邊 原，肖洪濤，陳 璐

Ca2+在人體內(nèi)不但具有重要的生理作用，在組織或細(xì)胞產(chǎn)生病理反應(yīng)時(shí)其濃度還能反映病灶的病變程度，它作為細(xì)胞內(nèi)的信息傳遞物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能、參與信號(hào)跨膜傳遞以及介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)外界刺激的應(yīng)答反應(yīng)等重要作用［1］。因此，組織或細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度測(cè)定方法的研究和改進(jìn)，對(duì)臨床和藥學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究具有重要的意義［2］。

1 45Ca 跨膜流動(dòng)測(cè)定方法

同位素45Ca(T0.5=163 d，β射線能量為0.25 MeV)與生物體中的Ca2+具有相同的生物活性，由于45Ca發(fā)出的β射線能被探測(cè)，因此只要測(cè)量45Ca進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量變化就可快速、直觀地反映出藥物對(duì)Ca2+通道的阻滯特性。平滑肌細(xì)胞膜上一般存在有3種Ca2+通道:① 靜流鈣通道;②受體鈣通道;③電壓依賴鈣通道。欲真實(shí)測(cè)量通過每一種鈣通道進(jìn)入細(xì)胞中45Ca的量，必須除掉在細(xì)胞膜外面的全部45Ca。該法采用冷EGTA絡(luò)和法測(cè)量45Ca進(jìn)人細(xì)胞的量，既能除去細(xì)胞外的45Ca2+，又能確保已進(jìn)人細(xì)胞中的45Ca2+不重新流出細(xì)胞外。國(guó)內(nèi)有研究者［3-4］將此方法用于動(dòng)物組織包括心肌、主動(dòng)脈等所含的Ca2+進(jìn)行測(cè)定，效果較好，同時(shí)為中藥對(duì)鈣通道的影響提供了較好的方法，具有用樣少、操作簡(jiǎn)便、快速靈敏、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。

2 X射線微區(qū)分析方法

X射線微區(qū)分析技術(shù)利用電子束轟擊樣品，產(chǎn)生特征X射線。特征X射線是入射電子激發(fā)外層電子釋放的，其能量和波長(zhǎng)為每種離子所固有，通過這種特性就有可能進(jìn)行元素定性分析，進(jìn)行定量分析的基礎(chǔ)在于特征X射線的強(qiáng)度與樣品中所含元素的濃度有關(guān)。目前X射線微區(qū)分析技術(shù)能夠成功地用于測(cè)量細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器所含的Ca2+濃度［5］。有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣庫(kù)具有非均勻性。研究者通過電刺激海馬神經(jīng)元樹突發(fā)現(xiàn)一些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊狀結(jié)構(gòu)的Ca2+濃度出現(xiàn)非常強(qiáng)勁的增長(zhǎng)，同時(shí)其它一些囊狀結(jié)構(gòu)卻沒有應(yīng)答反應(yīng)［6］。目前此研究法在形態(tài)學(xué)識(shí)別細(xì)胞器內(nèi)Ca2+濃度方面具有最高的分辨率。

3 離子選擇微電極方法

離子選擇性微電極(ISME)是一種能測(cè)定細(xì)胞等生物微環(huán)境內(nèi)單一離子活度的信息傳感器，其主要特點(diǎn)是微型化，尖徑在1 μm內(nèi)，能在不損傷細(xì)胞的情況下，直接插入單個(gè)細(xì)胞內(nèi)，運(yùn)用電位測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的離子濃度。所以IMSE對(duì)研究細(xì)胞的生理功能十分重要，目前廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、臨床檢驗(yàn)和藥物分析等。楊紅蕓等［7］利用自制Ca2+選擇性微電極建立血清樣品中Ca2+測(cè)定方法，研究結(jié)果表明Ca2+-ISME可用于內(nèi)源性藥物鈣制劑的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。

4 核磁共振波譜方法

核磁共振(NMR)波譜方法是無(wú)損傷研究生物樣本的重要手段，能夠在接近生物樣本生理狀態(tài)下連續(xù)動(dòng)態(tài)地進(jìn)行檢測(cè)［8］。19FNMR是細(xì)胞內(nèi)Ca2+測(cè)定的非光學(xué)方法，由于正常生物體內(nèi)含氟成分少，為了得到足夠的響應(yīng)，在檢測(cè)游離Ca2+濃度時(shí)使用含氟指示劑，目前常用的指示劑為nF-BAPTA［n fluoro-1，2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N，N，N′，N′tetraacetic acid］衍生物。nF-BAPTA需經(jīng)過乙酰氧甲酯的化學(xué)修飾(nF-BAPTA-AM)才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，之后水解成為游離酸形式，與細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+結(jié)合形成螯合物Ca2+-nF-BAPTA。根據(jù)所形成的螯合物解離常數(shù)(Kd)不同，可分為快交換型5F-BAPTA和慢交換型4F-BAPTA。用核磁共振檢測(cè)快交換型的5F-BAPTA在NMR波譜圖上得到其結(jié)合和未結(jié)合Ca2+型2個(gè)峰，由兩峰的峰面積比和Kd，可計(jì)算細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度;對(duì)于慢交換型的4F-BAPTA會(huì)出現(xiàn)單峰，利用結(jié)合與未結(jié)合Ca2+型的化學(xué)位移計(jì)算Ca2+濃度［9］。

5 原子吸收分光光度法測(cè)定方法

原子在一般情況下處于能量最低狀態(tài)(基態(tài))。當(dāng)原子吸收外界能量被激發(fā)時(shí)，其最外層電子可躍遷到較高的不同能級(jí)上(激發(fā)態(tài))。處于激發(fā)態(tài)的電子很不穩(wěn)定，一般在極短的時(shí)間便躍回基態(tài)，此時(shí)原子以電磁波的形式放出能量。原子吸收分光光度法是基于光源輻射出具有待測(cè)元素特征波長(zhǎng)的光通過試樣原子蒸氣時(shí)，被蒸氣中待測(cè)元素的基態(tài)原子所吸收，然后利用光被吸收的程度來測(cè)定待測(cè)元素的含量。它具有測(cè)定靈敏度高、檢出限小、干擾少、操作簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)。毛亞倫等［10］利用原子吸收分光光度法、熒光指示劑法以及細(xì)胞膜酶活性法研究感染嚴(yán)重程度與紅細(xì)胞膜鈣泵、細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度關(guān)系，結(jié)果表明感染患者存在細(xì)胞外Ca2+向細(xì)胞內(nèi)流動(dòng)，導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂、損害甚至死亡。

6 熒光指示劑測(cè)定方法

熒光指示劑測(cè)定法是用具有特異性與細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子結(jié)合的熒光探針或染料，以其與鈣離子結(jié)合后熒光強(qiáng)度所發(fā)生改變通過成像、激光共聚焦顯微技術(shù)等測(cè)算細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的一種方法，目前應(yīng)用較為廣泛，常用于測(cè)定細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器Ca2+含量。

6.1 線粒體中［Ca2+］的測(cè)量 目前線粒體中Ca2+濃度的測(cè)量最廣泛應(yīng)用的熒光指示劑為Rhod-2。在乙酰氧甲酯的作用下，Rhod-2帶有的正電荷，可使該指示劑在線粒體中優(yōu)先累積。經(jīng)脫酯后指示劑散落在線粒體中，并且在線粒體囊腔中顯示 Ca2+濃度［11］。

Rizzuto等［12］首先成功的將生物發(fā)光蛋白-水母熒光素定位線粒體中的Ca2+。利用定位線粒體Ca2+的指示劑發(fā)現(xiàn)在血管壁內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)存在大量的Ca2+，并且線粒體Ca2+的濃度迅速發(fā)生變化定位線粒體外葉的水母熒光素顯示，在以肌醇三磷酸(IP3)介導(dǎo)的從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的Ca2+過程中，線粒體比其它細(xì)胞器更易于接收到較高的Ca2+信號(hào)［13］。Montero等［14］使用與線粒體內(nèi)Ca2+具有不同親合性的水母熒光素，并和不同類型的熒光素發(fā)光底物腔腸素重新組合，能夠擴(kuò)大Ca2+濃度測(cè)定的線性范圍。近年來，科學(xué)家開始用人工熒光蛋白cameleon、pericam以及camgaroo等來進(jìn)行Ca2+的濃度測(cè)量。此類研究方法以相應(yīng)的cameleon為基礎(chǔ)表現(xiàn)出線粒體指示劑的定位以及對(duì)Ca2+的敏感程度。此外該研究還使用新型工藝，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)產(chǎn)生有關(guān)Ca2+循環(huán)的在概念方面的重要消息［15］。Rodolf等［16］在生理?xiàng)l件下用指示劑cameleon對(duì)骨骼肌中的Ca2+進(jìn)行測(cè)量，此方法使用了雙光子顯微技術(shù)，解決了線粒體中Ca2+濃度迅速變化而測(cè)定不準(zhǔn)的問題，并具有特異性。

6.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中［Ca2+］的測(cè)定 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是Ca2+釋放的重要細(xì)胞器，其所含的Ca2+已經(jīng)成功的被所有類型的光學(xué)Ca2+探針(包含天然水母熒光素、人工熒光蛋白以及低分子量的熒光指示劑)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的管腔內(nèi)所捕捉到。Demaurex等［17］通過研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用光學(xué)鈣離子探針能夠很成功的快速定位和固定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+。此法相比之前的探針方法有了很大的改進(jìn)。cameleon蛋白的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率不會(huì)影響Ca2+的生理濃度。新型cameleon具有適合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+測(cè)量的Kd值以及具有合理的動(dòng)態(tài)范圍。將鈣網(wǎng)硬蛋白信號(hào)序列以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號(hào)(KDEL)添加到cameleon Design 1(D1)中，從而形成以內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Ca2+為目標(biāo)的 cameleon(D1ER)。Palmer等［18］指出 D1ER在內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Ca2+測(cè)量的敏感度方面提供了相當(dāng)大的改善，要比以往的 cameleon YC4.3ER要優(yōu)越。D1ER與Fura-2的完美結(jié)合，可以用來同步測(cè)量各種比例的細(xì)胞溶質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所含的Ca2+。

Hofer等［19］最早使用低分子量鈣指示劑測(cè)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所含Ca2+濃度。低分子量鈣指示劑Mag-Fura-2的乙酰甲氧酯在胞液和細(xì)胞內(nèi)間隔中積累，隨后通過洋地黃或人參皂苷對(duì)Ca2+作用，使Ca2+經(jīng)由質(zhì)膜選擇性滲透釋放出來，隨后與指示劑作用通過熒光強(qiáng)度得出結(jié)果［20］。Park等［21］使用整體單元形狀貼片夾具方法用來除去細(xì)胞溶質(zhì)的指示劑。此法可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞腔中對(duì)Ca2+濃度的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行記錄并保存質(zhì)膜的完整性。

20世紀(jì)90年代初，Kendall等［22］最早開始嘗試研究可用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+測(cè)量的水母熒光素。由于水母熒光素親合性低，研究者嘗試不同類型的熒光素發(fā)光底物進(jìn)行改進(jìn)。使得該技術(shù)可以用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣的測(cè)量。Demaurex等［23］通過方法改良以及半合成技術(shù)研究出人工水母發(fā)光蛋白嵌合體，能夠適合于在肌漿網(wǎng)細(xì)胞腔中對(duì)Ca2+進(jìn)行測(cè)量。

6.3 內(nèi)體(endosome)以及溶酶體中［Ca2+］的測(cè)量 Ca2+在內(nèi)體以及溶酶體運(yùn)輸過程中具有重要作用。Ca2+指示劑BAPTA可以快速與細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)的Ca2+進(jìn)行螯合，從而可以抑制初級(jí)內(nèi)體的融合作用。Pryor等［24］研究發(fā)現(xiàn)一些Ca2+指示劑還可以抑制次級(jí)內(nèi)體與溶酶體酶的運(yùn)輸小泡的融合作用。目前常使用低親合性鈣指示劑Oregon Green 488 BAPTA-5N測(cè)量?jī)?nèi)體中Ca2+的濃度，此指示劑在初級(jí)內(nèi)體中具有一定程度的耐酸性［25］。研究發(fā)現(xiàn)初級(jí)內(nèi)體的Ca2+濃度相對(duì)較低，Ca2+損失與細(xì)胞器酸化有密切關(guān)系。Christensen等［26］使用Fura-2右旋糖苷以及 Oregon Green BAPTA-1右旋糖酐指示劑測(cè)定Ca2+，發(fā)現(xiàn)來自內(nèi)體的Ca2+的溢出可能參與細(xì)胞器早期的酸化作用。次級(jí)內(nèi)體以及溶酶體的Ca2+濃度遠(yuǎn)超過初級(jí)內(nèi)體的Ca2+濃度。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)次級(jí)內(nèi)體以及溶酶體的相對(duì)較高的Ca2+濃度需要細(xì)胞器內(nèi)的蛋白具有一定的酸性pH值。加入擾亂溶酶體的酸性因子可以導(dǎo)致細(xì)胞器蛋白內(nèi)Ca2+的急劇減少。這說明只要細(xì)胞器的酸性化程度充分，H+/Ca2+交換便可能積累相當(dāng)數(shù)量的Ca2+并且可以作為細(xì)胞器的Ca2+信號(hào)源［27］。

6.4 細(xì)胞核內(nèi)［Ca2+］的測(cè)量 Ca2+離子在細(xì)胞核的生命進(jìn)程中具有重要調(diào)節(jié)作用，包括基因表達(dá)，DNA復(fù)制、蛋白的磷酸化作用，細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用［28］。外部核膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜極其相似，事實(shí)上它是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)薄膜的延長(zhǎng)部分。核膜的胞腔與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連，而內(nèi)部核膜的成分與外部的核膜不同。細(xì)胞核通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型Ca2+-ATP酶積累Ca2+。核膜包含鈣結(jié)合蛋白鈣網(wǎng)硬蛋白以及鈣釋放渠道InsP3Rs、毒蔁堿受體、蘭尼堿受體等［29-30］。細(xì)胞核是一種很大的細(xì)胞器，可以通過熒光Ca2+敏感指示劑和共聚焦顯微技術(shù)與細(xì)胞質(zhì)區(qū)分出來。目前低分子量指示劑廣泛用來測(cè)定Ca2+并比較細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中Ca2+的信號(hào)差異［31］。

通過細(xì)胞核定位信號(hào)，將具有熒光性的Ca2+感應(yīng)蛋白cameleon定位到細(xì)胞核中［32］。改良的 cameleon降低了對(duì)pH的敏感度，其鑲嵌于具有特異性的神經(jīng)元表達(dá)序列被成功的引入到下丘腦部分神經(jīng)元中，這一過程顯示Ca2+在細(xì)胞核和胞質(zhì)調(diào)節(jié)方面存在著一定的差異［33］。Nagai等［34］使用pericam指示劑來監(jiān)測(cè)Ca2+在人子宮頸癌傳代細(xì)胞的細(xì)胞核中的濃度變化，并且對(duì)線粒體初期Ca2+變化進(jìn)行比較。pericam指示劑還用于與細(xì)胞質(zhì)和線粒體指示劑相結(jié)合的心肌細(xì)胞中，該研究顯示了細(xì)胞區(qū)室中的同步Ca2+濃度震蕩過程［35］。

7 總結(jié)

通過對(duì)組織和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)與準(zhǔn)確測(cè)定，能更深入的認(rèn)識(shí)許多生理和病理過程，對(duì)與Ca2+參與的相關(guān)藥物作用機(jī)制的研究有極其重要意義。Ca2+測(cè)定方法不同，同種方法所用的指示劑又不盡相同。但每種測(cè)定方法都有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，因此實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)個(gè)人的實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖屑?xì)選擇正確、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法，以及合理和現(xiàn)有的指示劑與信號(hào)檢測(cè)儀。通過嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以最終獲得成功的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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