廖順花，吳燕燕，王易

上海中醫(yī)藥大學(xué)免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室，上海 201203

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是定植于人胃黏膜的螺旋狀微需氧革蘭陰性菌，其感染與人類慢性胃炎、消化性潰瘍、胃腺癌和胃淋巴瘤的發(fā)病相關(guān)。幽門螺桿菌致病物質(zhì)包括尿素酶、鞭毛、菌毛以及2種外毒素——空泡毒素A(vacuolating cytotoxin A，VacA)、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(cytotoxin-associated protein A，CagA)，其中細(xì)胞毒素相關(guān)基因(cytotoxin-associated gene,cag)致病島及其編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)(type Ⅳ secretion system，T4SS)更引人關(guān)注。

1 幽門螺桿菌cag致病島

1.1 致病島

致病島是細(xì)菌染色體上具有典型結(jié)構(gòu)特征的基因簇，主要編碼與細(xì)菌毒力相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白及代謝產(chǎn)物。其基本特征：20～100 kb的染色體基因簇；基因簇兩側(cè)一般具有重復(fù)序列和插入元件；基因簇通常位于細(xì)菌染色體的tRNA基因位點近側(cè)，或與噬菌體整合有關(guān)的位點；基因簇DNA G+C mol%、密碼使用與細(xì)菌染色體其他部分差異明顯；基因簇編碼產(chǎn)物多為分泌性蛋白及細(xì)胞表面蛋白，也可編碼細(xì)菌的分泌系統(tǒng)、信息轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。

根據(jù)G+C mol%的差異，致病島分成高G+C致病島和低G+C致病島。幽門螺桿菌致病島屬低G+C類型[1]。根據(jù)致病島DNA片段G+C mol%的明顯差異及兩側(cè)具有的插入元件，推測幽門螺桿菌致病島可能來自噬菌體或質(zhì)粒，是基因轉(zhuǎn)移的產(chǎn)物。

1.2 cag致病島的結(jié)構(gòu)特點

Censini等[2]在比較Ⅰ型(Vac陽性、CagA陽性)和Ⅱ型(Vac陰性、CagA陰性)幽門螺桿菌的遺傳學(xué)差異時發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型菌株含有一個大約40 kb的特殊DNA片段，具有致病島的典型特征，定名為cag致病島。其編碼蛋白與已發(fā)現(xiàn)的其他細(xì)菌如根瘤農(nóng)桿菌、百日咳桿菌、布魯桿菌、空腸彎曲菌、嗜肺軍團菌編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白高度同源，系毒素與毒素轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白共同組成的分泌系統(tǒng)，故cag致病島被認(rèn)為是幽門螺桿菌重要的致病原。

cag致病島含有30多個基因，序列非常保守，認(rèn)為是通過水平轉(zhuǎn)移方式來源于質(zhì)?；蚴删w。研究表明，只有具備完整cag致病島的幽門螺桿菌菌株才有致病性，且被認(rèn)為是幽門螺桿菌毒力增強的可靠標(biāo)志。核酸序列分析顯示，插入的序列IS605將cag致病島分割為cagⅠ區(qū)和cagⅡ區(qū)，完整的cag致病島結(jié)構(gòu)應(yīng)包含這2個區(qū)域。

以幽門螺桿菌26695菌株為例(已完成測序的標(biāo)準(zhǔn)菌株)，位于3′端cagW(5′-3′)之后，cagⅠ區(qū)共有16個基因，自3′端至5′端依次為cagA(5′-3′)、cagB(3′-5′)、cagC(3′-5′)、cagD(3′-5′)、cagE(3′-5′)、cagF(3′-5′)、cagG(3′-5′)、cagH(3′-5′)、cagI(3′-5′)、cagL(3′-5′)、cagN(5′-3′)、cagM(5′-3′)、cagO(3′-5′)、cagP(3′-5′)、cagQ(3′-5′)、cagR(5′-3′)。cagⅡ區(qū)共有14個基因，3′端為cagS(3′-5′)，其后依次為cagT/cag19(5′-3′)、cag18(5′-3′)、cag17(3′-5′)、cag16(3′-5′)、cag15(3′-5′)、cag14/13(3′-5′)、cag12(3′-5′)、cag11(3′-5′)、cag10(3′-5′)、cag9(5′-3′)、cag8(5′-3′)、cag7(5′-3′)、cag6(5′-3′)。其中cagⅠ區(qū)的cagF、cagE基因及cagⅡ區(qū)的cagT/cag19、cag15、cag12、cag11、cagS基因參與幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)的編碼。未參與幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)編碼的基因產(chǎn)物，大多屬于功能未知蛋白。

1.3 cag致病島的病理學(xué)意義

研究發(fā)現(xiàn)，cag致病島中多數(shù)基因產(chǎn)物無直接致病作用，其間接致病作用與幽門螺桿菌的另一個重要毒力因子——VacA的產(chǎn)生、毒性作用形成及宿主細(xì)胞的炎癥因子系統(tǒng)激活有關(guān)。

VacA是幽門螺桿菌的另一個重要毒力因子，由vacA基因編碼，是一種分泌型蛋白毒素。VacA能改變細(xì)胞膜，形成跨膜離子通道，導(dǎo)致酸性水解酶釋放，引起細(xì)胞腫脹，伴隨包膜融合，最終使靶細(xì)胞發(fā)生空泡樣變性。該毒素與感染者胃腸上皮細(xì)胞損傷和潰瘍形成密切相關(guān)。流行病學(xué)研究顯示，cag致病島與VacA毒素的產(chǎn)生有關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為，cag致病島的獲得可促使vacA基因進化，其在幽門螺桿菌基因組中的整合是VacA活化的一個啟動因素，因為vacA基因雖然存在于Ⅰ型和Ⅱ型菌株，但在Ⅱ型菌株中不表達(dá)或僅表達(dá)具有免疫反應(yīng)性而無毒性的分子。Pahl等[3]提出這樣一種假說，vac基因以一個前體分子存在，cag致病島的遺傳變化使其形成功能性基因，從而使感染的低毒菌株獲得更多毒力因子。Atherton等[4]研究發(fā)現(xiàn)，CagA的表達(dá)與VacA的基因型存在一定聯(lián)系，提示cag致病島與vacA存在某種功能上的聯(lián)系。cag致病島編碼的一種或幾種蛋白質(zhì)是否促進VacA的運輸還有待進一步研究證實。但有文獻顯示，cag11編碼產(chǎn)物的同源物在嗜水氣單胞菌中作為Ⅱ型分泌系統(tǒng)的組成成分存在[5]。新近研究[6]發(fā)現(xiàn)，在作用機制上，CagA蛋白與VacA也存在相關(guān)性。CagA蛋白通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)注入胃上皮細(xì)胞，與胃上皮緊密連接的支架蛋白(scaffold protein)ZO-1及跨膜蛋白結(jié)合分子形成復(fù)合物，在細(xì)菌附著處形成緊密連接元件的異位接合，并導(dǎo)致頂端接合的絡(luò)合物組成和功能異常，使上皮細(xì)胞間的緊密連接打開，有利于VacA穿越上皮細(xì)胞屏障，進入胃黏膜下層，影響宿主免疫系統(tǒng)。

在幽門螺桿菌感染的炎癥反應(yīng)中，除CagA誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)外，cag致病島編碼的外膜蛋白大部分可激活核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)，以促進白細(xì)胞介素8(interleukin 8，IL-8)的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，cag致病島中的cagE、cagG、cagH、cagI、cagL、cagM為誘導(dǎo)IL-8在胃上皮細(xì)胞合成所必需，cagE產(chǎn)物在體內(nèi)胃黏膜炎癥反應(yīng)中起重要作用。也有研究認(rèn)為，cagE與cagA有協(xié)同作用，誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-8的cagA陽性菌株其cagE也呈陽性。因此，有學(xué)者認(rèn)為，作為cag致病島存在的標(biāo)志，cagE可能優(yōu)于cagA。另有報道，幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎患者IL-12水平明顯增高，而腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF α)、IL-1β、IL-6等與炎癥程度相關(guān)的細(xì)胞因子并沒有明顯變化。而IL-17 mRNA的翻譯和蛋白表達(dá)水平在幽門螺桿菌感染者中較非感染者明顯增高(IL-8在很大程度上受IL-17調(diào)節(jié))[7]。

2 cag致病島編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)

2.1 細(xì)菌分泌系統(tǒng)

細(xì)菌分泌系統(tǒng)是由多種效應(yīng)蛋白組成的并連接革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)、外膜的一種跨膜轉(zhuǎn)運裝置，目前至少發(fā)現(xiàn)了5種類型(Ⅰ～Ⅴ型)。其中經(jīng)周漿間隙分步轉(zhuǎn)運的類型屬兩步分泌途徑，有Ⅱ型和Ⅴ型分泌系統(tǒng)。而不經(jīng)周漿間隙轉(zhuǎn)運的類型為一步分泌途徑，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型分泌系統(tǒng)。兩步分泌途徑的組成需要Sec蛋白家族參與，又稱Sec依賴型分泌系統(tǒng)。一步分泌途徑鮮見Sec蛋白家族參與，稱Sec非依賴型分泌系統(tǒng)；而cag致病島編碼的分泌系統(tǒng)則為Sec依賴型的Ⅳ型分泌系統(tǒng)。

2.2 幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成

Tanaka等[8]在電子顯微鏡下觀察到，cag致病島陽性的幽門螺桿菌菌株有一細(xì)絲呈折疊狀結(jié)構(gòu)從細(xì)胞表面向外突出，而cag致病島陰性菌株無此結(jié)構(gòu)，提示幽門螺桿菌的Ⅳ型分泌系統(tǒng)由cag致病島編碼。

根瘤菌vib系統(tǒng)是公認(rèn)的Ⅳ型分泌系統(tǒng)的研究原型。vib系統(tǒng)由3部分組成，即由具有ATP酶活性的VirB4、VirB11和VirD4組成的內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，由VirB6、VirB7、VirB8、VirB9、VirB10或VirB3組成的連接內(nèi)、外膜核心的跨膜通道結(jié)構(gòu)和由VirB2和VirB5組成的菌毛樣外膜結(jié)構(gòu)[9]。

cag致病島編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)至少由16種蛋白組成，系連接細(xì)菌內(nèi)、外膜的菌毛樣大分子結(jié)構(gòu)。與根瘤菌vib系統(tǒng)相似，也由3部分組成。 CagE、Cag6及Cag11(分別為VirB4、VirB11和VirD4的同源物)組成內(nèi)膜結(jié)構(gòu)；CagE具有ATPase活性并為轉(zhuǎn)運底物提供能量；Cag11作為一種銜接蛋白起耦聯(lián)作用，并為CagA轉(zhuǎn)運所必需；CagW、Cag8、Cag7、 CagT(分別是VirB6、VirB8、VirB10、VirB11的同源物)及CagM、CagI、CagG、CagF 8種成分組成核心跨膜通道，其中CagT-CagX由CagM介導(dǎo)，于外膜形成CagX-CagM-CagT復(fù)合物[10]。CagT作為N端Sec信號序列，是細(xì)菌脂蛋白的典型信號序列，具有穩(wěn)定自身和其他蛋白的作用。Tanaka等用免疫金電子顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌表面的絲狀結(jié)構(gòu)與Ⅳ型分泌系統(tǒng)的主要成分cagT和cagX相關(guān)[8]。有研究者用激光共聚焦掃描電子顯微鏡和免疫場致發(fā)射掃描電子顯微鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌的cagT定位于細(xì)菌外膜上，分布在細(xì)菌表面纖毛樣結(jié)構(gòu)的基底部，推測其可能是分泌素或是與分泌素相關(guān)的脂蛋白，允許Cag14/13和針樣纖毛結(jié)構(gòu)通過，并起穩(wěn)固其他蛋白的作用[8]。Cag7是Ⅳ型分泌系統(tǒng)表面絲狀結(jié)構(gòu)的主要成分，保護Ⅳ型分泌系統(tǒng)免遭胃黏膜中的胃酸侵襲。在慢性感染中，誘導(dǎo)抗原變異而使CagA逃避抗原抗體反應(yīng)，誘導(dǎo)IL-8 產(chǎn)生而穩(wěn)定裝置表面其他成分。也有研究認(rèn)為，Cag7可能是作為一種連接內(nèi)、外膜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。CagF在CagA轉(zhuǎn)運過程早期起類似分子伴侶樣的作用，是CagA轉(zhuǎn)運所必需的重要蛋白[11]。幽門螺桿菌的菌毛樣外膜結(jié)構(gòu)尚不清楚，未鑒定出與根瘤菌VirB2和VirB5具有同源性的蛋白。但有研究表明，CagT、CagX、CagY與幽門螺桿菌胞外菌毛樣結(jié)構(gòu)相關(guān)，這3種成分是根瘤菌核心裝置成分的同源物。也有研究發(fā)現(xiàn)，CagC與根瘤菌菌毛結(jié)構(gòu)中的重要成分VirB2在序列及結(jié)構(gòu)上有一定的相似，其突變株可引起IL-8減少，同時也喪失轉(zhuǎn)運CagA的功能[12]，但幽門螺桿菌的胞外結(jié)構(gòu)也有可能與根瘤菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)的菌毛結(jié)構(gòu)完全不同。

此外，CagM、CagI、CagG、CagF對幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)也具有重要作用，尤其是對CagA的轉(zhuǎn)運，但都與經(jīng)典的vib系統(tǒng)無同源性，也許可將它們視為Ⅳ型分泌系統(tǒng)分泌裝置的新成員[13]。

2.3 幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)的作用機制

幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)對真核細(xì)胞信號的干擾作用主要是通過cag致病島編碼的疏水性毒素蛋白CagA來實現(xiàn)的。CagA相對分子質(zhì)量為(120～145)×103，N端相對保守，C端變異較大。體外實驗研究顯示，CagA具有類似真核細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中接頭蛋白(adaptor protein)的作用，產(chǎn)生與真核細(xì)胞Gab家族接頭蛋白類似的生物學(xué)作用(與Gab無同源性)。雖然CagA是目前唯一確定的由幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至宿主細(xì)胞的毒素蛋白。但Franke等研究發(fā)現(xiàn)，除CagA外，Ⅳ型分泌系統(tǒng)可能還轉(zhuǎn)運其他蛋白，促使宿主細(xì)胞內(nèi)C-Met磷酸化，繼而激活基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP-2)和MMP-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而促進細(xì)胞增殖[14]。

CagA由Ⅳ型分泌系統(tǒng)注入真核細(xì)胞后，直接進入宿主細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，經(jīng)Src激酶酪氨酸磷酸化作用，易位的CagA與含SH2的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶2(Src homology 2 domain-containing phosphotyrosine phosphatase 2，SHP-2)形成絡(luò)合物，活化下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排，使細(xì)胞形態(tài)呈蜂鳥樣改變[15]；同時促進細(xì)胞增殖，表現(xiàn)出生長因子樣效應(yīng)[16]。CagA也可與Grb2結(jié)合，經(jīng)Ras/MEK/ERK MAPK途徑，使細(xì)胞蜂鳥樣改變，并促進細(xì)胞增殖[17]。近期研究表明，雖然CagA陽性幽門螺桿菌誘導(dǎo)IL-8表達(dá)的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于CagA陰性菌株，但是剔除CagA并不影響NF-κB、MAPK的激活和IL-8的生成，提示CagA陽性幽門螺桿菌引發(fā)的IL-8生成尚有其他調(diào)控因素。但Selbach等研究[18]發(fā)現(xiàn)，所有接觸依賴Ⅳ型運載體復(fù)合物的virB樣基因敲除株及缺失整個cag致病島的突變株不能分泌IL-8，認(rèn)為細(xì)菌刺激IL-8分泌的能力很大程度上與其易位CagA的能力有關(guān)。插入及缺失突變研究顯示，cag致病島及其所編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)通過介導(dǎo)CagA與真核細(xì)胞的連接可激活核轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB表達(dá)，致細(xì)胞表面形狀改變及基墊結(jié)構(gòu)形成，并激活活化蛋白1(activator protein 1，AP-1)等轉(zhuǎn)錄因子，經(jīng)ERK/MAPK級聯(lián)反應(yīng)引起c-fos、c-jun原癌基因活化[19,20]。

3 結(jié)語

決定幽門螺桿菌致病性的cag致病島及其所編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)將成為一個重要的藥物靶標(biāo)，如果Ⅳ型分泌系統(tǒng)能被封閉或表達(dá)受到抑制，就可使致病的幽門螺桿菌回歸為正常的消化道菌群，以收“改邪歸正”之功效。

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