馬志科,昝林森

(西北農(nóng)林科技大學動物科技學院,陜西楊陵 712100)

血紅素的應(yīng)用與提取方法

馬志科,昝林森

(西北農(nóng)林科技大學動物科技學院,陜西楊陵 712100)

血紅素是血紅蛋白、肌紅蛋白等的輔基,具有重要的生理功能,在醫(yī)藥、食品等方面得到廣泛應(yīng)用。論文介紹了血紅素的冰醋酸提取法,酸性丙酮提取法、羧甲基纖維素提取法、酶解提取法、血粉提取法、有機酸和有機堿混合提取法。

血紅素;制備工藝;應(yīng)用

血紅素(heme)是血紅蛋白組成不可缺少的組分,它是由原卟啉IX與Fe2+結(jié)合而成,與珠蛋白結(jié)合成血紅蛋白。它在體內(nèi)主要的生理功能是載氧,除在血紅蛋白、肌紅蛋白中擔負O2和CO2運輸外,還是細胞色素 P450和過氧化物酶的輔基。自1885年俄國學者用冰醋酸和氯化鈉與牛血共熱提取血紅素結(jié)晶以來,人們對血紅素的研究不斷探索,從血紅素的結(jié)構(gòu)到理化性質(zhì),從生理功能到制備工藝等進行了深入研究[1]。血紅素是含鐵的卟啉化合物,鐵原子位于卟啉環(huán)的中央,具有共軛結(jié)構(gòu),性質(zhì)穩(wěn)定。不溶于水、稀酸、氯仿、醚及丙酮,而溶于氫氧化鈉溶液或氨水及熱醇中。血紅素的分子簡式為C34H33FeN4O4,分子質(zhì)量為633.49 u。血紅素為片狀或針狀的紫色結(jié)晶,因純化溶劑不同,還會有其他顏色。近些年來,血紅素在醫(yī)藥、食品等方面的應(yīng)用研究有較快的進展,同時也促進了血紅素制備工藝的不斷發(fā)展與完善。本文對近些年血紅素的應(yīng)用及提取方法做一介紹。

1 血紅素的應(yīng)用

1.1 作為補鐵藥物和食品添加劑

法國人最早嘗試用硫酸亞鐵治療缺鐵性貧血,但其吸收率只有1%～3%,而且嚴重刺激腸胃,引起腸胃不舒,有明顯的副作用。血紅素作為有機鐵,能被人體很好的吸收,無副作用等優(yōu)點。臨床研究證明[2-4],血紅素是很好的補鐵藥物,對缺鐵性貧血有明顯的治療作用。在食品工業(yè)上,血紅素可用于食品添加劑[5],若將血紅素修飾后制成色素,可作為食用色素等[6-7]。

1.2 溶解瘧原蟲

血紅素具有溶解瘧原蟲的作用。Banyal H S研究發(fā)現(xiàn),從鼠紅細胞中分離的瘧原蟲能被氯化高鐵血紅素或氯喹-血紅素復合物溶解。試驗研究表明,單一的氯喹不能引起瘧原蟲的膨脹或溶解,而氯喹與血紅素形成復合物后能溶解瘧原蟲,伴隨溶脹,谷氨酸脫氫酶從瘧原蟲中釋放,顯示了胞內(nèi)容物的喪失。血紅素濃度越高,酶的釋放也越多[8]。

1.3 血紅素應(yīng)用生物化學分析研究

血紅素還廣泛應(yīng)用生物化學分析研究,李任強[9]用墮性載體sepharose 4B、微晶纖維素、人造沸石和瓊脂糖分別直接固定氯化血紅素,裝柱后應(yīng)用于痕量過氧化氫酶的檢測,同時利用葡萄糖氧化偶聯(lián)模擬過氧化氫酶法用于葡萄糖檢測。結(jié)果表明,以上幾種載體經(jīng)活化后均能很好的固定血紅素,固定化的血紅素裝柱后保持穩(wěn)定的催化過氧化氫酶的活性,檢測靈敏度高。靈敏度大小為:Sepharose 4B＞瓊脂糖＞微晶纖維素＞人造沸石。朱立等[10]采用血管環(huán)灌流裝置,試結(jié)果表明,SD大鼠腹腔注射高鐵血紅素后,主動脈HD-1活性和血中CO含量增高,同時,H2O2引起的血管收縮功能下降的現(xiàn)象明顯改善。

1.4 診治癌癥

血紅素經(jīng)除鐵處理后,對其側(cè)鏈進行修飾可以得到一系列卟啉類藥物——光卟啉及原卟啉等衍生物。這些衍生物對惡性腫瘤細胞具有特殊親和力,尤其對紫色激光反應(yīng)敏感,在紅色激光作用下,血卟啉產(chǎn)生自由基而殺死癌細胞[11]。因此,血紅素衍生物具有診斷和治療的雙重作用,顯示了在腫瘤診治中的重要性。

2 血紅素提取方法

2.1 冰醋酸提取法

俄國學者Schalteieff(1885)最早在實驗室內(nèi)用冰醋酸、氯化鈉與牛血共熱,提取分離得到血紅素結(jié)晶。此法開創(chuàng)了血紅素制備的先河,在此基礎(chǔ)上學者進行了一些改進,目前仍在實驗室和工業(yè)化生產(chǎn)中使用。其原理是冰醋酸能溶解大部分血紅蛋白,而在酸性條件下分解為珠蛋白和血紅素,因血紅素在冰醋酸環(huán)境中不溶解而被分離。鐘耀廣[12]對冰醋酸提取血紅素的工藝進行了改進,對冰醋酸加入量,反應(yīng)條件,氯化鈉加入量進行了系統(tǒng)研究。在配有回流冷凝管的三角燒瓶中先加入冰醋酸和氯化鈉,加熱使氯化鈉溶解,為避免血液碰到燒瓶的壁上,再以細流加入抗凝豬血球。在105℃下保持40 min,讓反應(yīng)液冷卻到室溫后,進行分離處理,得到粗血紅素。

2.2 酸性丙酮提取法

Lindroos(1975)提出使用酸性丙酮分離提取血紅素的方法,根據(jù)血紅素與珠蛋白的結(jié)合在pH＜3時最為疏松,極易被有機溶劑提取出來的原理。丙酮使蛋白凝固沉淀,同時血紅素呈溶液狀態(tài)進入丙酮相。用抽濾的方法使固液兩相分離,對液相進一步處理得到血紅素。楊淑琴[13]利用此法從豬血中分離血紅素。劉任民等[14-15]先用超聲波對紅細胞溶血,再用酸性丙酮提取血紅素。楊紅等[16]對鴕鳥血經(jīng)酸性丙酮,提取后,加10 g/L的NaAc攪拌均勻,靜止后血紅素呈無定形沉淀,抽濾,干燥即得血紅素成品。還可用鞣酸沉淀,加50 g/L的鞣酸攪拌,靜置過夜,血紅素呈結(jié)晶狀析出,抽濾水洗結(jié)晶,干燥得血紅素。莊紅等[17]對血紅素純化及亞鐵保護方面作了進一步研究。

2.3 羧甲基纖維素(CMC)提取法

1983年芬蘭科學家使用羧甲基纖維素(CMC)提取血紅素,羧甲基纖維素是一種半合成的高分子陽離子型纖維素,其功能集團為羧甲基。由于它有極大的表面積和多孔結(jié)構(gòu),故易于吸附血紅素而與血紅蛋白分離。該法用鹽酸調(diào)節(jié)pH使血紅蛋白溶液達到pH3.0,再加入適量濃度的CMC溶液,由于纖維素的特殊構(gòu)型,其有效交換集團空間較大,進行充分攪拌,使其較大容量吸附血紅素。用離心機分離,達到與CMC結(jié)合的血紅素分離出來的目的。CMC血紅素,由于CMC已混入血紅素中,純度相對較低,它可直接作為一種安全有效的補鐵添加劑。王超英[18]改進了羧甲基纖維素提取血紅素的方法,結(jié)果表明,只要選擇適當?shù)腃MC用量,與之相適應(yīng)的pH條件,就可得到較高的CMC血紅素。

2.4 酶解提取法

用蛋白酶水解血紅蛋白制取血紅素,避免了使用有機溶劑,被認為是目前最環(huán)保的一種提取血紅素的方法。該法是利用蛋白酶先將血紅蛋白水解成水溶性的氨基酸和多肽,再將不溶于水的血紅素離心分離。張亞娟等[19]以豬血為原料,選用多種蛋白酶水解血紅蛋白制取血紅素,選用資料[20]提供方法測定水解度。結(jié)果表明,堿性蛋白酶的水解能力最強,其次是中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶,風味酶的水解能力最弱。選用堿性蛋白酶Alcalase,篩選出最佳工藝參數(shù)為最適pH為7.5,溫度為60℃,底物濃度為40 mL/L,加酶量為40 mL/L,離心分離后,得到血紅素粗品。楊錫洪等[21]采用酶法水解血紅蛋白制備亞鐵血紅素肽,血紅蛋白經(jīng)蛋白酶處理,去掉一些不需要的肽鏈、保留維持血紅素鐵穩(wěn)定的肽鏈,分離后得到血紅素鐵的復合體,可直接添加到食品中作為補鐵劑,是一種較好的利用途徑。

2.5 血粉提取法

采用低溫干燥的血粉為原料,用醋酸配制酸性丙酮作為提取溶劑,充分攪拌提取后,過濾去沉淀,再將沉淀重復提取,濾液真空濃縮,即析出血紅素。周淡宜等[22]采用該法將沉淀的血紅素,用28 g/L氨水溶液溶解后,用酸調(diào)pH至中性,沉淀析出后用水洗3次,干燥后得到純度較高血紅素。該法的優(yōu)點為節(jié)約試劑,克服了新鮮血液的運輸、貯存困難。還能進一步回收有機試劑丙酮,產(chǎn)品成本降低,為規(guī)模化生產(chǎn)血紅素提供了一種新的生產(chǎn)工藝。

2.6 有機酸有機堿混合溶液提取法

姜傳福[23]提出了采用有機酸HA-有機堿BOH的混合溶液作為溶劑,對豬血中血紅素提取的新方法?；旌先軇┛砂l(fā)揮各自優(yōu)勢,相輔相成,增強提取效益。以強堿調(diào)節(jié)pH為5～6時,血紅素即可析出,血紅素產(chǎn)率為5 g/L血液。該法與其他方法比較,工藝流程簡單、無污染、成本低,經(jīng)濟效益明顯。是一種既經(jīng)濟又環(huán)保的新方法,拓展了血紅素制取的新工藝,為血資源利用提供了一條新的途經(jīng)。

3 血紅素提取方法評價及發(fā)展趨勢

提取血紅素的方法除以上介紹,還有表面活性劑法,鹽酸萘乙二胺法等,這些方法都有各自優(yōu)缺點。冰醋酸法,收率低,冰醋酸試劑回收困難,成本較高,但提取方法簡單實用。酸性丙酮法,試劑成本較高,但工藝技術(shù)趨于成熟,可得到純度較高的血紅素。如用鞣酸制備血紅素純度可達90%以上,還有紅紫色晶體,但收率低,且鞣酸價格較高,不能回收,不適應(yīng)規(guī)?；a(chǎn)。而CMC法、酶法只能得到粗品,但工藝流程簡單,在整個制備工藝中不使用有毒試劑,成本低,可作為補鐵劑或食品添加劑直接應(yīng)用。在實際制備時選用哪種方法,要由血紅素的用途而定。今后發(fā)展趨勢是血紅素聯(lián)產(chǎn)其它相應(yīng)產(chǎn)品,對動物血液的綜合開發(fā)利用。提取血紅素用血細胞為材料,血漿可以作水解蛋白之用,還可以加工制備成血漿蛋白粉[24]。提取血紅素后剩余部分變性蛋白可用作飼料添加劑[25],還可以進一步水解得以氨基酸、多肽和蛋白胨等。物盡所用,降低生產(chǎn)成本,減少環(huán)境污染。

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Application and Preparation Techniques of Heme

MA Zhi-ke,ZAN Lin-sen

(College of Animal Science and Technology,Northwest A&F University,Y angling,Shaannxi,712100,China)

heme,the prosthetic group of the hemoglobin and myoglobin,has been used widely in medical and food science ete.The preparation techniques of heme were introduced and reviewed in this paper.Different extracting methods were currently used:acetit acit method,acid acetone method,carboxymethyl cellulose method,enzymatic hydrolyis method,blood pouder method,organic acid and organic base method.From what has been introduced above,it is the devlpment tends that heme has been combined production and animal blood has been devlpoed synthetically.

heme;preparation tecnidque;application

Q513

A

1007-5038(2010)09-0112-03

2010-07-01

國家自然科學基金項目(30871788)

馬志科(1960-),男,陜西武功人,碩士,高級實驗師,主要從事教學實驗及科研工作。