梁曉艷,李玉林,李兆學(xué),王繼美,賈麗鋒,周賀娟,王云龍,*

(1.鄭州大學(xué),河南鄭州 450002;2.河南省生物工程技術(shù)研究中心,河南鄭州 450002;3.河南工業(yè)大學(xué),河南鄭州 450002)

豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的原核表達(dá)及其免疫原性檢測(cè)*

梁曉艷1,李玉林2,李兆學(xué)3,王繼美2,賈麗鋒1,周賀娟1,王云龍1,2*

(1.鄭州大學(xué),河南鄭州 450002;2.河南省生物工程技術(shù)研究中心,河南鄭州 450002;3.河南工業(yè)大學(xué),河南鄭州 450002)

以病豬脾臟組織為材料,提取總RNA,通過(guò)RT-PCR得到579 bp的豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)/ORF2片段,與原核表達(dá)載體pET32a重組,通過(guò)菌落PCR鑒定、雙酶切鑒定及測(cè)序鑒定后,證實(shí)重組質(zhì)粒pET32a/ORF2構(gòu)建成功,將其轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌Balgold,通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),利用Ni-NTA親和層析純化目的產(chǎn)物,Western blot驗(yàn)證其免疫原性,重組蛋白免疫Balb/c小鼠,檢測(cè)小鼠體內(nèi)中和抗體滴度。獲得的重組蛋白包涵體的形式出現(xiàn),表達(dá)量占菌體總蛋白的30%,變性純化后純度達(dá)90%以上,Western blot證實(shí)重組蛋白能與PCV-2陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng),免疫Balb/c小鼠45 d后中和抗體滴度達(dá)到1∶22。

豬圓環(huán)病毒;ORF2;原核表達(dá);免疫原性

*通訊作者

豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)是危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要病原,可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)[1]。除此之外,PCV-2還與豬呼吸道綜合癥(PRDC)、母豬繁殖障礙、豬皮炎和腎病綜合征(PDNS),肉芽腫性腸炎、滲出性表皮炎及肝炎等疾病有關(guān)[2-6],因此PCV-2感染給養(yǎng)豬業(yè)造成的危害嚴(yán)重。

PCV-2為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員,是一種無(wú)囊膜、20面體對(duì)稱、共價(jià)閉合、環(huán)狀單股DNA病毒。病毒粒子直徑平均為17 nm,基因全長(zhǎng)1 767 bp或1 768 bp,有11個(gè)閱讀框(ORF),其中ORF1和ORF2是最主要的閱讀框[7]。ORF1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白,而ORF2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,即衣殼蛋白,與病毒的抗原性有關(guān)[8]。PCV-2/ORF2蛋白的N端1個(gè)～41個(gè)氨基酸區(qū)域?yàn)榫彼岣缓瑓^(qū),具有明顯的核定位序列的典型特征[10]。

本文通過(guò)RT-PCR方法,截去豬圓環(huán)病毒2型國(guó)內(nèi)分離株ORF2 N端123個(gè)堿基的核定位信號(hào)序列,插入到pET32a載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-PCV-2/ORF2,在大腸埃希菌中表達(dá)、純化,復(fù)性后獲得有活性的目的蛋白,將其免疫小鼠能在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體,為制備豬圓環(huán)病毒基因工程亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 河南省鄭州市某發(fā)病豬場(chǎng)病豬脾臟組織。

1.1.2 菌株及載體 克隆菌 TG1、表達(dá)載體pET32a及表達(dá)菌Balgold為由河南生物工程技術(shù)研究中心惠贈(zèng)。

1.1.3 試劑 總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、DNA回收試劑盒、抗PCV-2陽(yáng)性豬多抗血清、BJ-HN株病毒液由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供。TaqDNA聚合酶,限制性內(nèi)切酶、T 4DNA連接酶為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。羊抗豬酶標(biāo)二抗為Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.4 引物 根據(jù)GenBank上公布的序列號(hào)(GQ449672.1)設(shè)計(jì)一對(duì)引物,由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成:上游引物:5′-ATAGGATCCATGTAAAGGTCGTCAAAC-3′(下劃線部分為BamHⅠ 酶 切 位 點(diǎn));下 游 引 物:5′-TAAAGCT TATGACGTATCCAAGGAGGC-3′(下 劃 線 部 分 為HindⅢ酶切位點(diǎn))。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及RT-PCR 從液氮罐中取出病豬脾臟組織約200 mg,按照總RNA提取試劑盒操作。分別取1.5 μg總 RNA,按 RT-PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)參數(shù)為:94℃5 min;94℃1 min,58℃1 min,72℃1 min,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃5 min。按照DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.2.2 pET32a/ORF2表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ分別酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET32a,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后回收,T4 DNA連接酶于16℃連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化超級(jí)感受態(tài)E.coilBalgold,涂布LB固體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50 mg/L),37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定后,選擇陽(yáng)性菌落培養(yǎng)16 h,堿裂解法提取質(zhì)粒,經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,鑒定正確的質(zhì)粒由上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.3 PCV-2/ORF2基因在E.coil中的誘導(dǎo)表達(dá)

取30 μL菌液于 3支3 mL LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50 mg/L)中在37℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)至OD600約為 0.6～0.7時(shí),分別加入 IPTG至其終濃度為0.1 mmol/L,分別于 37℃(4 h),30℃(8 h)、25℃(12 h)振蕩培養(yǎng),誘導(dǎo)結(jié)束后立即冰浴10 min,收集菌體,超聲波破菌后取上清和沉淀分別進(jìn)行100 g/L SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot檢測(cè) 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分離后,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜(NC膜),50 g/L脫脂奶粉封閉2 h,0.01 mol/L PBST洗膜,加入1∶2 000倍稀釋的PCV-2陽(yáng)性豬多抗血清,4℃孵育12 h以上,0.01 mol/L PBST洗膜5次,每次5 min,加入用0.01 mol/L PBST 1∶1 500倍稀釋的酶標(biāo)二抗,室溫孵育30 min,0.01 mol/L PBST洗膜5次,每次5 min,DAB溶液顯色。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的純化及復(fù)性 取陽(yáng)性菌株大量發(fā)酵,超聲波破菌,10 000 r/min,離心 10 min,棄上清,包涵體用T riton X-100洗滌2次,8 mol/L尿素溶解。鎳金屬親和層析純化目的蛋白,并進(jìn)行SDSPAGE電泳,凝膠掃描儀檢測(cè)其純度。收集的蛋白質(zhì)溶液按參考文獻(xiàn)[11]的方法復(fù)性。

1.2.6 血清中和抗體測(cè)定 將復(fù)性后的蛋白溶液腹腔注射Balb/c小鼠,免疫后分不同時(shí)間(7、14、21、28、35、45、52 d)收集 小鼠血 清,56 ℃溫浴30 min,1∶2～1∶64倍比稀釋后,與 PCV-2 BJ-HN株病毒液(含2 000 TCID50/mL)混合,接種PK-15細(xì)胞,加入D-氨基葡萄糖,洗滌后加入維持液,37℃培養(yǎng)48 h,棄細(xì)胞上清,用預(yù)冷的無(wú)水乙醇4℃固定1 h,37℃作用30 min,每孔加入 1∶20稀釋的PCV-2陽(yáng)性豬多抗血清和 1∶100稀釋的 FITC,37℃作用1 h,熒光顯微鏡下觀察,以血清最高稀釋度的倒數(shù)作為中和抗體滴度。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

以病豬脾臟組織為材料,經(jīng) PCR擴(kuò)增獲得了579 bp的PCV-2/ORF2基因片段(圖1)。

圖1 PCV-2/ORF2片段 PCR結(jié)果Fig.1 PCR identification of PCV-2/ORF2 fragment

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

挑取單菌落,菌落PCR鑒定后培養(yǎng)陽(yáng)性菌落(圖2),提取質(zhì)粒酶切鑒定,結(jié)果顯示切出約579 bp的片段,與理論值相符(圖3)。

2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

Balgold/pET32a/ORF2在不同條件下誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,可見一條明顯的蛋白條帶,其相對(duì)分子質(zhì)量約37 ku,與預(yù)期值相符(圖4)?？捡R斯亮藍(lán)染色后經(jīng)掃描儀掃描,目的蛋白占菌體總蛋白量的30%。

2.4 Western blot檢測(cè)結(jié)果

用PCV-2陽(yáng)性豬多抗血清檢測(cè)重組蛋白的免疫原性,在硝酸纖維素膜上出現(xiàn)單一的條帶(圖5)。

2.5 目的蛋白的純化

分子質(zhì)量約21 ku的PCV-2/ORF2目的蛋白與His-tag、S-Tag和 Trx-tag標(biāo)簽融合表達(dá),重組蛋白分子質(zhì)量為37 ku左右,與預(yù)期相符,包涵體經(jīng)8 mol/L尿素溶解、鎳離子親合層析純化后進(jìn)行SDSPAGE分析(圖6)。凝膠掃描顯示純度達(dá)90%以上。

2.6 中和抗體的檢測(cè)

血清與病毒作用后接種細(xì)胞,免疫熒光(IFA)法檢測(cè)中和抗體的滴度。首次免疫后14 d小鼠中和抗體滴度為1∶7,45 d免疫組的中和抗體滴度為1∶22。空白對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)中和抗體(圖7)。

圖2 pET32a/ORF2的菌落PCR鑒定Fig.2 PCR Identification of pET32a/ORF2

圖3 pET32a/ORF2的酶切鑒定Fig.3 Identification of pET 32a/ORF2 by restriction enzyme digestion

圖4 SDS-PAGE分析Balgold/pET32a/ORF2在不同條件下的表達(dá)Fig.4 Expression of Balgold/pET32a/ORF2 under different conditions analyzed by SDS-PAGE

圖5 表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析Fig.5 A naly sis of ex pressed products by Western blot

圖6 SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物的純化結(jié)果Fig.6 Purification of expressed products analyzed by SDS-PAGE

圖7 小鼠免疫后中和抗體產(chǎn)生結(jié)果Fig.7 Analysis of neutralization antibody of sera from immunized mice

3 討論

將菌液Balgold/pET32a/ORF2送上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與GenBank上公布的序列(登錄號(hào)GQ449672.1)進(jìn)行比對(duì),結(jié)果有三處發(fā)生突變(174A→G)、200(A→G)、405(A→T)。這種差異可能有三種原因造成:病毒株之間的差異;PCR過(guò)程中受Taq酶的保真性所限,出現(xiàn)錯(cuò)配;在轉(zhuǎn)化宿主菌后,培養(yǎng)過(guò)程中Eoli.發(fā)生突變。經(jīng)DNAssist軟件分析,表達(dá)的蛋白質(zhì)有兩個(gè)氨基酸不相同59(Lys→Glu)和 67(Tyr→Cys),但并不影響蛋白的正確折疊及抗原活性。

原核載體pET32a編碼了N端6個(gè)連續(xù)的His-Tag前導(dǎo)肽作為親和臂,使所得的重組蛋白能通過(guò)金屬離子(Ni2+)配體親和層析快速純化。pET32a中的Trx-Tag融合標(biāo)簽是高度可溶的多肽,可以增強(qiáng)一些蛋白的可溶性。

豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)是斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的病原。該病1991年在加拿大首次報(bào)道,主要感染5周齡～12周齡仔豬,發(fā)病率為20%～60%,致死率達(dá)100%[12]。該病目前尚無(wú)有效的疫苗和藥物進(jìn)行防治。宋益等[13]構(gòu)建了嵌合型豬圓環(huán)病毒1型～2型感染性DNA克隆,將其接種Balb/c小鼠,結(jié)果顯示接種后42 d,幾乎全部接種小鼠的血清均呈陽(yáng)性,證明該嵌合病毒能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。但外源DNA引入宿主細(xì)胞后,有導(dǎo)致宿主細(xì)胞發(fā)生惡變的可能,核酸疫苗的諸多安全性問(wèn)題得進(jìn)行深入研究。

林彥星等[14]對(duì)豬圓環(huán)病毒2型ORF2截短基因的原核表達(dá),獲得的重組PCV-2 Cap蛋白能被陽(yáng)性血清識(shí)別,與本文試驗(yàn)結(jié)果相同。Nawagitgul P等[15]將ORF2基因克隆到桿狀病毒表達(dá)載體,在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)了ORF2主要結(jié)構(gòu)蛋白,并在電子顯微鏡下觀察到重組的ORF2蛋白自身裝配成衣殼粒子。

本文通過(guò)基因工程方法構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a/ORF2,經(jīng)純化獲得PCV-2/ORF2融合蛋白,對(duì)血清中和抗體檢測(cè)表明,在45 d時(shí)小鼠中和抗體達(dá)到最高,為下一步開發(fā)亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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Prokaryotic Expression and Purification of PCV-2 ORF2 Gene and Its Immunogenicity Detection

LIANG Xiao-yan1,LI Yu-lin2,LI Zhao-xue3,WANG Ji-mei2,JIA Li-feng1,ZHOU He-juan1,WANG Yun-long1,2

(1.ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan,450002,China;
2.Henan Biotechnology Research Center,Zhengzhou,Henan,450002,China;
3.Henan University of Technology,Zhengzhou,Henan,450002,China)

Pigs spleen was used for the extraction of total RNA,and the 579 bp fragment of PCV-2/ORF2 cDNA was amplified through RT-PCR method.T he fragment was cloned into prokaryotic expression vector pET32a and transformed into Balgold.After the recombinant plasmid pET32a/ORF2 was confirmed by PCR,restriction enzyme digestion analysis and DNA sequencing,it was transduced by IPTG,the recombinant protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography and identified by Western blot,then it was used to immunize Balb/c mice.The results demonstrated that target protein could be expressed in the form of inclusion bodies,it was made up 30%of the total bacterial protein.The purity is above 90%.The protein can be recognized by monoclonal antibodie of PCV-2,the titer of neutralizing antibody is about 1∶22 after immunization 45 d in mice.

PCV;ORF2;prokaryotic expression;immunogenicity

S852.659.2;S858.28

A

1007-5038(2010)09-0063-05*

2010-03-11

梁曉艷(1983-),女,河南洛陽(yáng)人,碩士研究生,主要從事分子生物學(xué)研究。