和代謝能的變異

由表3可知,同一儀器測定的10個重復內(nèi),玉米、豆粕、棉籽粕和小麥麩干物質(zhì)消化率的最大絕對偏差分別為0.98%、0.92%、0.81%和0.86%,儀器內(nèi)變異系數(shù)分別為 0.53%、0.79%、1.24%和0.93%;代謝能的最大絕對偏差分別為0.26、0.24、0.13和 0.26 M J/kg,儀器內(nèi)變異系數(shù)分別為0.69%、0.92%、1.08%和1.32%。不同測定儀器間,玉米、豆粕、棉籽粕和小麥麩平均干物質(zhì)消化率的最大絕對偏差分別為0.12%、0.33%、0.53%和0.21%,儀器間變異系數(shù)分別為 0.11%、0.39%、1.15%和0.36%;平均代謝能的最大絕對偏差分別為 0.06、0.11、0.07 和 0.08 MJ/kg,儀器間變異系數(shù)分別為0.31%、0.67%、0.70%和0.60%。3套儀器的10個重復測定中,玉米、豆粕、棉籽粕和小麥麩干物質(zhì)消化率的總變異系數(shù)分別為0.51%、0.84%、1.64%和0.95%,代謝能的總變異系數(shù)分別為0.73%、1.10%、1.24%和1.39%。從不同測定儀器干物質(zhì)消化率和代謝能平均值的多重比較統(tǒng)計結(jié)果看,豆粕與棉籽粕的干物質(zhì)消化率和代謝能存在測定儀器間的顯著性差異(P＜0.05)。

2.3 仿生消化系統(tǒng)測定不同鴨飼料原料的精密度

通過對每種鴨飼料原料的48～49個干物質(zhì)消化率有效測定數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗,結(jié)果表明,4種飼料原料干物質(zhì)消化率測定值均服從正態(tài)分布(P＞0.05,表4),玉米、豆粕、棉籽粕和小麥麩的干物質(zhì)消化率分別為(76.66±0.48)%、(61.51±0.51)%、(32.69±0.52)%和(43.28±0.45)%。根據(jù)正態(tài)分布95%置信區(qū)間的確定原則,以測定平均值±1.96×標準差為95%置信區(qū)間,從而得出仿生消化系統(tǒng)測定玉米、豆粕、棉籽粕和小麥麩干物質(zhì)消化率的重復間最大絕對偏差分別控制在0.94%、1.00%、1.02%和0.88%以內(nèi),其中85%的觀測數(shù)據(jù)最大絕對偏差均不高于0.75%。

通過對每種鴨飼料原料43～50個代謝能有效測定數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗,結(jié)果表明,4種原料代謝能均服從正態(tài)分布(P＞0.05,表4),玉米、豆粕、棉籽粕和小麥麩的代謝能分別為(14.30±0.09)、(13.24±0.15)、(7.08±0.09)和(8.64±0.12)M J/kg。根據(jù)正態(tài)分布95%置信區(qū)間的確定原則,以測定平均值±1.96×標準差為95%置信區(qū)間,從而得出仿生消化系統(tǒng)測定玉米、豆粕、棉籽粕和小麥麩代謝能的重復間最大絕對偏差分別控制在 0.18、0.29、0.18 和0.24 MJ/kg,其中 85%的觀測數(shù)據(jù)最大絕對偏差均不高于0.22M J/kg。

表4 仿生消化系統(tǒng)測定鴨飼料干物質(zhì)消化率與代謝能的正態(tài)分布檢驗Tab le 4 Normal distribution test of d ry m atter digestibility and metabo lizab le energy of duck feedstuffs determ ined using bionic digestion system

3 討 論

3.1 仿生消化系統(tǒng)測定鴨飼料原料干物質(zhì)消化率與代謝能的重復性

重復性是指在重復性條件下,所獲得的獨立測試/測量結(jié)果間的一致程度[11],它是檢驗一種分析方法能否達到定量分析要求的基本指標。本試驗條件下,模擬消化液的參數(shù)可完全重復,模擬消化過程全自動程控最大限度地降低了人為因素的干擾,從而保證了不同測定批次間試驗條件的重復性。從重復性檢驗的結(jié)果看,4種常用鴨飼料原料干物質(zhì)消化率及代謝能分3個批次測定的批內(nèi)變異系數(shù)、批間變異系數(shù)及總變異系數(shù)都在1.40%以內(nèi),通過3套仿生消化系統(tǒng)測定的儀器內(nèi)變異系數(shù)、儀器間變異系數(shù)及總變異系數(shù)也都在1.64%以內(nèi)。這與Bourdillon等[12]報道的不同實驗室間采用同一方法測定的飼料干物質(zhì)含量、總能值的變異系數(shù)分別為1.27%和1.29%接近,比凱氏定氮法測定的飼料蛋白質(zhì)含量的變異系數(shù)為4.39%低得多,比V aldes等[13]測定的家禽飼料的體外消化能值變異系數(shù)為8.92%和Clunies等[14]測定的飼料的干物質(zhì)消化率的最大變異系數(shù)為6.98%低得多。由此可見,本仿生消化系統(tǒng)測定飼料的干物質(zhì)消化率及代謝能的重復性上可達到類似于飼料干物質(zhì)、總能、粗蛋白質(zhì)分析測試的同等水平。從同一套仿生消化系統(tǒng)不同測定批次及不同套仿生消化系統(tǒng)間測試結(jié)果的變異情況看,批內(nèi)變異系數(shù)與儀器內(nèi)變異系數(shù)都相應地高于批間變異系數(shù)及儀器間的變異系數(shù)。這表明在分析測樣中,同一樣品應設(shè)置多個重復(5個重復)測定以盡量消除批內(nèi)或儀器內(nèi)的測試誤差。從單因素方差分析結(jié)果看,部分樣品(棉籽粕、小麥麩)的干物質(zhì)消化率或代謝能在不同測定批次或測定儀器間存在統(tǒng)計顯著性差異,而從數(shù)值上看,同一樣品不同測定間干物質(zhì)消化率與代謝能的最大偏差僅分別為0.43%和0.12 MJ/kg。這進一步說明處理內(nèi)較低的變異系數(shù)導致試驗處理間相對于處理內(nèi)的平均變異偏高,從而導致方差分析的統(tǒng)計結(jié)果達到顯著水平。這一現(xiàn)象也與Bourdillon等[12]報道的不同實驗室間采用同一方法測定的飼料干物質(zhì)含量、總能值及粗蛋白質(zhì)含量存在顯著差異的結(jié)果類似。這也表明在采用本仿生消化系統(tǒng)比較不同飼料原料干物質(zhì)消化率或代謝能的統(tǒng)計分析中,除了進行常規(guī)的方差分析外,應首先需要考慮不同處理間平均值的絕對差值大于本系統(tǒng)測試的誤差范圍才視為有效顯著性檢驗。

3.2 仿生消化系統(tǒng)測定鴨飼料原料代謝能的精密度與有效觀測數(shù)據(jù)的取舍

精密度是指在規(guī)定條件下,所獲得的獨立測試/測量結(jié)果間的一致程度[11],它用來檢驗一種測試方法能夠達到何種定量水平。本試驗中,通過對每種鴨飼料原料進行43～50個干物質(zhì)消化率及代謝能的重復測定得出,95%重復觀測數(shù)據(jù)中玉米、豆粕、棉籽粕和小麥麩干物質(zhì)消化率的最大絕對偏差分別控制在0.94%、1.00%、1.02%和0.88%以內(nèi),其中85%的觀測數(shù)據(jù)最大絕對偏差均不高于0.75%;代謝能最大絕對偏差分別控制在0.18、0.29、0.18和0.24M J/kg,其中85%的觀測數(shù)據(jù)最大絕對偏差均不高于0.22 MJ/kg。這一結(jié)果比排空強飼法測定鴨全價飼糧重復觀測內(nèi)干物質(zhì)真消化率的最大絕對偏差2.05%～3.82%的精密度稍高,比排空強飼法測定的豆粕、棉籽粕等蛋白質(zhì)飼料原料重復觀測內(nèi)代謝能的最大絕對偏差達到0.8～1.5 M J/kg有很大的提高[10,15],比現(xiàn)有的其他體外評定飼料養(yǎng)分方法也有所提高[16],同時比傳統(tǒng)生物學法測定肉雞飼糧表觀代謝能平均值的實驗室間最大偏差0.67 M J/kg的精密度也稍高[13]。這表明無論是能量飼料還是蛋白質(zhì)飼料,仿生消化系統(tǒng)的測試精密度都可以達到生物學法定量測定飼料代謝能的定量水平。通過對4種飼料原料干物質(zhì)消化率及代謝能與重復測定的標準差進行相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)兩者間不存在顯著相關(guān)性(r＜0.30),這表明本系統(tǒng)所測定的4種常用鴨飼料原料的精密度與原料的化學組成性質(zhì)無關(guān)。根據(jù)上述研究結(jié)果,并結(jié)合仿生消化系統(tǒng)在設(shè)計功能上是一次對每一個待測樣品進行5次重復測定,為了進一步規(guī)范數(shù)據(jù)的取舍原則,建議將測得的5個重復內(nèi)干物質(zhì)消化率與平均消化率的差值在0.75%以上,代謝能在0.22 MJ/kg以上的數(shù)據(jù)剔除。與此同時,建議將該參數(shù)作為仿生消化系統(tǒng)測試精密度,不同樣品間比較的參考參數(shù)之一。

4 結(jié) 論

從本試驗的重復性及精密度看,采用該仿生消化系統(tǒng)測定鴨飼料原料代謝能可以達到較高的定量水平。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:zhangh f6565@vip.sina.com

(編輯 菅景穎)

A Test on Repeatability and Precision for Determ ining Metabolizable Energy of Duck Feedstuffs Using Bionic Digestion System

LIHui1,2ZHAO Feng2JI Feng1ZHANG Hongfu2*

(1.College of Animal Science and Technology,Anhui Agricultural Un iversity,Hefei230036,China;2.Sta te Key
Laboratory of Animal Nutr ition,Institute of Animal Sciences,Chinese Academy of Agricultural Science,Beijing100193,China)

The repeatability and p recision for determ ining the metabo lizab le energy of duck feedstuffs(corn,soybean meal,cottonseed meal and w heat bran)using bionic digestive system were investigated for testing w hether this system can be used for determ ination of nutrient digestibility.The single factor com pletely random ized design w as adopted for the repeatability experiments in the same and am ong the three bionic digestive systems.In each repeatability experiment,3 treatments(am ong 3 batches or 3m achines)with 10 rep licates per feedstuff were used for determ ining thein vitrod rym atter digestibility andm etabolizable energy.The results show ed that the within-batch,betw een-batch and total coefficient of variation of the drym atter digestibility and metabolizable energy of corn,soybeanmeal,cottonseed meal and w heat bran in the sam ebionic digestive system were all less than 1.40%,and the within-equipment,between-equipment and total coefficient of variation among these three bionic digestion systems were all less than 1.64%.Thenormality test and 95%confidence interval of d ry matter digestibility and metabolizable energy in 4 duck feedstu ffs showed that the maximum abso lute bias of repeatedmeasures were controlled in 0.94%,1.00%,1.02%and 0.88%in drym atter digestibility and 0.18,0.29,0.18 and 0.24MJ/kg in metabo lizab le energy of corn,soybean meal,cottonseed meal and w heat bran,respectively.In repeated determ ination,themaximum abso lute bias of 85%observed data of d ry matter digestibility and metabo lizable energy were not higher than 0.75%and 0.22 M J/kg,respectively.According to the repeatability and precision of this experiment,a relatively high quantitative level for the determ ination ofmetabo lizab le energy of duck feedstuffs can be achieved using bionic digestion system.[Chinese Journal of Animal Nutrition,2010,22(6):1709-1716]

duck feedstu ffs;m etabolizable energy;bionic digestion system;repeatability;p recision

S831

A

1006-267X(2010)06-1709-08

10.3969/j.issn.1006-267x.2010.06.035

2010-05-15

科技部創(chuàng)新方法工作專項(2009IM 033100);中央級科研院所基本業(yè)務費專項(2010jc-3-3)

李 輝(1985—),男,河南周口人,碩士研究生,主要從事飼料營養(yǎng)價值評定。E-mail:lihui2669@163.com

*通訊作者:張宏福,研究員,博士生導師,E-mail:zhanghf6565@vip.sina.com