116021 解放軍第210醫(yī)院 劉亞萍 李溪 戴林

隨著對應(yīng)激機(jī)制研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)應(yīng)激時除有神經(jīng)-內(nèi)分泌以及相關(guān)的功能代謝改變外，還有細(xì)胞水平的變化。這種當(dāng)細(xì)胞處于不利環(huán)境和遇到有害刺激時所產(chǎn)生的防御或適應(yīng)性反應(yīng)稱為細(xì)胞應(yīng)激，它存在于從單細(xì)胞生物到高等動物所有的生物體內(nèi)[1]。

細(xì)胞應(yīng)激可分為基因毒應(yīng)激(由紫外線、離子射線、過多的活性氧、化學(xué)致畸及致癌物等引起)和非基因毒應(yīng)激(由切應(yīng)力、創(chuàng)傷、感染、缺氧和熱應(yīng)激等引起)兩大類。細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)包括一系列高度有序事件，表現(xiàn)為應(yīng)激原誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和促進(jìn)應(yīng)激基因的快速表達(dá)，合成多種特異性和非特異性的對細(xì)胞有保護(hù)作用的應(yīng)激蛋白質(zhì)，從而對細(xì)胞產(chǎn)生特異和非特異的保護(hù)作用，同時細(xì)胞內(nèi)一些正?；虻谋磉_(dá)受到抑制。

小G蛋白Rho亞家族是一類GTP酶結(jié)合蛋白，它通過其下游效應(yīng)蛋白介導(dǎo)參與調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)功能，涉及到細(xì)胞的骨架重組、生長、凋亡、運(yùn)動等[2-3]。Rho亞家族成員主要有RhoA、RhoB和RhoC，雖然RhoB和RhoA、RhoC在結(jié)構(gòu)上的相似性高達(dá)87%，但它在細(xì)胞內(nèi)定位、不同細(xì)胞周期中的表達(dá)情況以及調(diào)控等許多方面都顯示出其特殊性[4-5]。小G蛋白RhoB至今的研究表明其是一類GTP結(jié)合蛋白，只有與GTP結(jié)合的RhoB(活化的RhoB)才能激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而發(fā)揮復(fù)雜多樣的生物學(xué)效應(yīng)[6]。RhoB屬于即時反應(yīng)基因，可被多種基因毒應(yīng)激因素所誘導(dǎo)，諸如紫外線、化療藥物(如順鉑、5-氟尿嘧啶)等[7-8]，并能抑制某些腫瘤細(xì)胞增生和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9-10]。

1 紫外線(UV)對小G蛋白RhoB的誘導(dǎo)作用

紫外線照射屬于基因毒應(yīng)激，它是通過損傷DNA引起的細(xì)胞應(yīng)激，紫外線依據(jù)波長一般分為UVA(320～400 nm)、UVB(290～320 nm)和UVC(240～290 nm)。其損傷DNA的機(jī)制：UVA主要通過其他分子產(chǎn)生活性氧間接損傷DNA的單個堿基；而UVB和UVC直接被DNA分子吸收，使DNA形成嘧啶二聚體，相鄰2個T，相鄰2個C，C與T之間均可形成二聚體，但最容易形成的二聚體是TT，結(jié)果使其不能與嘌呤配對而致DNA損傷。

Westmark等[11]發(fā)現(xiàn)，在分化細(xì)胞(NIH/3T3)和原代細(xì)胞(NHEK)細(xì)胞中，紫外線照射數(shù)小時后，RhoB上調(diào)，RhoB mRNA的半衰期較對照增加2～3倍，其是通過RNA結(jié)合蛋白類胚胎致死異常視覺1(HuR)結(jié)合到RhoB的3~-非翻譯區(qū)(3~-UTR)而使RhoBmRNA的穩(wěn)定性增強(qiáng)。在紫外線的照射下A18 hnRNP從核到胞質(zhì)的易位，而YB1卻移動到細(xì)胞核，同時HuR在胞質(zhì)積聚。也就是說，UV誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)如甲基化和(或)磷酸化，HuR從核到胞質(zhì)的穿梭運(yùn)動，從而導(dǎo)致了ERGmRNA在胞質(zhì)積聚的穩(wěn)定。HuR以新的方式在細(xì)胞核結(jié)合轉(zhuǎn)錄后的ERGmRNA，通過核膜傳輸mRNA和蛋白的結(jié)合物，并且阻止了胞質(zhì)中核糖核酸酶(RNase)的攻擊信息的傳遞。Fritz等[12-13]發(fā)現(xiàn)當(dāng)紫外線照射30min后，3～4倍增加的RhoBmRNA的半衰期可以被放線菌素D(Act D)阻斷，這個轉(zhuǎn)錄激活過程不依賴p53和c-fos，但是需要完整的CCAAT RhoB的啟動元件。因此，紫外線似乎可以激活RhoB基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因的穩(wěn)定性，同樣在NIH/3T3細(xì)胞中，Blattner等[14]也發(fā)現(xiàn)紫外線可以控制c-fosmRNA的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平。紫外線可能先激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，然后快速的激活絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族的蛋白激酶，如ERK[15]、SAPK/JNK[16]、P38[17]、PI3K/AKT[18]，由它們構(gòu)成二級信號通路。它們激活后可活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，它是由激活I(lǐng)κB激酶(IκK)而特異性地磷酸化IκB，磷酸化的IκB與NF-κB解離，并迅速觸發(fā)泛素-蛋白酶體途徑而降解。NF-κB中的核定位信號由此得以暴露，能夠進(jìn)入細(xì)胞核，通過與κB增強(qiáng)子以及啟動子相互作用而促進(jìn)基因的表達(dá)。活化的胞外細(xì)胞調(diào)節(jié)激酶(ERK)可通過EIk1/TGF的磷酸化促進(jìn)c-fos基因轉(zhuǎn)錄，JNK能使轉(zhuǎn)錄因子c-Jun N端轉(zhuǎn)錄活性區(qū)的Ser63和Ser73磷酸化，提高c-Jun的轉(zhuǎn)錄活性。JNK也可使p53蛋白磷酸化。Bruno Cangulihem[18]的研究表明，UVB能夠誘導(dǎo)人角化細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)中RhoB的表達(dá)，RhoB的上調(diào)通過增加表皮生長因子受體(EGFR)的表達(dá)促進(jìn)AKT的磷酸化(活化)，活化的AKT可抑制Bad和Caspase-9的活性而起到抑制凋亡的作用。

2 缺氧對小G蛋白RhoB的誘導(dǎo)作用

單純性的缺氧或缺血、缺氧可導(dǎo)致缺氧性細(xì)胞應(yīng)激，表現(xiàn)為缺氧作用于細(xì)胞上的氧感受器，啟動細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活作為轉(zhuǎn)錄因子的缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)或HIF-1α樣因子(HLF)。

細(xì)胞內(nèi)氧的降低，也就是缺氧，存在于心臟病、急性和慢性血管疾病、肺部疾病和腫瘤中。哺乳動物細(xì)胞通過其保守的缺氧反應(yīng)通路能感覺氧含量降低的水平，其也參與了生理方面的反應(yīng)，如胚胎發(fā)育時期血管的形成及腫瘤的病理過程。尤其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程和對放射療法的抵抗方面，缺氧是一重要的選擇力。HIF-1是基本的自身氧環(huán)境的調(diào)節(jié)器，其通過控制一系列的靶基因來參與血管增生、糖酵解、細(xì)胞增生和pH調(diào)節(jié)。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β兩個亞單位組成的異二聚體。由于HIF-1β是組成性表達(dá)，因此細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的水平依賴于氧的含量。在正常氧含量的情況下，HIF-1α是由氧依賴的特殊的脯氨酰羥化酶組成的脯氨酰羥化物，其需要氧、亞鐵離子和2-酮戊二酸來激活。已經(jīng)知道的有3種脯氨酰羥化酶，但是最近的研究表明脯氨酰羥化酶2是常氧狀態(tài)下HIF-1α低水平狀態(tài)下關(guān)鍵的氧傳感器[19]。低氧時，脯氨酰羥化酶停止其功能，HIF從降解中解離出來。除此以外，缺氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也需要激酶/磷酸酶的激活。Wang等[20]的研究指出，在細(xì)胞治療的時候用酪氨酸激酶抑制劑或蘇/色氨酸抑制劑磷酸酶的抑制劑及氟化鈉都可以阻斷缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α的表達(dá)。除此以外，PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)的HIF的激活[21]。例如，Zhong等[22]的研究表明，在用藥理學(xué)物質(zhì)治療人前列腺癌細(xì)胞時，PI3K和AKT的靶基因抑制HIF-1α的表達(dá)。有活性的PI3K活化AKT后，依次的抑制糖原合成激酶(GSK-3)自身的Ser21和Ser9的磷酸化。另一方面，GSK-3的活性可以被Tyr279/Tyr216的磷酸化上調(diào)，最新的研究表明，這是細(xì)胞內(nèi)的自磷酸化反應(yīng)[23]。GSK-3第一次被提出可以調(diào)節(jié)糖原合成酶的活性，并且已經(jīng)被證明其是糖原合成的負(fù)調(diào)節(jié)因子，還可以通過磷酸化調(diào)節(jié)許多轉(zhuǎn)錄因子。最近的研究表明，延長缺氧時間可以激活GSK-3β和降低HIF-1α蛋白，表明GSK-3β可以調(diào)節(jié)HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性[21-24]。缺氧時，HIF-1α的穩(wěn)定性可以被許多小G蛋白所控制，包括RhoA、RhoB、Rac1和cdc42。Skuli等[25]的研究表明，在缺氧30min時，RhoB就激活了，表明RhoB可能是抵抗缺氧時的敏感器，它的激活會誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，然后使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)自身的新環(huán)境。他還發(fā)現(xiàn)RhoB調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的水平是由于激活HIF-1α蛋白水解造成的，因此證明了缺氧時RhoB參與了蛋白酶依賴的HIF-1α的調(diào)節(jié)。缺氧時線粒體中ROS的含量會增加，ROS是缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所必須的，缺氧時RhoB可以被ROS激活，其他的小G蛋白在缺氧時也可以通過ROS被激活。RhoB被ROS激活可能也通過特殊的GAP或GEF的調(diào)節(jié)，至于其準(zhǔn)確的機(jī)制，目前尚不清楚，有待于進(jìn)一步的研究。

3 Toxin A對小G蛋白RhoB的誘導(dǎo)作用

Toxin A來自艱難梭狀芽孢桿菌，它是抗生素相關(guān)性腹瀉的主要致病因子，它可以使Rho GTP酶失活[26-27]。RhoB是唯一的膜結(jié)合的，其局限在細(xì)胞膜和早期的內(nèi)含體中[28-30]，它促進(jìn)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞凋亡的過程可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞表面受體的的胞內(nèi)運(yùn)輸來完成的[31]。已有的研究表明DNA損傷誘導(dǎo)的凋亡尤其需要RhoB的參與，盡管RhoB不直接誘導(dǎo)凋亡。早期的研究表明，RhoB積極的參與細(xì)胞的增生，但是近期的研究表明RhoB更多是細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)劑，而不是誘導(dǎo)劑。因此，RhoB成為抗腫瘤治療過程中一個有希望的靶基因。

Gerhard等[32]的研究表明，Toxin A可以使RhoB蛋白持續(xù)上調(diào)，其在8 h達(dá)到穩(wěn)定，可以持續(xù)24 h，但是由于RhoB的半衰期大約是2 h，因此，長時間上調(diào)的RhoB可能是由抑制RhoB降解的抑制劑造成的。但是抑制新蛋白合成的抑制劑放線菌素可以完全阻止RhoB的合成。當(dāng)在穩(wěn)定狀態(tài)時加入放線菌素時，可以導(dǎo)致RhoB水平快速的下降。因此，在加入Toxin A 8 h后，其長期持續(xù)的新蛋白的合成和蛋白的降解，達(dá)到了平衡狀態(tài)，在此情況下，RhoB起蛋白轉(zhuǎn)換作用。因?yàn)镽hoB是Toxin A的底物，它是直接由葡萄糖基化作用引起的失活，應(yīng)該導(dǎo)致靶細(xì)胞中葡萄糖基化作用后失活的RhoB增加。可是意想不到的是，大量增加的RhoB只有部分是葡萄糖基化作用后的，仍有大約40%是未修飾的RhoB。實(shí)驗(yàn)表明，未修飾的RhoB至少有部分是激活的。在用Toxin A處理后的細(xì)胞中新合成的RhoB大部分定位于細(xì)胞膜，而不是內(nèi)含體，這些胞膜上的RhoB沒有發(fā)現(xiàn)RhoA信號通路的孤兒核作用的調(diào)節(jié)蛋白，這些就是激活了的RhoB。他們還發(fā)現(xiàn)RhoB的上調(diào)是由Toxin A糖基化后的Rac1引起的，其是通過阻斷PI3K/AKT通路來完成的?？傊琓oxin A可以通過p38 MAPK誘導(dǎo)小G蛋白RhoB的上調(diào)，上調(diào)的RhoB僅僅部分失活，大部分的RhoB激活，并形成下游的信號通路。因此，Toxin A不再完全是小G蛋白的抑制劑，它也可以激活小G蛋白，其可以有助于對Toxin的治療方法。但是Toxin在體內(nèi)引起的促反應(yīng)仍有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，應(yīng)激反應(yīng)是個復(fù)雜的過程。表現(xiàn)為一種應(yīng)激原常能同時或順次激活幾條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，不同應(yīng)激原可激活多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。激活的信號能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和(或)提高其轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生生物效應(yīng)。轉(zhuǎn)錄因子之間存在相互促進(jìn)或抑制的作用，其生物效應(yīng)也可能相反。這表明應(yīng)激反應(yīng)在分子水平存在非常復(fù)雜的反應(yīng)和巧妙的調(diào)控機(jī)制。至于小G蛋白RhoB至今的研究表明其是一類GTP結(jié)合蛋白，只有與GTP結(jié)合的RhoB(活化的RhoB)才能激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而發(fā)揮復(fù)雜多樣的生物學(xué)效應(yīng)。已有的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，應(yīng)激對RhoB的影響不僅能夠誘導(dǎo)其表達(dá)也能夠使其活化[33]。至于應(yīng)激誘導(dǎo)RhoB的機(jī)制和產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，不同的應(yīng)激原其表現(xiàn)不同[34-35]，需要我們今后進(jìn)一步的研究來闡明。

[1]王曉慧，盧建.細(xì)胞應(yīng)激[M]//.金惠銘，盧建，殷蓮華.細(xì)胞分子病理生理學(xué).鄭州：鄭州大學(xué)出版社，2002：127-139.

[2]Goulding NJ，Ogbourn S，Pipitone N，et al.The inhibitory effect of dexamethasone on lymphocyte adhesion molecule expression and intercellular aggregation is not mediated by lipocortin 1[J].Clin Exp Immunol，1999，118(3)：376-383.

[3]Yazawa H，Kato T，Nakada T，et al.Glucocorticoid hormone suppression of human neutrophil-mediated tumor cell cytostasis[J].Int J Cancer，1999，81(1)：74-80.

[4]Lim LH，F(xiàn)lower RJ，Perretti M，et al.Glucocorticoid receptor activation reduces CD11b and CD49d levels on murine eosinophils：characterization and functional relevance[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2000，22(6)：693-701.

[5]Mori N，Horie Y，Gerritsen ME，et al.Anti-inflammatory drugs and endothelial cell adhesion molecule expression in murine vascular beds[J].Gut，1999，44(2)：186-195.

[6]Huang M，Prendergast GC.RhoB in cancer suppression[J].Histol Histopathol，2006，21(2)：213-218.

[7]Zoppi N，Ghinelli A，Gardella R，et al.Effect of dexamethasone on the assembly of the matrix of fibronectin and on its receptors organization in Ehlers-Danlos syndrome skin fibroblasts[J].Cell Biol Int，1998，22(7-8)：499-508.

[8]Lee MJ，Ma Y，LaChapelle L，et al.Glucocorticoid enhances transforming growth factor-beta effects on extracellular matrix protein expression in human placental mesenchymal cells[J].Biol Reprod，2004，70(5)：1246-1252.

[9]Kappert K，Schmidt G，Doerr G，et al.Angiotensin II and PDGF-BB stimulate beta(1)-integrin-mediated adhesion and spreading in human VSMCs[J].Hypertension，2000，35(1Pt2)：255-261.

[10]Fukuda K，Xie RL，Chiu JF.Bidirectional morphological changes induced by dexamethasone in Morris hepatoma cell lines McA-RH7777 and McA-RH8994：independence of fibronectin and its receptor[J].Exp Cell Res，1991，195(1)：207-213.

[11]Westmark CJ，Bartleson VB，Malter JS.RhoB mRNA is stabilized by HuR after UV light[J].Oncogene，2005，24(3)：502-511.

[12]Fritz G，Kaina B.Transcriptional activation of the small GTPase gene rhoB by genotoxic stress is regulated via a CCAAT element[J].Nucleic Acids Res，2001，29(3)：792-798.

[13]Fritz G，Kaina B，Aktories K.The ras-related small GTP-binding protein RhoB is immediate-early inducible by DNA damaging treatments[J].J Biol Chem，1995，270(42)：25172-25177.

[14]Blattner C，Kannouche P，Litfin M.UV-Induced stabilization of c-fos and other short-lived mRNAs[J].Mol Cell Biol，2000，20(10)：3616－3625.

[15]Chen W，Tang Q，Gonzales MS，et al.Role of p38 MAP kinases and ERK in mediating ultraviolet-B induced cyclooxygenase-2 gene expression in human keratinocytes[J].Oncogene，2001，20(29)：3921-3926.

[16]Assefa Z，Garmyn M，Bouillon R，et al.Differential stimulation of ERK and JNK activities by ultraviolet B irradiation and epidermal growth factor in human keratinocytes[J].Invest Dermatol，1997，108(6)：886-891.

[17]Pillaire MJ，Nebreda AR，Darbon JM.Cisplatin and UV radiation induce activation of the stress-activated protein kinase p38gamma in human melanoma cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2000，278(3)：724-728.

[18]Bruno Canguilhem，Anne Pradines.RhoB Protects Human Keratinocytes from UVB-induced Apoptosis through Epidermal Growth Factor Receptor Signaling[J].The Journal of biological chemistry，2005，280(52)：43257-43263.

[19]Berra E，Benizri E，Ginouves A，et al.HIF prolyl-hydroxylase 2 is the key oxygen sensor setting low steady-state levels of HIF-1alpha in normoxia[J].EMBO，2003，22(16)：4082-4090.

[20]Wang GL，Jiang BH，Semenza GL.Effect of protein kinase and phosphatase inhibitors on expression of hypoxia-inducible factor1[J].Biochem Biophys Res Commun，1995，216(2)：669-675.

[21]Mottet D，Dumont V，Deccache Y，et al.Regulation of hypoxia-inducible factor-1alpha protein level during hypoxic conditions by the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3beta pathway in HepG2 cells[J].J Biol Chem，2003，278(33)：31277-31285.

[22]Zhong H，Chiles K，F(xiàn)eldser D，et al.Modulation of hypoxia-inducible factor 1alpha expression by the epidermal growth factor/phosphatidylinositol 3-kinase/PTEN/AKT/FRAP pathway in human prostate cancer cells：implications for tumor angiogenesis and therapeutics[J].Cancer Res，2000，60(6)：1541-1545.

[23]Cole A，F(xiàn)rame S，Cohen P.Further evidence that the tyrosine phosphorylation of glycogen synthase kinase-3(GSK3)in mammalian cells is an autophosphorylation event[J].Biochem J，2004，377(Pt 1)：249-255.

[24]Sodhi A，Montaner S，Miyazaki H，et al.MAPK and Akt act cooperatively but independently on hypoxia inducible factor-1alpha in rasV12 upregulation of VEGF[J].Biochem Biophys Res Commun，2001，287(1)：292-300.

[25]Nicolas Skuli，Sylvie Monferran，Caroline Delmas.Activation of RhoB by Hypoxia controls hypoxia-inducible factor-1α stabilization through glycongen synthase kinase-3 in U87 glioblastoma cells[J].Cancer Res，2006，66(1)：482-489.

[26] Just I，Hofmann F，Aktories K.Molecular mode of action of the large clostridial cytotoxins[J].Curr Top Microbiol Immunol，2000，250：55-83.

[27]Just I，Hofmann F，Genth H，et al.Bacterial protein toxins inhibiting low-molecular-mass GTP-binding proteins[J].Int J Med Microbiol，2001，291(4)：243-250.

[28]Adamson P，Paterson H F，Hall A.Intracellular localization of the P21rho proteins[J].J Cell Biol，1992，119(3)：617-627.

[29]Zalcman G，Closson V，Linare`s-Cruz G，et al.Regulation of Ras-related RhoB protein expression during the cell cycle[J].Oncogene，1995，10(10)：1935-1945.

[30]Michaelson D，Silletti J，Murphy G，et al.Differential localization of Rho GTPases in live cells：regulation by hypervariable regions and RhoGDI binding[J].J Cell Biol，2001，152(1)：111-126.

[31]Singh S P，McDonald D，Hope T J，et al.Upon thyrotropin binding the thyrotropin receptor is internalized and localized to endosome[J].Endocrinology，2004，145(2)：1003-1010.

[32]Gerhard R，Tatge H，Genth H，et al.Clostridium difficile toxin A induces expression of the stress-induced early gene product RhoB[J].J Biol Chem，2005，280(2)：1499-1505.

[33]劉亞萍，李憶東，王曉慧，等.熱應(yīng)激對大鼠肝組織及人前列腺癌PC-3細(xì)胞RhoB表達(dá)的影響[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2007，28(4)：381-384.

[34]Chen YX，Li ZB，Diao F，et al.Up-regulation of RhoB by glucocorticoids and its effects on the cell proliferation and NF-kB transcriptional activity.J Steroid Biochemistry and Molecular Biology[J].JSBMB，2006，101(4-5)：179-187.

[35]陳玉霞，李宗斌，刁飛，等.地塞米松抑制人卵巢癌細(xì)胞HO-8910增殖的分子機(jī)制：RhoB信號通路的作用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86(20)：1400-1404.