趙國(guó)英 趙銘鋒 郭金將 張海鴻 王 暉

1濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科 濱州市 256603;2濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科

冬凌草甲素對(duì) HL-60細(xì)胞 p53表達(dá)及細(xì)胞周期的影響

趙國(guó)英1趙銘鋒2郭金將1張海鴻1王 暉1

1濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科 濱州市 256603;2濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科

目的 探討冬凌草甲素對(duì)HL-60細(xì)胞p 53表達(dá)及細(xì)胞周期的影響。方法 通過(guò)PI染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡峰,并以 RT-PCR檢測(cè)p53基因的表達(dá)。結(jié)果 流式細(xì)胞儀分析顯示,冬凌草甲素處理后使細(xì)胞周期發(fā)生變化:G1期、S期細(xì)胞的比例減少,G2/M期細(xì)胞的比例增加,凋亡的細(xì)胞數(shù)比例增多,且隨著藥物濃度的增加而逐漸增加。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,20μmol/L冬凌草甲素作用后,與對(duì)照組相比,HL-60細(xì)胞 p53 mRNA水平顯著升高,且隨時(shí)間延長(zhǎng)表現(xiàn)得更為明顯。結(jié)論 冬凌草甲素能使細(xì)胞周期發(fā)生變化和p 53基因的上調(diào),從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

HL-60細(xì)胞;冬凌草甲素;細(xì)胞周期;p 53

白血病是兒童最常見(jiàn)的惡性腫瘤,近年來(lái)其療效有很大提高,但仍有部分患兒對(duì)化療不敏感和耐藥,尋找新型治療白血病的藥物成為臨床研究熱點(diǎn)之一。研究證明,冬凌草甲素具有廣泛的抗腫瘤作用,并對(duì)白血病細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯抑制作用[1～3],但其誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制目前尚未明確。研究冬凌草甲素對(duì)白血病細(xì)胞的細(xì)胞周期變化及其對(duì) p53基因表達(dá)的影響,對(duì)進(jìn)一步探索冬凌草甲素促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡相關(guān)機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人白血病細(xì)胞株 HL-60細(xì)胞為山東大學(xué)血液病中心實(shí)驗(yàn)室凍存。冬凌草甲素 (Oridonin)購(gòu)自上海卓康生物科技有限公司,規(guī)格 20 mg/支(C≥98%);RPMI-1640為美國(guó) Hyclone公司產(chǎn)品;小牛血清為杭州四季青生物制品廠產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)為 AMRESCO產(chǎn)品;膜聯(lián)蛋白 V(Annexin V)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于 Biovision公司,coll細(xì)胞分離液、磷酸鹽(PBS)緩沖液 、PI(碘化丙啶)、Hoechst染液為 Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):HL-60細(xì)胞株復(fù)蘇后懸浮生長(zhǎng)于 RPMI-1640培養(yǎng)液中,內(nèi)含 10%小牛血清,1 mmol/L谷胺酰胺及青鏈霉素各 100 U/L。于 37℃、5%CO2的飽和濕度孵箱中培養(yǎng),每 2～3 d傳代 1次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于含不同濃度冬凌草甲素的培養(yǎng)體系中進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將細(xì)胞終濃度調(diào)至 2×105/L。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:收集經(jīng)不同濃度(5、10、15、20、25μmol/L)的冬凌草甲素分別誘導(dǎo)處理 24、48和 72 h的 HL-60細(xì)胞,離心洗滌,制成細(xì)胞涂片,干燥后瑞氏-姬姆薩染色,光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。觀察細(xì)胞處理后細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核的變化,尤其觀察凋亡小體形成等。

1.2.3 細(xì)胞周期檢測(cè):收集不同濃度冬凌草甲素作用 72 h后的 HL-60細(xì)胞,70%冷乙醇固定過(guò)夜,PBS清洗,200μl RNaseA 37℃水浴消化 30min,800μl PI避光染色 30 min,上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期和凋亡峰檢測(cè)。未加藥組為對(duì)照組。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè) P53基因 mRNA的表達(dá):收集對(duì)照組和藥物作用組 (冬凌草甲素 20μmol/L作用48 h)細(xì)胞,Trizol裂解(GIBCO公司)提取細(xì)胞總RNA,特定蛋白分析儀測(cè)定 RNA純度(A260/A280＞1.75)。加入隨機(jī)引物及 M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(MBI,FERMENTAS)合成 cDNA鏈。取 cDNA0.1 μg,加入 10×Bu ffer 2.5μl,25 mmol/LMgCl21μl,10 mmol/L dNTP 0.5 μl,20 pmol/μl的上下游引物各 0.5 μl,TaqDAN聚合酶 (Promega,5 u/μl)0.5 μl,滅菌雙蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)足至 25μl。ThermoPX2型 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,以 β-actin作為內(nèi)參照。

p53反應(yīng)條件為:預(yù)變性 95℃ 2 min;變性 94℃45 s,退火 51.9℃ 1min,延伸 72℃ 90 s;最后延伸10 min,共 35個(gè)循環(huán)。β-actin反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃ 2 min;變性 94℃ 45 s,退火 58℃ 1 min,延伸72℃ 1min;最后延伸 10min,共 35個(gè)循環(huán)。各引物序列分別為:p53上游引物為 :5'-TCTGGGACAGCCAAGTCTGT-3',下游引物為 5'-GGAGTCTTCCAGTGTGATGA-3',擴(kuò)增產(chǎn)物為 435 bp;β-actin上游引物為:5'-CGCTGCGCTG-GTCGTCGACA-3',下游引物為5'-GTCACGCAC-GATTTCCCGCT-3',擴(kuò)增產(chǎn)物為 619 bp。

擴(kuò)增產(chǎn)物行 1.7%瓊脂糖凝膠電泳,于 BIORAD Gel 2000凝膠成像儀上成像 Quantity One軟件作半定量分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所得數(shù)據(jù)經(jīng) SPSS 10.0 forwindows軟件處理,結(jié)果用±s表示。數(shù)據(jù)用方差分析和 Dunnett檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 空白對(duì)照組的 HL-60細(xì)胞光鏡下細(xì)胞呈圓形,胞核居中占整個(gè)細(xì)胞絕大部分,染色質(zhì)呈紫紅色,胞漿量少;5μmol/L的冬凌草甲素處理的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變不明顯;10μmol/L及其以上濃度的冬凌草甲素處理的 HL-60細(xì)胞形態(tài)有明顯改變,甚至出現(xiàn)凋亡小體。以 20μmol/L的冬凌草甲素處理細(xì)胞 48 h后,大部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化。表現(xiàn)為:細(xì)胞皺縮、體積縮小,多數(shù)細(xì)胞染色質(zhì)濃集、細(xì)胞核固縮,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)典型的凋亡小體,表現(xiàn)出現(xiàn)特異性的凋亡形態(tài),見(jiàn)圖 1、2。

圖1 經(jīng) 20μmol/L的冬凌草甲素處理 48 h的 HL-60細(xì)胞光鏡下形態(tài)學(xué)改變 (W right-Giemsa染色,×1000)

圖2 未經(jīng)冬凌草甲素處理的HL-60細(xì)胞光鏡下形態(tài)(Wright-Giemsa染色,×1000)

2.2 冬凌草甲素對(duì) HL-60細(xì)胞周期的影響 冬凌草甲素處理后在細(xì)胞周期 G1峰前出現(xiàn)亞二倍體峰,即亞 G1期峰(凋亡峰),該期細(xì)胞數(shù)占檢測(cè)細(xì)胞的百分比,即為細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例。亞G1期峰隨著藥物濃度的增加而逐漸明顯,10～25μmol/L的冬凌草甲素各組凋亡率分別為(4.6±0.48)%,(13.7±1.8)%,(25.7±1.46)%,(32.1±1.63)%,亞 G1期峰隨著藥物濃度的增加而逐漸明顯。

正常狀態(tài)下的 HL-60細(xì)胞大多數(shù)處于 G1期,S期次之,G2/M期最少。冬凌草甲素處理后使細(xì)胞周期發(fā)生變化:G1期、S期細(xì)胞的比例減少,G2/M期細(xì)胞的比例增加,且隨著藥物濃度的增加而逐漸明顯。結(jié)果表明,冬凌草甲素能夠誘導(dǎo) HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡,且隨著藥物濃度的增加而逐漸增加,見(jiàn)表 1。

表1 不同濃度的冬凌草甲素對(duì) HL-60細(xì)胞的PI檢測(cè)

2.3 冬凌草甲素對(duì) HL-60細(xì)胞 p53基因 mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,冬凌草甲素作用后,HL-60細(xì)胞 p53 mRNA水平顯著升高,且隨時(shí)間延長(zhǎng)表現(xiàn)得更為明顯,見(jiàn)圖 3。

圖3 冬凌草甲素不同作用時(shí)間下HL-60細(xì)胞 p53mRNA的表達(dá)

3 討論

凋亡受抑是急性白血病(acute leukemia,AL)發(fā)生、發(fā)展及化療耐藥、治療失敗的主要原因。故誘導(dǎo)凋亡療法是消滅白血病細(xì)胞的一條新途徑。近年來(lái)中藥治療急性白血病有很大的進(jìn)展,許多植物成分在體外有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,但臨床應(yīng)用尚在研究中。

冬凌草甲素(rebescensine A)是從冬凌草中進(jìn)一步提取出來(lái)的一種四環(huán)二萜類(lèi)化合物。其活性成分及藥理作用機(jī)制比較復(fù)雜,總結(jié)文獻(xiàn)資料[4,5]其抗癌作用機(jī)制可能與以下因素有關(guān):①抗突變作用;②降低腫瘤細(xì)胞的鈉泵轉(zhuǎn)運(yùn)活性;③增強(qiáng)其他抗腫瘤藥物的療效。既往研究資料顯示冬凌草甲素對(duì)急性白血病 HL-60細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用,經(jīng)冬凌草甲素處理后的 HL-60細(xì)胞,其端粒酶活性下降,bcl-2表達(dá)水平下調(diào),部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象[3]。我們研究也證實(shí)了冬凌草甲素對(duì) HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,并且在 10～25μmol/L范圍內(nèi)的冬凌草甲素對(duì) HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用有濃度-時(shí)間依賴性。20μmol/L的冬凌草甲素處理細(xì)胞 48 h后,大部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化(見(jiàn)圖 1、圖 2)。在膜聯(lián)蛋白 V-FITC及 PI染色,流式細(xì)胞儀分析中發(fā)現(xiàn):在相同作用時(shí)間下,HL-60細(xì)胞凋亡率隨藥物作用劑量的增高而升高,并且在冬凌草甲素對(duì) HL-60細(xì)胞周期影響的試驗(yàn)中亦得到證實(shí)。

凋亡的過(guò)程受到多種因子調(diào)控,p53是其中一個(gè)重要調(diào)控因子,在維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)、抑制惡性增殖過(guò)程中起著重要作用。p53作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)DNA損傷做出反應(yīng),并誘導(dǎo)下游蛋白如 p21、Mdm2和 Bax的表達(dá),這些下游蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡。正常的 p53在細(xì)胞里的功能有多種,包括DNA結(jié)合功能、細(xì)胞循環(huán)過(guò)程的控制、DNA修復(fù)、細(xì)胞調(diào)亡控制、參與細(xì)胞分化和基因的可塑性調(diào)控[6]。但目前研究最多的有兩種,一種是抑制細(xì)胞分裂,讓其停留在細(xì)胞周期的 G1期,另一種是使細(xì)胞凋亡,此兩種功能與 p53轉(zhuǎn)錄的能力均有一定程度的聯(lián)系。

p53介導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能是通過(guò)以下幾點(diǎn):①在凋亡過(guò)程中線粒體膜失去完整性,接著細(xì)胞色素C釋放入胞漿,引起 caspase斷裂激活。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白 Bax可調(diào)節(jié)細(xì)胞色素 C釋放。Bax顯示在它的促進(jìn)子內(nèi)有某些 p53結(jié)合位點(diǎn),它對(duì) DNA損傷的上調(diào)反應(yīng)并增加p53[7]。p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡能被 Bcl-2/Bcl-x抑制。②活性氧 (ROS)是線粒體損傷和凋亡的有力的激活劑。許多蛋白能增加 ROS的產(chǎn)生,因此氧化應(yīng)激能被 p53誘導(dǎo)[8,9]。③Fas通過(guò) FasL三聚化作用被激活繼而導(dǎo)致caspase激活。Fas過(guò)度表達(dá)能引起凋亡且被認(rèn)為是p53依賴的,但是機(jī)制尚不清楚[10]。p53可以上調(diào)Fas并誘導(dǎo) Fas介導(dǎo)的死亡[11]。p53它通過(guò)停止細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其腫瘤抑制者的功能[12,13]。它是細(xì)胞生長(zhǎng)的“監(jiān)控器”,是細(xì)胞生長(zhǎng)重要的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白,在細(xì)胞受到射線或某些藥物作用發(fā)生 DNA損傷的情況下,p53蛋白能阻止細(xì)胞周期停滯在 G1期,使細(xì)胞有足夠的時(shí)間修復(fù)損傷,恢復(fù)正常狀態(tài),重新進(jìn)入細(xì)胞周期[14,15]。若損傷不能修復(fù),它可啟動(dòng)細(xì)胞的程序性死亡過(guò)程引起細(xì)胞凋亡,從而保證有癌變傾向的細(xì)胞不再存活下去。在正常細(xì)胞里 p53的表達(dá)量很低,因此它不足以使細(xì)胞停止生長(zhǎng)或死亡。然而當(dāng)細(xì)胞受到某種損傷如 DNA損傷或缺氧后,p53的表達(dá)會(huì)急劇升高,從而使細(xì)胞停止在 G1期,使受損細(xì)胞修復(fù)或發(fā)生凋亡。wtp53是 G1期 DNA損傷的檢查點(diǎn),充當(dāng)“安全衛(wèi)士”監(jiān)視著細(xì)胞基因組的完整性[16]。滕理送等[17]用電穿孔法將正向攜帶野生型 p53基因 cDNA全長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒(Dol p53)導(dǎo)入 p53基因突變的人腸癌細(xì)胞 SW1116,wtp53的表達(dá)使 SW1116細(xì)胞的G418抗藥性克隆形成減少,細(xì)胞生長(zhǎng)速度較對(duì)照細(xì)胞明顯減慢,細(xì)胞增殖周期 G1期增加、S期下降。我們的實(shí)驗(yàn)研究中冬凌草甲素處理后細(xì)胞周期發(fā)生的變化:G1期 S期細(xì)胞的比例減少,G2/M期細(xì)胞的比例增加,亦證實(shí)這一觀點(diǎn)。結(jié)果表明,冬凌草甲素能夠誘導(dǎo) HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡,且隨著藥物濃度的能夠誘導(dǎo) HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡,且隨著藥物濃度的增加而逐漸增加。

本實(shí)驗(yàn)研究表明,冬凌草甲素作用后,HL-60細(xì)胞 p53mRNA水平顯著升高,且隨時(shí)間延長(zhǎng)表現(xiàn)得更為明顯,本研究揭示,冬凌草甲素在誘導(dǎo) HL-60細(xì)胞凋亡的過(guò)程中伴有 p53基因上調(diào)和 G1期 S期細(xì)胞的比例減少,G2/M期細(xì)胞的比例增加,表明此基因參與冬凌草甲素誘導(dǎo) HL-60的細(xì)胞凋亡,并提示冬凌草甲素的凋亡誘導(dǎo)作用可能部分通過(guò) p53途徑實(shí)現(xiàn)。同時(shí)也說(shuō)明,冬凌草甲素可能是一種潛在的白血病治療藥物,這些資料為進(jìn)一步進(jìn)行臨床前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及冬凌草甲素廣泛應(yīng)用于臨床提供了更有力的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of rebescensine A on HL-60 cell expression of p 53 and cell cycle changed

ZHAO Guoying1ZHAO Mingfeng2GUO Jinjiang1ZHANG Haihong1WANG Hui1
1 Department of Pediatrics Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou 256603;2 Departnent of Pathology,Affiliated Hospital of Binzhou Medical University

ObjectiveTo investigate the effects of rebescensine A on HL-60 cell expression of p53 and cell cycle.MethodsHL-60 cells in culturemedium in vitro were given different concentrations of rebescensine A.Propidium Idide(PI)binding and flow cytometry were used to detect cell cycle and apoptotic peak;And RT-PCR was used to observe the expression of p53.Resu ltsMarked morphological changes of cell apoptosis were observed.Cell cycle changed after the cells treated by rebescensine A:The ratio of G1and S-phase cells decreased,G2and M-phase cells increased and apoptotic cells count increased along with the increasing concentrations of rebescensine A.Theup-regulated of p 53mRNA were showed by RT-PCR and changed more obviously with prolongation in HL-60 cells treated by rebescensine A 20μmol/L.ConclusionRebescensine A could change the cell cycle ofHL-60 cells,and the up-regulated of p 53 gene,which induced apoptosis.

HL-60 cells,rebescensine A,cellcycle,p53

R562.2

A

1001-9510(2010)01-0012-04

2009-10-13)