張敬敬，劉曉穎，錢開誠

1. 華東師范大學(xué)、上海市血液中心研究生培養(yǎng)基地，上海 200051； 2. 上海市血液中心，上海 200051

微生物富集方法主要包括物理法和生物親和法2大類。常用物理方法包括過濾法(filtration method)、離心法(centrifugation method)等(表1)。生物親和法是根據(jù)微生物特性將其與固相載體結(jié)合以實現(xiàn)分離，它可分為特異性結(jié)合與非特異性結(jié)合2種，磁性分離法是生物親和分離法的一種。本文闡述過濾法、密度梯度離心法及磁性分離法3種富集微生物的方法及其應(yīng)用，重點介紹磁性分離法及其在病原微生物富集及檢測方面的應(yīng)用。

1 分離、富集細菌的物理方法及其應(yīng)用

1.1 過濾法

過濾法富集微生物是將適當(dāng)孔徑的濾膜放入濾器，過濾樣品。由于濾膜的作用而將微生物滯留在膜表面，使微生物與樣品溶液分開，達到微生物富集目的。臨床上常用富集微生物的濾膜孔徑為0.22 μm和0.45 μm，前者通常用于醫(yī)用注射液及化學(xué)溶液除菌，后者常用于富集體液如腦脊髓液[1]、痰液[2]中的微生物。Sankaran等[3]利用膜過濾法過濾分離人糞便中的志賀菌屬和大腸埃希菌，可有效去除后續(xù)細菌檢測的干擾因素。過濾法的優(yōu)點在于成本低、速度相對較快且微生物濃縮效果明顯，適用于大體積樣本中微生物的富集。臨床上過濾法主要用于體液等樣品中的微生物富集，但較少用于有一定黏稠度的樣品，如全血或血小板等標(biāo)本。原因在于一方面血液制品中含有與微生物大小相仿的其他細胞，無法完全將微生物與樣品完全分離；另一方面血液制品的黏稠度較大，易堵塞濾孔。

表1常用細菌富集方法的比較

Tab.1Comparisonofmethodsformicrobialenrichment

為進一步提高過濾法富集細菌的效率，Zierdt等[4]利用帶正電的濾膜通過靜電吸附作用使革蘭陽性菌從樣品中分離，原理在于革蘭陽性菌的細胞壁含有磷壁酸，帶有負(fù)電荷。細菌荷電性的大小與所在樣品的電解質(zhì)、pH值、細菌種類及生長階段有關(guān)，通過對這些參數(shù)的優(yōu)化可進一步提高細菌的分離、富集效率。另外，交錯流過濾技術(shù)為解決濾孔堵塞問題提供了幫助。原理如下：在泵的推動下樣品平行于膜面流動，與垂直過濾不同的是樣品流經(jīng)膜面時產(chǎn)生的剪切力把膜面上滯留的顆粒帶走，從而減少濾膜堵塞。此外，還有濾器生產(chǎn)商為減少堵塞、加速過濾而采用緊貼于濾膜的“攪拌”裝置。

1.2 離心法

離心法是借助于離心力，對比重不同的物質(zhì)進行分離的方法。在臨床基礎(chǔ)研究中，常用直接離心法和密度梯度離心法來分離樣品中的微生物。直接離心法是在不加入介質(zhì)的條件下，直接對樣品中的細菌進行離心分離，使大部分細菌沉降于管底，達到將細菌分離、富集的目的。然而，直接離心的同時樣品中與靶細菌密度相近的其他成分也會隨之沉淀，影響分離后細菌的純度。

密度梯度離心法(density gradient centrifugation method)是用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細菌混懸液置于介質(zhì)的頂部(底部或混勻)，根據(jù)細菌在密度梯度液中的比重不同，通過離心力的作用使靶細菌分離。密度梯度離心法通常分為速率沉降和等密度沉降2種。速率沉降適用于分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器，等密度沉降適用于分離密度不等的顆粒。密度梯度離心常用的沉降介質(zhì)有蔗糖、氯化銫、Ficoll液、Percoll液等，其中Ficoll液、Percoll液常用于細胞分離。Ficoll液為聚蔗糖，F(xiàn)icoll-Paque PLUS(Ficoll-泛影酸鈉)是無菌、即用型的，有合適的密度、黏度和滲透壓，能夠簡單、快速地從人外周血、骨髓和臍帶血中分離淋巴細胞及單個核細胞。Percoll液是一種表面包被聚乙酰胺吡咯烷酮的硅膠顆粒，無毒、無刺激性，對細胞無吸附作用，產(chǎn)生的滲透壓很小，可在全部密度范圍保持等張。

Ficoll液、Percoll液也可用于微生物細胞的分離、富集。Zierdt等[4]將Ficoll密度梯度離心法與膜過濾法結(jié)合，用于人全血中的大腸埃希菌、肺炎克雷白菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、銅綠假單胞菌、唾液鏈球菌、肺炎鏈球菌等12種細菌的富集、分離。與傳統(tǒng)的血培養(yǎng)方法相比，密度梯度離心法的富集效率明顯提高。另有研究應(yīng)用Ficoll等密度梯度離心法成功富集培養(yǎng)基中的枯草芽胞桿菌。Lindqvist等[5]利用Percoll密度梯度離心法富集食物勻漿中的大腸埃希菌O157∶H7，通過細菌的富集，減少后續(xù)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測細菌時的干擾因子。Arakaki等[7]將該法用于宿主細胞中鮭魚立克次體的富集，在所選用的不同濃度Percoll液中，發(fā)現(xiàn)30%的Percoll液最適于立克次體的富集。此外，該法還可用于紅細胞內(nèi)伯氏瘧原蟲的分離等。密度梯度離心法富集微生物的缺點在于成本昂貴，可處理的樣品種類、體積有限，且難以實現(xiàn)不同種類微生物的分離，因而造成大量微生物丟失。由于分離介質(zhì)等干擾因素的存在，需對富集后的微生物進行洗滌處理，整個實驗過程較為繁瑣。

2 分離、富集細菌的生物親和方法及其應(yīng)用

生物親和法是指利用2種物質(zhì)的高親和性，如通過抗體和抗原特異識別或基團共價結(jié)合等，純化和分離靶物質(zhì)。磁性分離技術(shù)是生物親和分離法的一種，分為非特異性與特異性(免疫)磁性分離(immunomagnetic separation, IMS)2類。

2.1 細菌的非特異性磁性分離

未經(jīng)包被單克隆抗體的超順磁性Fe3O4粒子為裸磁珠。有研究表明[6]，裸磁珠可非特異性吸附細菌，對大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌、副溶血性弧菌等常見病原菌的富集率高達98%。對裸磁珠非特異性吸附細菌的吸附率、實驗條件及參數(shù)進行優(yōu)化(如磁珠規(guī)格、保存方法、用量、孵育時間及溫度等)，將為裸磁珠在細菌富集領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

除裸磁珠外，可用于細菌富集的材料還有生物納米磁珠(bacterial magnetic particle, BacMP)、蒙脫石(montmorillonite, MMT)等。生物納米磁珠是在磁性細菌(magnetic bacteria)菌體內(nèi)形成，直徑50～100 nm。磁珠中心主要成分為超順磁性Fe3O4顆粒，外層包被約14 nm有機生物膜，與人工合成磁珠的包被層相比，其厚度均勻，與中心磁珠結(jié)合緊密，不易脫落，易于進行化學(xué)修飾及抗體包被，且在溶液中的分散度好，便于提取，成本低廉[7]。生物納米磁珠已被用于多種細菌的富集和檢測[8]及細菌DNA抽提[9]。蒙脫石是一種硅酸鹽礦物，含有2層硅氧四面體中間夾有鋁氧八面體的“車廂式”結(jié)構(gòu)，各層間產(chǎn)生強弱不同的永久性負(fù)電荷，該“車廂式”結(jié)構(gòu)能將細菌固定到“車廂”中。研究發(fā)現(xiàn)，納米蒙脫石顆粒對多種細菌如大腸埃希菌、霍亂弧菌、空腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌均有較好的吸附作用。但蒙脫石只吸附表面帶有粒編碼蛋白(CS31A)的病原菌，對表面不帶CS31A的正常菌群無吸附作用。蒙脫石一般用于治療腹瀉，對其在微生物富集和檢測方面的報道尚為少見[10]。

2.2 細菌的免疫磁性分離

免疫磁性分離技術(shù)是利用包被有單克隆抗體的納米磁珠，與含有相應(yīng)抗原的靶物質(zhì)結(jié)合，通過磁場作用將結(jié)合有靶物質(zhì)的磁珠富集，從而達到純化、富集目的。免疫磁珠由超順磁性Fe3O4顆粒構(gòu)成核心，其外包被氧化硅或多聚物如聚苯乙烯、聚氯乙烯等，外層也可連接各種基團。不同磁珠包被材料有不同用途，根據(jù)氧化硅可特異性吸附核酸的特性。通常將包被氧化硅的免疫磁珠用于核酸的富集和分離；而包被聚苯乙烯的免疫磁珠可結(jié)合羧基、氨基等，多用于蛋白的分離和純化；也可根據(jù)實驗需要將特異性單克隆抗體包被于裸磁珠上而發(fā)揮不同用途。此外，磁珠顆粒的直徑、表面基團等也對富集效率有影響。磁珠的直徑及其均勻度影響其在溶液中的分散度、磁響應(yīng)度、聚集力等，各種直徑規(guī)格及用途的磁珠均在不斷研發(fā)中，典型的磁珠直徑有1.0 μm、2.8 μm、4.5 μm等。1.0 μm常用于體外診斷和高通量分析，2.8 μm磁珠多用于富集蛋白質(zhì)、多肽、抗體、酶、激素、受體等，4.5 μm磁珠常用于富集細胞或細胞器等。磁珠的表面基團種類繁多(如羧基、氨基、甲苯磺?；?、環(huán)氧基、醛基、羥基、羰基等)，可與抗體、受體、寡核苷酸鏈等結(jié)合，形成磁性生物材料，用于靶向目標(biāo)分子的富集。免疫磁性分離技術(shù)可用于分離核酸、蛋白質(zhì)、病原體及各種細胞等，具有高特異性、高濃縮性、高分離率，且可從大量細胞中篩選出帶有特異性標(biāo)記的極少量細胞而不影響細胞活性。免疫磁性分離技術(shù)因簡便、易行、分離純度高、能保留靶物質(zhì)活性等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)及臨床研究中。磁性分離技術(shù)亦是近年來應(yīng)用于細菌學(xué)診斷的有效方法之一，可將分散在樣品中的少量細菌富集，從而顯著提高細菌的檢測效率，且富集過程僅需10 min～1 h。但磁性分離技術(shù)應(yīng)用于細菌的特異性分離受到包被抗體種類、抗體價格及分離細菌種類等方面的限制。

2.3 磁性分離技術(shù)在病原微生物檢測中的應(yīng)用

目前常用的病原微生物檢測有應(yīng)用顯微鏡等技術(shù)的物理、化學(xué)方法，以及針對病原微生物抗原或抗體的免疫學(xué)方法。這些檢測方法可處理的樣品體積有限，因此有效的病原微生物富集方法顯得尤為重要。隨著研究的日益深入，免疫磁性分離技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、PCR、熒光定量PCR、流式細胞技術(shù)、免疫熒光顯微技術(shù)等相結(jié)合，已被廣泛用于臨床病原微生物的檢測[11]。

2.3.1富集后用于病原微生物的細胞檢測檢測病原微生物細胞主要根據(jù)微生物物理、化學(xué)特性或特異性蛋白直接采用流式細胞技術(shù)、免疫熒光技術(shù)等進行檢測。Hibi等[12]將磁性分離技術(shù)與流式細胞技術(shù)結(jié)合，用于水中黃桿菌冷菌(10～108CFU/ml)快速檢測與計數(shù)。以直徑1 μm的兔抗黃桿菌冷菌IgG抗體包被的羰原微生物核酸的分子生物學(xué)方法，基磁珠作為黃桿菌冷菌磁性富集的固相載體，在抗體上標(biāo)記異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)對富集后的細菌用流式細胞儀進行檢測與計數(shù)，發(fā)現(xiàn)流式細胞計數(shù)與磁性分離技術(shù)結(jié)合后，可將黃桿菌冷菌檢測的靈敏度從106CFU/ml提高至10 CFU/ml，整個細菌檢測過程可在2 h內(nèi)完成。還有學(xué)者將磁性分離技術(shù)與側(cè)向流動技術(shù)(lateral flow method)結(jié)合，用于檢測水中和奶制品中的炭疽桿菌芽胞[13]。此外，磁性分離技術(shù)還被廣泛用于各種免疫分析，如熒光免疫分析、酶化學(xué)發(fā)光免疫分析等[14]。磁珠結(jié)合一抗或二抗后，可用于微生物的分離與定量，可省去離心步驟，節(jié)約時間，簡化操作，且顯著提高檢測效率與準(zhǔn)確性。有學(xué)者采用熒光免疫分析法，將FITC與抗大腸埃希菌單克隆抗體結(jié)合，并固定于生物納米磁珠上，用于檢測和去除大腸埃希菌。免疫磁性分離技術(shù)已被用于富集與檢測多種病原微生物，如人糞便中的幽門螺桿菌、尿液中血吸蟲循環(huán)抗原以及水體中的賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊等[15]。

2.3.2富集后用于病原微生物的核酸檢測利用免疫磁性分離技術(shù)捕獲樣品中的靶病原菌，可顯著提高病原菌核酸檢測效率。有研究將免疫磁性分離與PCR結(jié)合，用于人血清和尿液中細螺旋體的檢測。他們用包被抗LipL32單克隆抗體的蛋白A磁珠，首先對人血清和尿液中細螺旋體進行富集，再用PCR檢測富集后的細螺旋體，檢測效率高達162 CFU/ml。

2.3.3富集后用于病原特異性蛋白的檢測有學(xué)者[16]將免疫磁性分離技術(shù)與激光解離質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，檢測金黃色葡萄球菌腸毒素蛋白B。此外，有關(guān)病原菌磁性分離的試劑盒產(chǎn)品已有許多，如大腸埃希菌、沙門菌、李斯特菌、軍團菌磁性分離試劑盒。基本原理是通過磁珠表面的高親和力抗體與病原菌表面標(biāo)記物結(jié)合來分離靶細菌，整個分離、富集過程僅需1 h，檢測效率及自動化程度均明顯提高。

3 微生物富集的其他方法

除以上常用微生物富集方法外，最近有學(xué)者[17]將微流體技術(shù)與熒光激活細胞分選技術(shù)用于人全血(紅細胞濃度約108/ml)中大腸埃希菌的富集，可將全血中的大腸埃希菌濃縮300倍。微流體技術(shù)是指在微觀尺寸下控制、操作和檢測復(fù)雜流體的技術(shù)，可將流體樣品的制備、生化反應(yīng)、結(jié)果檢測等步驟集成到生物芯片上(如樣品DNA制備、PCR反應(yīng)、電泳檢測)，使實驗所用流體的量從毫升、微升級降至納升或皮升級。此外，還有學(xué)者根據(jù)細菌的特性，采用凝膠吸附方法富集靶細菌。Kuyukina等[18]根據(jù)紅球菌具有與烷烴高親和的特性，應(yīng)用多聚丙烯酰胺凍凝膠，在含多種細菌的培養(yǎng)基中特異性地吸附紅球菌，富集效率達72%。原理是細菌通過表面蛋白與凝膠中的配基發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附到凝膠上，從而達到細菌的富集和分離。

4 結(jié)語

微生物富集作為提高微生物檢測效率的有效途徑，在生物醫(yī)學(xué)及臨床等領(lǐng)域一直備受關(guān)注。常用的微生物富集方法有過濾法、離心法、磁性分離法等。過濾法和離心法是根據(jù)微生物的物理特性，非特異性地富集微生物，適用的菌種較廣泛，但在實際應(yīng)用方面存在一定不足。如過濾法容易出現(xiàn)堵塞濾孔，無法用于黏稠樣品中的微生物富集及特異性分離靶微生物等。密度梯度離心存在成本高、操作繁瑣、靈敏度低等不足，仍需進一步改進，提高特異度及靈敏度，簡化操作。磁性分離技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、分子生物學(xué)、生物動力學(xué)、基因工程等各領(lǐng)域，包括高通量的核酸、蛋白質(zhì)、細胞及細胞器、微生物的分離，免疫分析，病原體檢測，生物大分子之間相互作用的研究等。隨著激光質(zhì)譜、微陣雜交[19]等高新檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，磁性分離技術(shù)與之結(jié)合將有更大的應(yīng)用空間?？傊虼判苑蛛x技術(shù)具有快速、低成本、可自動化調(diào)節(jié)、高特異度等優(yōu)點，故在分離技術(shù)的自動化與微型化方面有廣闊的應(yīng)用前景。

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