廖海艷,周衛(wèi)國(guó),王方劍

(1.湖南省第一師范學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410205;2.湖南省永州零陵區(qū)畜牧水產(chǎn)局動(dòng)物防疫監(jiān)督站,湖南永州 425006)

新生小鼠卵巢組織玻璃化冷凍保存與異體異位移植研究

廖海艷1,周衛(wèi)國(guó)2,王方劍1

(1.湖南省第一師范學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410205;2.湖南省永州零陵區(qū)畜牧水產(chǎn)局動(dòng)物防疫監(jiān)督站,湖南永州 425006)

開展小鼠新生胎兒卵巢組織冷凍保存與移植研究,為建立家畜卵巢組織冷凍保存與移植技術(shù)奠定基礎(chǔ)。采用微滴法玻璃化凍存方法處理卵巢,卵巢復(fù)蘇后移植到昆明系雄性小鼠受體腎囊下,19只雄性受體鼠接受了卵巢移植,每側(cè)腎囊移植2枚,卵巢共移植1日齡小鼠卵巢38個(gè)。飼喂28 d有效回收移植卵巢的受體鼠為17只,受體總有效率分別為89.4%;有效回收移植卵巢30個(gè),卵巢總回收率為78.9%。結(jié)果表明,小鼠早期卵巢經(jīng)過冷凍、解凍并異體異位移植后,其原始卵泡能夠重新啟動(dòng)生長(zhǎng)發(fā)育。

小鼠;玻璃化冷凍保存;卵巢移植

卵巢移植起源于19世紀(jì)末期,最初用于治療絕經(jīng)期婦女和雙側(cè)卵巢切除而產(chǎn)生的不良反應(yīng)。到1935年,由于自體移植效果不理想,而異體移植效果更差,使得這一技術(shù)被長(zhǎng)期擱置。在近10年中,經(jīng)過不斷的摸索,卵巢冷凍保存后進(jìn)行移植在不同的動(dòng)物都取得一定的成果[1]。如用從狨和小鼠卵巢組織移植到雌性受體中獲得的卵母細(xì)胞已經(jīng)完成了受精及胚胎分割。本研究將利用玻璃化冷凍方法開展小鼠新生胎兒卵巢組織冷凍保存與移植研究,為建立家畜卵巢組織冷凍保存與移植技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠(KM Mice)購(gòu)自湖南中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,自繁1日齡(出生當(dāng)天為第1天)雌鼠作為卵巢供體,7周齡～12周齡雄鼠作為卵巢移植受體。試驗(yàn)小鼠在自然光照、22℃～25℃環(huán)境溫度條件下飼養(yǎng),自由飲食、采食。

1.1.2 主要試劑

Leibovitz 15(L-15)培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司;新生牛血清(NBS)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物科技有限公司;乙二醇(EG)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自 Amresco公司;蔗糖(sucrose)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物科技有限公司;乙酰胺(acetamide)購(gòu)自上?？笊锛夹g(shù)有限公司;注射用青霉素鈉(benzylpenicillin sodium for injection)購(gòu)自哈藥集團(tuán)制藥總廠;注射用硫酸鏈霉素(srteptomycin sulfate for injection)購(gòu)自大連美羅大藥廠;基礎(chǔ)液(L-15*液)在湖南農(nóng)大動(dòng)物醫(yī)學(xué)院的臨床分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室自行配制(LeibovitzL-15+100 mL/L NBS+100IU/mL青霉素鈉+100 IU/mL硫酸鏈霉素)。

1.1.3 玻璃化冷凍液和解凍液(pH7.2～7.4)

玻璃化冷凍液和解凍液按下列配方配制,pH為7.2～7.4。

預(yù)平衡液:1 mol/L二甲基亞砜+L-15*;平衡液(E1):200 mL/L乙二醇+0.5 mL/L蔗糖+L-15*;冷凍液(E2):400 mL/L乙二醇+0.5 mL/L蔗糖+L-15*解凍液1(E3):0.5 mol/L蔗糖+L-15*;解凍液2(E4):0.25 mol/L蔗糖+L-15*;解凍液3(E5):0.125 mol/L蔗糖+L-15*。

1.2 方法

1.2.1 供體卵巢采集 斷頸處死1日齡供體雌鼠,體表用750 mL/L酒精消毒。在潔凈工作臺(tái)中體視顯微鏡下摘取卵巢,放入裝有預(yù)平衡液培養(yǎng)皿中,去掉卵巢周圍的包膜,顯微照相。

1.2.2 卵巢組織的玻璃化冷凍保存 先將沒有封口凍存管固定在冷凍套管上,使凍存管中盛有液氮;然后室溫下在預(yù)平衡液中分離卵巢約5 min,在E1中冰水上(0℃)平衡15 min,在 E2中冰水上(0℃)處理5 min,滲透完成后用自制小吸管吸住卵巢組織,最后將含卵巢組織的小滴直接滴入到準(zhǔn)備好的凍存管中,凍存管放置在液氮罐口附近;卵巢全部滴入凍存管后,直接放入液氮罐中儲(chǔ)存,凍存管不封口。

1.2.3 卵巢組織的解凍程序 液氮中儲(chǔ)存2 d～7 d后取出冷凍存管,置室溫中30 s,再放入37℃水浴中解凍30 s,然后將卵巢組織塊依次移入E3、E4、E5液中,每次置室溫5 min;最后把卵巢組織移入L-15*液中,在室溫下分3次漂洗共5 min,置37℃溫箱中待用。

1.2.4 腎囊下卵巢移植 受體腹腔注射10 mL/L戊巴比妥鈉0.25 mL/只～0.3 mL/只,進(jìn)行全身麻醉,背部剪毛,用750 mL/L只酒精消毒;沿背中線剪開皮膚,鈍性分離皮下組織,在腹壁剪一小口,稍擠壓腹部,暴露腎臟;用銳利眼科鑷在腎囊上撕開一個(gè)小口,插入自制玻璃探針分離腎囊膜與腎組織;用自制小吸管吸住卵巢送入腎囊下,左腎移植卵巢2個(gè);在腎臟表面滴加青、鏈霉素液,還納腎臟,縫合切口。操作在潔凈工作臺(tái)中體視顯微鏡下進(jìn)行,所用手術(shù)器械和玻璃用品等采用干熱消毒。

對(duì)手術(shù)后小鼠進(jìn)行保溫,待其蘇醒后放入小鼠飼養(yǎng)籠中進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng),觀察其健康狀況。

1.2.5 卵巢移植體回收 卵巢移植當(dāng)天為0 d,根據(jù)試驗(yàn)分組于預(yù)定時(shí)間斷頸處死受體小鼠,取出卵巢移植腎,對(duì)移植卵巢(移植體)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察記錄,在體視顯微鏡下進(jìn)行顯微照相;移植體連同卵巢移植腎臟放入中性福爾馬林中保存固定,用于組織學(xué)檢查。

計(jì)算移植有效率和卵巢回收率。卵巢移植后,在試驗(yàn)期內(nèi)存活生長(zhǎng),如明顯增大、對(duì)表面有血管分布并凸出腎臟表面的定為可回收卵巢,有可回收卵巢的受體為有效受體。

移植有效率(%)=(有效受體/移植受體數(shù))×100%

卵巢回收率(%)=(可回收卵巢/移植卵巢數(shù))×100%

1.2.6 組織學(xué)檢查 組織切片的制作參照閆國(guó)和等[1]的方法,對(duì)經(jīng)100 mL/L中性福爾馬林液固定好的組織樣品進(jìn)行修整,使之符合石蠟組織切片要求。然后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋;進(jìn)行連續(xù)切片,分段取樣鋪片,切片厚度為 5 μ m,對(duì)鋪好的玻片放入烘箱,58℃過夜烤片;進(jìn)行HE(haematoxylin–eosin)染色:對(duì)烤好的切片進(jìn)行脫蠟、脫二甲苯、蘇木素染色、鹽酸酒精分化、蘭化、伊紅復(fù)染和封片,42℃烘片12 h,用組織切片盒保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

從新生1日齡小鼠中取出卵巢,采用微滴法玻璃化凍存方法處理卵巢,卵巢復(fù)蘇后移植到雄性昆明系雄性小鼠受體腎囊下,本試驗(yàn)共有雄性受體鼠19只,每側(cè)腎囊移植2枚卵巢,總共移植卵巢38枚。飼喂28 d后有效回收移植卵巢的受體鼠為17只,回收卵巢數(shù)30枚,受體總有效率為89.4%;有效回收移植卵巢30個(gè),卵巢總回收率為78.9%。移植卵巢大部分能夠存活、生長(zhǎng)增大。

解凍后1日齡小鼠卵巢(圖1A)移入腎囊后外觀呈灰白色小點(diǎn),無凸出感(圖1C);移植后28 d的卵巢移植體明顯增大,呈圓形或腎形凸起,乳白色(圖1D、E),表面可見有網(wǎng)狀血管分布(圖1E);部分卵巢移植體上可觀察到暗紅色斑點(diǎn),似紅體或出血卵泡(hemorrhagic follicle)(圖1F)。

圖1 移植卵巢形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Observation on morphology of ovaries g rafted

2.2 移植卵巢生長(zhǎng)發(fā)育的比較

1日齡小鼠卵巢平均直徑為 501.2 μ m±39.7 μ m,移植后28 d回收的卵巢顯著生長(zhǎng)增大,平均直徑與1日齡卵巢相比顯著增加(表1)。

2.3 移植卵巢卵泡生長(zhǎng)發(fā)育

1日齡小鼠卵巢切片中未觀察到卵泡,大核細(xì)胞為卵原細(xì)胞(oogonium)(圖2A),尚未組裝形成原始卵泡(primordial follicle);經(jīng)過冷凍保存程序后小鼠卵巢切片并沒有明顯的變化(圖2B)。

表1 冷凍保護(hù)劑處理及移植期移植卵巢大小的比較Table 1 Ovaries treated by cryoprotectant and the size of ovarian grafts in different time

圖2 睪丸在位受體組卵巢卵泡發(fā)育的比較Fig.2 Development of follicle in ovaries from intact male recipients

3 討論

卵巢組織的冷凍保存與移植被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)雌性動(dòng)物生殖資源保存和有效利用的一種有效途徑。近10年來卵巢冷凍移植研究已取得重要進(jìn)展,人們相繼利用新鮮卵巢移植和冷凍卵巢移植獲得的卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精和胚胎移植技術(shù)獲得新生仔鼠[3]、小猴[4],并于2004年出生了首例冷凍胎兒卵巢移植健康女嬰[5-6]。這些研究結(jié)果不僅表明新鮮或冷凍的卵巢移植后仍有可能保持卵巢卵泡及卵母細(xì)胞的正常發(fā)育潛能,而且也為實(shí)現(xiàn)雌性動(dòng)物生殖資源保存提供了新方法。目前卵巢組織的冷凍保存主要采用程序化冷凍的方法,但對(duì)卵巢快速冷凍方法研究較少。覃波霖等[7]采用程序化冷凍方法對(duì)1日齡小鼠卵巢進(jìn)行了冷凍保存并移植到雌性受體小鼠,結(jié)果顯示每側(cè)腎囊移植2枚卵巢的受體鼠的卵巢回收率可達(dá)到45.0%。本研究利用玻璃化冷凍保存原理,采用直接投入液氮方法,對(duì)經(jīng)EG低溫冷凍保護(hù)劑處理的1日齡小鼠卵巢進(jìn)行快速冷凍,解凍后移入雄性受體鼠的卵巢移植體能夠繼續(xù)生長(zhǎng)并完成原始卵泡的形成和各級(jí)卵泡的發(fā)育,卵巢冷凍移植后28 d的受體有效率達(dá)89.3%,移植后28 d的卵巢回收率為78.9%。這說明快速的玻璃化冷凍方法也能夠有效的保存卵巢的組織活性,達(dá)到與程序化冷凍方法相似的保存效果,具有長(zhǎng)期保存雌性動(dòng)物生殖資源的應(yīng)用價(jià)值。

本研究中采用的冷凍方法都獲得了良好的效果,可能是由于改進(jìn)了以下幾個(gè)方面:①為降低損傷程度,一個(gè)可行的方法是將卵巢組織依次放入濃度逐漸升高的玻璃化冷凍保護(hù)液中,同時(shí)將平衡的時(shí)間逐漸縮短[3,8]。②分離卵巢在室溫下于1 mol/L DMSO中進(jìn)行(大約5 min～10 min),再放置放入冷凍保護(hù)劑中,通過這個(gè)步驟能使DMSO滲透到卵巢組織中,從而降低EG的毒性。③所用的冷凍程序都在0℃的環(huán)境下進(jìn)行的,除了1 mol/L DMSO預(yù)處理卵巢組織及復(fù)溫凍存的卵巢組織是在室溫溫度條件下進(jìn)行的,冷凍保護(hù)劑在低溫條件下處理卵巢組織是一個(gè)關(guān)鍵步驟,氧氣需求的減少會(huì)使卵巢組織的損傷減低到最少而且減少冷凍保護(hù)劑對(duì)卵巢組織的毒性。④在復(fù)溫時(shí)凍存卵巢組織可能會(huì)受到脫?；饔玫膿p傷,為了避免這個(gè)反應(yīng),一般選擇小的卵巢或?qū)⑿枰獌龃娴穆殉睬谐尚〉膲K狀組織。本試驗(yàn)就是用1日齡的小鼠卵巢來避免這個(gè)反應(yīng)。EG微滴法玻璃化冷凍保存對(duì)卵巢的保護(hù)效果最好。凍存管預(yù)先放置在液氮罐中里面使得里面裝滿液氮,滲透完成后用自制小吸管吸住卵巢組織,將含組織小滴直接滴入到準(zhǔn)備好的凍存管中,凍存管放置在液氮罐口附近,直接放入液氮罐中儲(chǔ)存,凍存管不封口。由于EG的細(xì)胞毒性較小,滲透速度快,通過直接與液氮接觸,使液體通過極快的降溫速度而使細(xì)胞內(nèi)外均形成玻璃化的過程,跳過冰晶期或最大限度地減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,因此降低對(duì)細(xì)胞的損傷。

試驗(yàn)結(jié)果顯示,保護(hù)劑需要相應(yīng)的冷凍保存方法才能更有效地避免冰晶的形成,保證冷凍卵巢復(fù)溫后的生長(zhǎng)發(fā)育活性。

在卵巢異位移植中,移植體存活的主要障礙是血管未能再生,導(dǎo)致移植組織壞死[9]。移植體血液供應(yīng)的重新建立受移植組織大小、移植部位和血管生長(zhǎng)因子等因素的影響。嚙齒類動(dòng)物的卵巢小,移植后24 h～48 h內(nèi)即可發(fā)生血管再生,因此,卵巢移植部位應(yīng)選擇血供豐富的部位,如腎被膜下[10-11]、卵巢所在部位腹膜下[12]和皮下[13-14]等,本研究在移植體的外觀形態(tài)和組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),存活的移植體表面和內(nèi)部有較多的新生血管,與正常卵巢相比,血管密度明顯增加,管徑增大。袁安文等[15-17]報(bào)道新生鼠卵巢異性受體移植的回收率高達(dá)92.9%的結(jié)果相一致,說明1日齡小鼠卵巢體積小(平均直徑為501.2 μ m ±39.7 μ m),移入供血豐富的腎臟后可以獲得高的卵巢存活率。盡管卵巢組織在冷凍和解凍過程中可能受到一定程度的損傷,但本試驗(yàn)中微滴冷凍組的卵巢移植存活率仍保持較高的水平(卵巢回收率為78.9%),與覃波霖等[7]報(bào)道1日齡小鼠冷凍卵巢移入雌性受體的存活率(82.5%)類似。這說明在本試驗(yàn)的移植時(shí)期內(nèi),冷凍卵巢移植后的存活率主要受冷凍損傷的影響,雄性受體具有與雌性受體相似的移植效果。然而,在成年小鼠冷凍卵巢腎囊下自體與異體移植研究中發(fā)現(xiàn),異體移植組的存活卵巢少于自體移植組,并認(rèn)為可能與異體移植后的免疫排斥有關(guān)[18]。但是在本試驗(yàn)的卵巢異性移植中,卵巢移植體與腎臟交界處沒有觀察到排斥反應(yīng)的炎性外觀變化與組織學(xué)變化,卵巢移植體容易從腎臟中剝離。同樣,袁安文等[15-17]也觀察到與此相一致的結(jié)果。這可能與1日齡小鼠卵巢具有較低的免疫原性或腎囊下被認(rèn)為是一免疫缺損區(qū)[19]等有關(guān),或者免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生需要一個(gè)更長(zhǎng)的時(shí)期。

[1]劉健鵬,王愛物,曹 婧,等.昆明小鼠卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,29(9):58-61.

[2]閆國(guó)和,古德全,林 遠(yuǎn),等.制作鼠組織優(yōu)質(zhì)石蠟切片方法的探討[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,24(7):875.

[3]Migishima F,Suzuki-Migishima R,Song S Y,et al.Successful cryopreservation of mouse ovaries by vitrification[J].Biol Reprod,2003,68(3):881-887.

[4]Lee D M,Yeoman R R,Battaglia D E,et al.Live birth after ovarian tissue transplant[J].Nature,2004,428(6979):137-138.

[5]Donnez J,Dolmans M M,Demy lle D,et al.Live birth after o rthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue[J].Lancet,2004,364(9443):1405-1410.

[6]Kim S S,Hwang I T,Lee H C.Heterotopic autotransplantation of cryobanked human ovarian tissue as a strategy to restore ovarian function[J].Fertil Steril,2004,82(4):930-932.

[7]覃波霖,陳學(xué)進(jìn),施振旦,等.小鼠卵巢冷凍移植后卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟的研究[J].生理學(xué)報(bào),2006,58(1):41-46.

[8]Shi W Q,Zhu S E,Zhang D,et al.Improved development by Taxol pretreatment after vitrification ofin vitromatured porcine oocy tes[J].Reproduction,2006,131(4):795-804.

[9]Nisolle M,Casanas-Roux F,Qu J,et al.Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian x enografts in nude mice[J].Fertil Steril,2000,74(1):122-129.

[10]Aubard Y.Ovarian tissue xenografting[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2003,108(1):14-18.

[11]Hernandez-Fonseca H,Bosch P,Sirisathien S,et al.Effect of site of transplantation on follicular development of human ovarian tissue transplanted into intact or castrated immunodeficient mice[J].Fertil Steril,2004,81(Suppl 1):888-892.

[12]Tryde Schmidt K L,Yding Andersen C,Starup J,et al.Orthotopic autotransplantation of cry opreserved ovarian tissue to a woman cured of cancer-follicular growth,steroid production and oocyte retrieval[J].Reprod Biomed Online,2004,8(4):448-453.

[13]Oktay K,Buy uk E,Rosenwaks Z,et al.A technique for transplantation of ovarian cortical strips to the forearm[J].Fertil Steril,2003,80(1):193-198.

[14]Oktay K,Buyuk E,Veeck L,et al.Embryo development after heterotopic transplantation of cry opreserved ovarian tissue[J].Lancet,2004,363(9412):837-840.

[15]袁安文,王乃東,周衛(wèi)國(guó),等.移植時(shí)間對(duì)小鼠卵巢卵母細(xì)胞在雄性體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,34(1):56-60.

[16]袁安文,彭南妮,王乃東,等.新生小鼠卵巢移植雄鼠腎囊下卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育[J].動(dòng)物學(xué)報(bào),2008,54(2):265-270.

[17]袁安文.小鼠異性移植卵巢卵泡與卵母細(xì)胞發(fā)育研究[D].湖南長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[18]王燕蓉,龐 龍,沈新生.不同濃度保護(hù)劑對(duì)超述凍存小鼠卵巢組織效果觀察[J].生殖與避孕,2005,25(1):8-13.

[19]汪 萍,王燕蓉,沈新生,等.成年大鼠卵巢異體異位移植的實(shí)驗(yàn)研究[J].寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,26(1):6-8.

Study on Allograft and Vitrification of Newborn ouse Ovarian Tissue in Male Recipient Mice

LIAO Hai-yan1,ZHOU Wei-guo2,WANG Fang-jian3

(1.Hunan First Normal College,Changsha,Hunan,410205,China;
2.Animal Epidemic Prevention Supervision Station,Yongzhou,Hunan,425006,China)

The cryopreservation and transplantation of ovarian tissue is considered as one of new technique to build mammal ovum library in the future.To explore methods of vitrification of ovarian tissue and the ideal cryopretectants and build the cryopreservation and transplantation technology of livestock ovary tissue,the vitrified ovarian tissue of newborn mice was allografted underneath the kidney capsule of male recipients in the experiment.1-day-old mouse ovarian tissue were theated by the cryovial method vitrification method.The thawing ovarian tissue was grafted in the kidney capsule of male mouse recepients,19 male recipients used and 38 ovaries form1-day-old mice grafted,with 2 ovaries in each capsule.Oarian grafts were recovered 28 days after transplantation.the grafts were successfully recovered form 17 of the male recipients and the recovery rate was 89.4%in total;the 30 ovaries were successfully recovered form 17 of the male recipients and the recovery rate was 78.9%in total.T he above results demonstrated that the primordial folficles in newborn mouse ovaries were capable of sustaining freezing and thawing,and reinitiating development following xenograft into kidney capsule in adult recipient female mice.

mice;vitrification;ovary transplantation

S853.52

A

1007-5038(2010)09-0071-05

2010-03-03

湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(湘教通[2009]320)

廖海艷(1974-),女,湖南邵陽(yáng)人,講師,碩士,主要從事基礎(chǔ)生命科學(xué)研究。