李揚揚 吳淑華 劉魯英 牟清海 趙大華

1濱州醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 濱州市 256603;2濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科

PIK3CA蛋白在大腸癌變過程中的表達及臨床意義

李揚揚1吳淑華1劉魯英1牟清海2趙大華2

1濱州醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 濱州市 256603;2濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科

目的 研究PIK3CA蛋白在大腸癌變過程中的表達差異及臨床病理的相關(guān)性,探討其臨床意義。方法 應(yīng)用免疫組化方法檢測PIK 3CA蛋白在 79例大腸癌、36例輕度異型增生腺瘤、32例重度異型增生腺瘤、12例正常大腸組織中的表達情況。結(jié)果 ①PIK3CA蛋白在大腸癌組織中的表達明顯高于正常組織及輕度異型增生大腸腺瘤(P＜0.01),與重度異型增生腺瘤間無明顯差異(P＞0.05)。重度異型增生腺瘤組織中PIK 3CA蛋白的表達比輕度異型增生腺瘤及正常黏膜組織中的表達顯著增高(P＜0.01);②大腸癌組織中PIK 3CA蛋白的表達與腫瘤的分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素具有相關(guān)性(P＜0.05),而與患者的性別、年齡、部位、腫瘤的大小及組織學(xué)類型等因素?zé)o關(guān)(P＞0.05)。結(jié)論 PIK 3CA在大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用,檢測PIK3CA對于大腸癌的早期診斷、判斷預(yù)后有重要意義。

PIK 3CA蛋白;大腸癌變;免疫組化;癌基因

大腸癌是我國常見的消化系統(tǒng)腫瘤,其發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌,居第三位。近年來,由于生活環(huán)境和飲食習(xí)慣的改變,其發(fā)病率逐年上升,并且有年輕化的趨勢,嚴重威脅人們的生命,影響患者的生活質(zhì)量。深入研究大腸癌的發(fā)生機制對于大腸癌的防治具有重要的臨床意義。PIK3CA是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種癌基因,編碼 PI3Ks的 p110催化亞單位,即 PI3Kp110a[1]。PI3Ks能磷酸化 PIP2產(chǎn)生體內(nèi)重要的第二信使 PIP3,因此推斷 PIK3CA可以通過作用于 PI3K/AKT信號通路參與體內(nèi)細胞的增殖等重要生理功能的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)人類 30%的惡性腫瘤存在 PIK3CA的突變。本實驗將通過免疫組織化學(xué)的方法檢測 PIK3CA蛋白(PI3Kp110a)在正常大腸黏膜組織、大腸腺瘤組織及大腸癌組織的表達情況,探索 PIK3CA突變在大腸癌癌變過程中的作用,為大腸癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療及判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 2006年9月—2009年 3月的手術(shù)或腸鏡切除的大腸病變標本共 159例。其中大腸癌 79例,男 35例,女 44例,均為首次發(fā)現(xiàn),術(shù)前未行任何治療;年齡 29～88歲,平均年齡 60歲。腫瘤大小:直徑≥5 cm者 50例,＜5 cm者 29例;組織學(xué)類型:管狀腺癌 65例,粘液腺癌 14例;分化程度:高分化 48例,中、低分化 31例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 48例,無轉(zhuǎn)移 31例。按國際癌癥防治聯(lián)合會(UICC)2002年 TNM分期標準,Ⅰ期和Ⅱ期共 12例,Ⅲ期和Ⅳ期共 67例。根據(jù) WHO大腸腺瘤分級標準(2005年)[2],將大腸腺瘤分為輕、中及重度異型增生腺瘤三類,本實驗選取輕度異型增生腺瘤(36例)和重度異性增生腺瘤(32例),設(shè) 12例病變旁的正常大腸黏膜組織為對照組。所有標本均經(jīng) 10%福爾馬林溶液固定,常規(guī)石蠟包埋。

1.2 試劑 兔抗人 PI3Kinase p110alpha抗體濃縮液購自 Cell Signaling Technology公司,Max VisionTM快速免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 嚴格按照Max VisionTM快速免疫組化方法步驟操作:將石蠟包埋組織制成 3μm切片,脫蠟至水。3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶,置于 EDTA修復(fù)液中(pH=9.0),高壓鍋加熱 10 min進行抗原修復(fù)。按 1∶100比例稀釋一抗,加一抗后 4℃過夜,PBS沖洗后滴加二抗,DAB顯色,脫水透明,中性樹膠封片。用已知陽性表達的腦組織做陽性對照,PBS代替一抗做陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷與量化 以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標志,PI3Kp110a陽性表達在上皮細胞胞漿內(nèi)。置每例免疫組化切片于高倍鏡下(×400),隨機選取 5個不同視野,使用 IPP病理圖像分析軟件對圖像進行分析,測定每個視野下 PIK3CA蛋白陽性表達的平均光密度,以每張切片 5個視野平均光密度的平均值作為該例組織的測量值,平均光密度值越高其蛋白表達水平越高。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 全部數(shù)據(jù)均采用 SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行處理,各組光密度值以±s表示。不同病變各組均數(shù)比較用方差分析,不同病變各組兩兩比較用 Bonferroni法;PIK3CA蛋白表達與大腸癌臨床病理等因素的關(guān)系用多重線性回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 大腸不同病變組織中 PIK3CA蛋白的表達PIK3CA蛋白(PI3Kp110a)陽性表達部位主要位于上皮細胞的胞漿內(nèi)(見圖 1～4)。在大腸癌組織中,PI3Kp110a的表達水平顯著高于正常大腸黏膜組織及輕度異型增生腺瘤(P＜0.01),而與重度異性增生腺瘤中的蛋白表達相比差異不明顯,無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);PI3Kp110a在大腸重度異性增生腺瘤組織中的表達與輕度異型增生腺瘤和正常大腸黏膜組織中的表達相比有顯著差異(P＜0.01);大腸輕度異型增生腺瘤與正常大腸黏膜組織之間的表達相比無顯著差異(P＞0.05)(見表 1)。

圖1 大腸腺瘤(輕度異型增生)PI3Kp 110a的表達(×100)

圖2 大腸腺瘤(重度異型增生)PI3Kp110a的表達(×100)

圖3 大腸癌組織中PI3Kp 110a的表達(×100)

圖4 大腸癌組織中PI3Kp110a的表達(×200)

表1 大腸不同病變組織PIK 3CA蛋白的表達

2.2 大腸癌組織 PIK3CA蛋白(PI3Kp110a)的表達與臨床病理因素的關(guān)系 在大腸中低分化腺癌組織中 PI3Kp110a的表達高于高分化腺癌,具有顯著性差異(P＜0.05);伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中PI3Kp110a的表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05);PI3Kp110a的表達與腫瘤的 TNM分期有關(guān),Ⅲ ～Ⅳ期明顯高于Ⅰ ～Ⅱ期(P＜0.05);而 PIK3CA蛋白的表達與大腸癌患者的年齡、性別,腫瘤的大小、部位、類型等均無相關(guān)性(P＞0.05)(見表 2)。

3 討論

PIK3CA是 Volinia等于 1994年發(fā)現(xiàn)的一種癌基因,定位于三號染色體 3q26.3,全長 34 kb。PIK3CA基因在人體正常的腦、肺、乳腺、食管等多個組織均有表達,可能參與體內(nèi)細胞重要的生理功能,然而在癌組織中 PIK3CA基因發(fā)生突變并可以過度表達。隨著人們對 PIK3CA蛋白(PI3Kp110 a)在腫瘤發(fā)生中作用的認識,而倍受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),PIK3CA是一種體細胞突變癌基因,在乳腺癌、宮頸癌、肺癌等人類多種惡性腫瘤都發(fā)現(xiàn)有 PIK 3CA的突變[3～5]。PIK3CA編碼 I類磷脂酰肌醇 3激酶(phosphatidylino-sitol 3-kinases,PI3Ks)的 p110催化亞單位,即 PI3Kp110a,其蛋白主要表達在細胞漿[1]。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3Ks)是一類脂激酶家族,其能特異性的磷酸化磷脂酰肌醇的 3位羥基,產(chǎn)生體內(nèi)的第二信使肌醇脂類物質(zhì)[6]。其中ⅠA型PI3Ks是由 p110催化亞單位和 p85調(diào)節(jié)亞單位組成的二聚體蛋白,其通過 p85的“SH2結(jié)構(gòu)域”被上游的 RTK(受體酪氨酸激酶)激活[7],活化的 PI3Ks能夠磷酸化 PIP2生成體內(nèi)重要的第二信使 PIP3,PIP3可通過下游多種分子調(diào)控細胞的生長、代謝和遷移等重要的生理功能[8,9]。Catasus等[10]研究發(fā)現(xiàn),PIK3CA的突變,可以導(dǎo)致其蛋白產(chǎn)物PI3Kp110a的表達增加,進而可以上調(diào) PI3Ks的活性,PI3Ks活性的增強可以通過 PI3K/AKT信號通路影響下游分子引起細胞代謝、細胞周期等的失調(diào)和紊亂,從而導(dǎo)致細胞的癌變。

近年來隨著大腸癌發(fā)病率的增高,深入研究大腸癌的發(fā)生發(fā)展機制,做到早預(yù)見、早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療成為大腸癌防治的重點。腫瘤的發(fā)生機制十分復(fù)雜,目前研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)腺瘤癌變是大腸癌發(fā)生的重要途徑之一,絕大多數(shù)的大腸癌來源于原先存在的腺瘤,即所謂的腺瘤腺癌順序[11]。Morson等[12]認為大腸由腺瘤演變?yōu)橄侔┑倪^程約 10年左右,而重度不典型增生的腺瘤演變?yōu)樵缙诎┐蠹s為 3～6年的時間。分子生物學(xué)的研究表明,除少數(shù)遺傳性腫瘤外,在大腸癌發(fā)生發(fā)展的不同階段,可出現(xiàn)多種基因的改變,包括癌基因的突變及過度表達、抑癌基因的缺失或失活,眾多基因改變的相互作用導(dǎo)致大腸癌的發(fā)生。Yardena等[13]對癌基因 PIK3CA的研究提出 PIK 3CA的突變可能導(dǎo)致大腸腺瘤癌變,但PIK3CA蛋白(PI3Kp110a)在經(jīng)腺瘤癌變過程中的表達與 PIK 3CA突變是否一致尚不清楚。本實驗采用免疫組織化學(xué)方法,檢測 PI3Kp110a在大腸癌變過程中由正常黏膜組織-上皮增生-腺瘤-癌變等多個步驟演進過程中的表達情況,旨在探討 PIK 3CA在大腸癌變演進過程中所發(fā)揮的作用。

本實驗研究結(jié)果顯示,PI3Kp110a的表達在大腸癌組織中明顯增高,可見在大腸癌中存在PIK3CA基因的突變。在從正常大腸組織、輕度異型增生腺瘤、重度異型增生腺瘤到腺癌的演變過程中,PI3Kp110a在大腸癌組織中其表達明顯高于大腸其他病變階段組織,與輕度異型增生腺瘤組織及正常大腸組織相比差異具有顯著性(P＜0.01),表明PIK3CA的突變在大腸癌發(fā)生中具有重要作用,其突變可能推動正常大腸黏腹組織和大腸腺瘤組織的癌變。本實驗顯示,在大腸重度異型增生腺瘤組織中,PI3Kp110a也呈高表達,明顯高于正常大腸黏膜組織及大腸輕度異型增生腺瘤組織,差異具有顯著性(P＜0.01),而與大腸癌組織無明顯差異,推測PIK3CA的突變發(fā)生在正常組織-輕度異型增生腺瘤-重度異型增生腺瘤-大腸癌演變過程的后期階段,主要在大腸重度異型增生腺瘤到大腸癌的演進過程中發(fā)揮作用,可能與細胞獲得侵襲性轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘毎倪^程有關(guān),這點與 Yardena等[13]對于癌基因PIK3CA的研究結(jié)果相吻合。

本實驗資料顯示大腸癌好發(fā)于中老年人,其發(fā)病率占 86.1%,但在大腸癌中 PI3Kp110a的表達與臨床病理因素相關(guān)性的研究中發(fā)現(xiàn),PI3Kp110a的表達與大腸癌患者的年齡并無明顯相關(guān)性,其表達與患者的性別、腫瘤的大小以及組織學(xué)類型等因素亦無相關(guān)。但是,本研究發(fā)現(xiàn) PI3Kp110a的表達與大腸癌的分化程度具有相關(guān)性,其表達在高分化腺癌與中、低分化腺癌相比差異具有顯著性,腫瘤分化程度越低其蛋白表達水平越高;而關(guān)于 PI3Kp110a的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析結(jié)果顯示,伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中的表達明顯高于未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者,兩者相比有顯著性差異;另外,PI3Kp110a的表達與大腸癌的侵犯深度及腸外轉(zhuǎn)移即腫瘤的 TNM分期具有明顯相關(guān)性,Ⅲ ～Ⅳ期顯著高于Ⅰ ～Ⅱ期。我們認為,擁有癌基因 PIK3CA突變的細胞分化能力低,具備較強的侵襲能力,易出現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移。因此,檢測 PI3Kp110a反應(yīng)癌基因PIK3CA的突變,可成為預(yù)測腫瘤的分化,判斷大腸癌預(yù)后的一個重要指標。

總之,癌基因 PIK3CA突變在大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用,其突變可能是導(dǎo)致大腸癌變的重要因素之一,進一步認識癌基因 PIK3CA突變作用對于揭示大腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制具有重要的意義。癌基因 PIK3CA編碼的蛋白PI3Kp110a在大腸癌變不同階段的表達差異提示檢測 PI3Kp110a可成為臨床觀測腫瘤的進展程度、判斷預(yù)后的重要指標,也為臨床早期警示大腸癌變提供了重要的理論依據(jù)。人類惡性腫瘤的發(fā)生與多種因素有關(guān),具有復(fù)雜的分子基礎(chǔ),是多步驟、多基因改變的復(fù)雜過程。癌基因 PIK3CA的發(fā)現(xiàn)為我們研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了新的方向,癌基因PIK3CA突變及其蛋白的表達在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機制還有待于進一步的研究。

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Expression and clinical significance of PIK 3CA in the progress of colorectal canceration

LI Yangyang1WU Shuhua1LIU Luying1MU Qinghai2ZHAO Dahua2
1 Department of Pathology,Binzhou Medical University,Binzhou 256603;2Department of Pathology,Affiliated Hospital of Binzhou Medical University

ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of PIK 3CA in colorectal carcinoma tissue,and also in different tissues in the progression of colorectal canceration.MethodsDetected the PIK3CA expression in 79 cases of colorectal cancer,36 cases of mild dysplasia adenoma,32 cases of severe dysp lasia adenoma,12 cases of normal colorectal organizations by Max Vision TM immunohistochemical technique(IHC).Resu lts①PIK 3CA p rotein exp ression in colorectal cancer was significantly higher than the normal colon tissues and mild dysplasia colorectal adenoma(P＜0.01),then there was no significant difference bet ween colorectal carcinoma and severe dysp lasia adenoma(P＞0.05);PIK3CA protein expression in severe dysplasia adenoma was significantly higher than mild dysp lasia colorectal adenoma and the normal colon tissues(P＜0.01)②PIK 3CA expression was correlated with the degree of tumor differentiation,TNM stage and lymph nodemetastasis(P＜0.05),but its expression was no relation with patients sex,age,position,tumor size and type,(P＞0.05).ConclusionPIK 3CA may play an important role in progression of colorectal canceration,detect PIK 3CA protein exp ression is significant to diagnose and predict patients prognis is.

PIK3CA protein,colorectal carcinoma,IHC,oncogene

R734.2

A

1001-9510(2010)01-0005-04

2009-11-11)