陳雄飛，周寧新

(1遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001;2中國人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院)

苯丙氨酸-X-酪氨酸—天冬氨酸(FXYD)基因家族蛋白是一類小分子的單跨膜蛋白，有離子通道或離子通道調(diào)節(jié)作用，和Na+-K+-ATP酶的結(jié)構(gòu)功能密切相關(guān)。FXYD6蛋白是FXYD家族新成員，近期研究顯示其與精神病易感性、內(nèi)耳聽神經(jīng)平衡功能及腫瘤等有關(guān)。2010年4月，我們對FXYD6功能區(qū)(FXYD6-ex)進(jìn)行了原核表達(dá)及純化，旨進(jìn)一步研究FXYD6蛋白的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①載體和菌種:克隆質(zhì)粒載體PMD18-T Simple、XhoⅠ和ECORⅠ酶切后的表達(dá)質(zhì)粒載體pET28a(中國科學(xué)院生物物理所閻錫蘊(yùn)教授惠贈)、克隆菌株Trans 10感受態(tài)細(xì)胞、表達(dá)菌株大腸桿菌Rossetta。②主要試劑:全長FXYD6cDNA序列，XhoⅠ、ECORⅠ限制性內(nèi)切酶，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，質(zhì)粒抽提試劑盒，His-Tag單克隆抗體，高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，LB培養(yǎng)基。

1.2 FXYD6-ex目的基因擴(kuò)增和純化 采用SignalP 3.0軟件進(jìn)行FXYD6蛋白預(yù)測，前18個氨基酸為信號肽。用全長FXYD6cDNA序列擴(kuò)增除信號肽外的功能區(qū)FXYD6-ex，利用Primer 5.0引物設(shè)計軟件，設(shè)計一對PCR引物，并在每條引物的5＇端引入限制性內(nèi)切酶識別序列。上游引物:5＇-GAATTCAGTGCAGCTGTGAAAAGGAG-3＇，5＇末端含有限制性內(nèi)切酶ECORI的切割位點(diǎn);下游引物:5＇-CTCGAGTCAGTTCTCTGCTTTCTGG-3＇，5＇末端含有限制性內(nèi)切酶XhoI的切割位點(diǎn);引物合成由英駿生物技術(shù)有限公司完成，測序由北京博尚生物技術(shù)有限公司完成。PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min，變性—退火—延伸的反應(yīng)循環(huán)為95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，共36個循環(huán)，72℃延伸10 min，將 PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下觀察，膠回收試劑盒回收目的片段。

1.3 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 將1.2目的回收片段與pMD18-T Simple載體連接，并轉(zhuǎn)入克隆載體大腸桿菌Trans10中進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，以質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒并用Xhol、ECORI雙酶切，瓊脂糖凝膠上樣電泳，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。將純化的酶切產(chǎn)物與已酶切的pET-28a(+)載體連接，轉(zhuǎn)入表達(dá)載體Rossetta中，兩次重組質(zhì)粒均經(jīng)PCR鑒定及測序。

1.4 FXYD6重組蛋白表達(dá)及檢測 Rossetta菌生長至對數(shù)期后用1 mmol/L異丙基-β-8-D硫代半乳糖(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，同時設(shè)未加ITPG者為對照組，4 h后收集兩組培養(yǎng)液各1 ml，離心收集菌體沉淀，用 100 μl 1×loading buffer重懸，100 ℃煮10 min，離心后吸取上清液置-20℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲?5%的十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺(SDSPAGE)凝膠，15 μl/孔上樣，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察表達(dá)蛋白條帶。

1.5 FXYD6重組蛋白純化及檢測 ①純化:離心收集IPTG誘導(dǎo)后的陽性克隆菌體，用含25 mM Tris、150 mM NaCl的裂解液重懸，冰上超聲破碎至菌液清亮。15000 rpm 4℃離心20 min后取沉淀，用 25 mM Tris、150 mM NaCl、0.1%Triton X-100 溶液重懸，同樣條件離心后取上清，將含有His標(biāo)簽融合蛋白的裂解上清流經(jīng)Ni-NTA金屬螯合柱進(jìn)行層析純化，用50 mM咪唑洗脫液競爭結(jié)合Ni2+位點(diǎn)，洗脫目的蛋白，超濾將目的蛋白換至PBS緩沖液并進(jìn)行濃縮。②檢測:利用Western blot法。樣品經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)到NV膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入小鼠源性 His Tag單抗(一抗)，37℃輕搖1.5 h，PBS洗膜3次、每次 5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(二抗)，37℃輕搖1 h后同上洗滌，用高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒顯色，暗室X線壓片、曝光、顯影后觀察。

2 結(jié)果

2.1 FXYD6-ex目的片段獲得及重組質(zhì)粒鑒定PCR產(chǎn)物電泳后在DNA marker 200～300 bp出現(xiàn)單一條帶產(chǎn)物，片段大小與預(yù)期產(chǎn)物大小相符;連接后的pMD18-T Simple Vector和PET-28a經(jīng)酶切、電泳后亦出現(xiàn)單一目的條帶，測序鑒定證實(shí)序列完全正確，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 FXYD6重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與檢測 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h后菌體蛋白相對分子質(zhì)量約17 kD，較對照組出現(xiàn)明顯誘導(dǎo)條帶。

2.3 FXYD6重組蛋白純化及檢測 目的蛋白經(jīng)Ni柱分離純化、SDS-PAGE電泳后所得目的蛋白純度達(dá)90%;Western blot檢測顯示，SDS-PAGE上出現(xiàn)的明顯誘導(dǎo)條帶及純化所得蛋白可被HisTag抗體識別，而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的對照組對應(yīng)位置未出現(xiàn)條帶。

3 討論

FXYD6蛋白全稱為包含F(xiàn)XYD結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子6，屬小分子Ⅰ型膜蛋白。FXYD6基因mRNA首先由Fuminori等于2001年自大鼠腦和腎臟中克隆出，此后的研究主要集中在FXYD6與神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)系方面(如神經(jīng)元的發(fā)育和精神疾病等)。Kadowaki等研究結(jié)果表明，大鼠出生后3周時FXYD6的表達(dá)在大腦最高，并一直延續(xù)至成年。提示FXYD6對于大鼠大腦神經(jīng)元的興奮性有重要作用。有關(guān)FXYD6與精神分裂癥易感性相關(guān)性方面的研究，美國、日本和中國研究者得出的結(jié)論不一致［1～3］。近期研究顯示，F(xiàn)XYD6 蛋白對 Na+-K+-ATP酶的影響有助于產(chǎn)生和維持內(nèi)淋巴的內(nèi)耳蝸勢能和離子成分穩(wěn)定，有助于保持內(nèi)耳聽神經(jīng)的平衡功能［4，5］。目前，有關(guān) FXYD6與腫瘤關(guān)系的研究鮮見報道，但FXYD家族突變或缺失很可能引起嚴(yán)重病理變化。已有研究報道FXYD3在人乳腺癌中高表達(dá)，有望成為人乳腺癌的標(biāo)志性分子［6］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)FXYD6在正常膽管或胰腺組織低表達(dá)，在膽管癌或胰腺癌組織中高表達(dá)并隨膽管癌或胰腺癌分化程度降低而增高［7，8］;另外，我們用反義核酸技術(shù)發(fā)現(xiàn)FXYD6蛋白可促進(jìn)FXYD6高表達(dá)的膽管癌細(xì)胞系QBC939和胰腺癌細(xì)胞系SW1990細(xì)胞增殖。我們近期研究表明，在正常肝組織、肝硬化組織和肝癌組織中FXYD6蛋白陽性細(xì)胞比率和FXYD6蛋白表達(dá)強(qiáng)度依次顯著性遞增。出現(xiàn)上述研究結(jié)果的可能原因?yàn)镕XYD6基因定位于11號染色體長臂(11q23.3)，而11號染色體長臂是包括膽管癌、胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞最常見的異常區(qū)?；诖?，制備FXYD6不同表位的單克隆抗體用以監(jiān)測其存在和變化非常重要。本研究中，我們采用SignalP 3.0軟件分析FXYD6蛋白作為膜蛋白的功能區(qū)分布，結(jié)果成功進(jìn)行對FXYD6-ex表達(dá)載體的構(gòu)建、可溶性表達(dá)及純化。

綜上所述，本研究成功對FXYD6-ex進(jìn)行原核表達(dá)及純化;此為后續(xù)制備該蛋白抗體庫及進(jìn)一步研究其具體功能奠定了良好基礎(chǔ)。

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