張亞妮，段康民

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710069)

活性氧在細(xì)菌耐抗生素機(jī)制中的作用

張亞妮，段康民

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710069)

細(xì)菌對抗生素的耐藥性以驚人的速度蔓延，闡明抗生素導(dǎo)致細(xì)菌死亡內(nèi)在機(jī)制，對提高抗生素藥效以及尋找新型抗生素顯得尤為迫切。近期研究表明，抗生素引起的細(xì)菌內(nèi)活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生，是導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡的關(guān)鍵原因。該文對ROS、SOS和細(xì)菌耐藥性方面的最新研究進(jìn)行了綜述和探討，為開發(fā)新型抗菌藥物，遏制細(xì)菌感染和耐藥性提供新的思路。

抗生素;耐藥性;活性氧;SOS;損傷負(fù)荷;損傷修復(fù)

面對越來越多耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)和抗生素資源漸漸枯竭的雙重危機(jī)，尋找新型抗生素，必須要轉(zhuǎn)移到在細(xì)菌的應(yīng)激反應(yīng)和防御系統(tǒng)中尋找切入點(diǎn)，這樣才能有望遏制細(xì)菌的耐藥性。細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性主要是由其遺傳物質(zhì)的變化引起，包括遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移(質(zhì)粒的接合、噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)、水平基因的轉(zhuǎn)移)，潛在的可動遺傳因子(mobile genetic elements)激活(轉(zhuǎn)座子或隱蔽基因)，以及自身DNA的突變［1］。這些有可能是由于細(xì)菌染色體直接和抗生素之間相互作用的結(jié)果，也可能是由于抗生素引起的活性氧物質(zhì)導(dǎo)致產(chǎn)生的，或者是細(xì)菌中的差錯修復(fù)系統(tǒng)在修復(fù)DNA損害時形成的［2］。以上方面可能是細(xì)菌改變和逃避抗生素抑殺的新機(jī)制，也是在治療細(xì)菌感染時一直忽略的方面。目前研究表明，細(xì)菌面對抗生素時生理應(yīng)答引起的氧化壓力升高，ROS過量產(chǎn)生，是導(dǎo)致細(xì)菌遺傳物質(zhì)變化的主要因素［3－4］。這種生理應(yīng)答包括SOS DNA損傷應(yīng)答［5－6］、熱休克蛋白應(yīng)答［7］、氧化壓力應(yīng)答［8－9］。本文中，我們將討論抗生素怎樣造成細(xì)菌內(nèi)氧化壓力，以及ROS在細(xì)菌耐藥機(jī)制中的作用。

1 抗生素誘導(dǎo)細(xì)菌ROS的形成

越來越多的證據(jù)表明［10－11］，抗生素的存在可引起細(xì)菌內(nèi)氧化壓力升高，ROS過量產(chǎn)生，是導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡的關(guān)鍵原因。ROS是生物體內(nèi)與氧代謝有關(guān)的含氧自由基和易形成自由基的過氧化物的總稱，主要有超氧陰離子、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(·OH)、一氧化氮(NO)等。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除是平衡的，隨著ROS的過量產(chǎn)生或受其它環(huán)境脅迫時，細(xì)胞中的氧化還原平衡即偏向氧化的一邊，此種不平衡的狀態(tài)就會形成氧化壓力(oxidative stress)［12］。ROS處于較不穩(wěn)定的狀態(tài)，其反應(yīng)活性較非自由基高，易與其它分子發(fā)生反應(yīng)［13］。造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)及DNA的傷害，其中以DNA的傷害最為嚴(yán)重。

為了證明細(xì)菌細(xì)胞的死亡與ROS直接相關(guān)，研究針對不同細(xì)菌細(xì)胞靶位的抗生素所帶來的影響。這些抗生素包括:氟喹諾酮類抗生素(作用靶位是拓?fù)洚悩?gòu)酶)、氨基糖苷類抗生素(作用靶位是核糖體)、β-內(nèi)酰胺類(作用靶位是肽聚糖合成)。當(dāng)用革蘭陰性桿菌(大腸埃希菌)和革蘭陽性球菌(金黃色葡萄球菌)測試時，所有三類抗生素都誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生·OH［9］。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一種廣泛存在于生物體中一種非常重要防御氧化損傷的金屬酶，它在維持生物體內(nèi)的產(chǎn)生與消除的動態(tài)平衡中起重要作用。SOD可催化發(fā)生歧化反應(yīng)，從而清除但研究發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮類藥物可以抑制大腸埃希菌中SodA和SodB酶活性，β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類抗生素可以抑制AhpC酶(氫過氧化物還原酶)活性［14］。因此，Dwyers等［2］認(rèn)為殺菌抗生素誘導(dǎo)細(xì)菌死亡途徑中可能存在著一個由OH·介導(dǎo)的共同反應(yīng)機(jī)制。

2 細(xì)菌的損傷修復(fù)

細(xì)菌可通過多種途徑對ROS引起的DNA損傷進(jìn)行修復(fù)［15］。SOS應(yīng)答是DNA受到損傷或復(fù)制受阻時的一種誘導(dǎo)反應(yīng)，在大腸埃希菌中，這種反應(yīng)由recA-lexA系統(tǒng)調(diào)控，正常情況下處于不活動狀態(tài)。當(dāng)有誘導(dǎo)信號如DNA損傷或復(fù)制受阻形成暴露的單鏈時，recA蛋白的蛋白酶活力就會被激活，分解阻遏物lexA蛋白，使SOS反應(yīng)有關(guān)的基因去阻遏而先后開放，產(chǎn)生一系列細(xì)胞效應(yīng)。引起SOS反應(yīng)的信號消除后，recA蛋白的蛋白酶活力喪失，lexA蛋白又重新發(fā)揮阻遏作用。SOS反應(yīng)中易出錯多聚酶的表達(dá)是細(xì)菌發(fā)生突變并產(chǎn)生抗性的關(guān)鍵原因，認(rèn)為只要關(guān)閉SOS系統(tǒng)，即阻止了過度進(jìn)化，就能防止級聯(lián)突變的發(fā)生。正是這種級聯(lián)突變，使大腸埃希菌產(chǎn)生了對抗生素的耐藥性。環(huán)丙沙星會引起lexA蛋白的剪切，細(xì)菌的SOS應(yīng)答，從而誘發(fā)細(xì)菌迅速產(chǎn)生耐藥性［16－17］。

在細(xì)菌細(xì)胞中DNA損傷并不總是被除去，當(dāng)損傷負(fù)荷(lesion burden)超過細(xì)胞修復(fù)機(jī)制所能承受的能力或損傷本身不能被其修復(fù)途徑識別、修復(fù)時，一些DNA損傷會在基因組上暫時保留下來，而帶有大量未修復(fù)損傷的細(xì)胞照樣能進(jìn)行DNA復(fù)制及分裂，這就是DNA的跨損傷合成(translesionsynthesis，TLS)，通常又被稱為損傷旁路(damage bypass)，正是這種跨損傷合成系統(tǒng)的存在使DNA復(fù)制受阻恢復(fù)，細(xì)胞周期繼續(xù)，細(xì)胞耐受其DNA損傷，降低了細(xì)胞對各種DNA損傷因素包括電離輻射殺細(xì)胞效應(yīng)的敏感性，其后果往往是使細(xì)胞更易于發(fā)生突變。

在大腸埃希菌中，損傷誘導(dǎo)的突變由SOS反應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的DNA聚合酶Ⅴ(polⅤ、umuC和umuD基因編碼)來完成［18，19］。在SSB、RecA存在下，polⅤ的跨損傷合成能力增強(qiáng)，導(dǎo)致SOS定標(biāo)性突變(SOS targeted mutagenesis)。當(dāng)復(fù)制未損傷的DNA時，polⅤ也表現(xiàn)出高突變性并且易形成嘌呤或嘌呤、嘧啶或嘧啶錯配，導(dǎo)致SOS非定標(biāo)性突變(SOS nontargeted mutagenesis)［20］。SOS反應(yīng)還啟動dinB基因，編碼polⅣ，polⅣ缺少3'→5'外切酶活性，是低保真度聚合酶，缺乏3'→5'校讀外切核酸酶活性，能以嚴(yán)格分布方式(strictly distributive manner)和延伸鼓出的(bulged)引物/模板結(jié)構(gòu)、錯配的引物/模板能形成滑移中間體(slipped intermediate)［20］。最近的研究結(jié)果［19，21－22］發(fā)現(xiàn)polⅣ可能是細(xì)菌在各種代謝應(yīng)激條件下引發(fā)全基因組范圍突變的主要候選酶。

3 ROS引起的細(xì)菌遺傳物質(zhì)突變

當(dāng)細(xì)菌處于極端逆境下時，它們會嘗試各種方式，將受到的損傷作為突變的初始步驟。然后，它們開啟一些基因，這些基因表達(dá)的蛋白會加速突變的發(fā)生，這類突變的產(chǎn)生速度，比細(xì)胞復(fù)制期間產(chǎn)生突變的速度要快1萬倍。實(shí)質(zhì)上，這些細(xì)胞經(jīng)受了一種迅速的身份轉(zhuǎn)變。例如，大腸埃希桿菌通過發(fā)出SOS，對環(huán)丙沙星和其他抗生素造成的持久性DNA損傷作出應(yīng)答。發(fā)生的突變阻止環(huán)丙沙星結(jié)合其靶標(biāo)——促旋酶，因?yàn)榇傩甘荄NA復(fù)制所必需的。如果細(xì)菌不能阻止環(huán)丙沙星與促旋酶結(jié)合，那么細(xì)菌的DNA就不能正常復(fù)制，以致斷裂，接著細(xì)菌就會死亡。

DNA氧化損傷產(chǎn)物主要有8-氧-脫氧鳥苷(8-oxodG)和2-羥基腺苷(2-OH-A)，其中8-xodG穩(wěn)定，是最重要的產(chǎn)物。在細(xì)菌體內(nèi)，8-oxodG引起DNA損傷的機(jī)制可以使模板鏈中鳥嘌呤(G)的直接氧化，也可以使核苷酸池中游離鳥苷氧化，DNA聚合酶與8-oxodG:A的結(jié)合效率不比正常的G:C配對效率差，因此，如果8-oxodG:C不能得到及時修復(fù)，在復(fù)制中8-xodG易與A錯配，導(dǎo)致G:C→A:T的堿基顛換，從而引起相關(guān)基因功能的改變［23］。目前認(rèn)為，堿基切除修復(fù)系統(tǒng)(base excision repair，BER)在抗氧化損傷中發(fā)揮主要作用，可將氧化的核苷酸前體物或堿基移除，明顯降低8-oxodG的致突變作用，使錯誤堿基不至于結(jié)合進(jìn)入DNA的復(fù)制產(chǎn)物中，進(jìn)而提高基因的穩(wěn)定性［24］。在細(xì)菌體內(nèi)，BER修復(fù)酶基因主要有3種:MutT、MutM、MutY。MutT是1個核苷三磷酸解酶，將氧化的鳥嘌呤腺苷三磷酸(8-oxodGTP)降解為氧化的鳥嘌呤腺苷單磷酸(8-oxodGMP)，這樣單磷酸的核苷酸即無法在復(fù)制時進(jìn)入基因中，避免因氧化的堿基而造成錯配的發(fā)生［25－26］。MutM則是利用它的糖基化酶活性(glycosylase)，從8-oxodG:C的配對中移除8-oxodG，并利用AP裂解酶活性(AP lyase)使DNA中的嘌呤堿基開環(huán)，進(jìn)而形成AP位點(diǎn)，接著再行修復(fù)成為完整的G:C配對。當(dāng)8-oxodG:C的累積超過MutM的修復(fù)時，則過多的8-oxodG:C會產(chǎn)生8-oxodG:A錯配。此時若不經(jīng)修復(fù)，在DNA復(fù)制時將造成永久性的錯配，因此需另1種蛋白質(zhì)參與修復(fù)，即MutY。MutY是一種腺嘌呤糖基酶(adenine glycosylase)，移除與8-oxodG: A堿基錯配中的腺嘌呤，而形成AP位點(diǎn)。當(dāng)腺嘌呤移除后，MutY會確認(rèn)8-oxodG與胞嘧啶形成8-oxodG:C配對后，使得MutM有第2次的機(jī)會可以修復(fù)移除氧化的堿基8-oxodG［27－28］。

4 總結(jié)

抗菌藥物為人類的健康生存和發(fā)展作出了巨大的貢獻(xiàn)，然而隨后出現(xiàn)的細(xì)菌耐藥性問題已經(jīng)發(fā)展到了非常嚴(yán)重的地步，深入了解抗生素的作用機(jī)制及其相關(guān)的耐藥機(jī)制對研制新的有效的抗菌藥物是非常必需的。

將抗生素的耐藥性與因ROS引起的細(xì)菌對大分子破壞SOS反應(yīng)、DNA易誤復(fù)制相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)正不斷增多，這些數(shù)據(jù)可用來開發(fā)新的抗菌藥物。在以前確定新抗生素新靶標(biāo)的工作中，可能沒注意到這些反應(yīng)中的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，因?yàn)樗鼈儗?xì)胞生長一般是非必需的。通過抑制這個網(wǎng)絡(luò)途徑的化合物獲得研制抗生素新概念，同時對統(tǒng)治藥物開發(fā)的“一個化合物對一個靶標(biāo)”的概念是一種重要的變通方法。盡管這種開發(fā)抗生素的方式面臨著各方面的挑戰(zhàn)，但應(yīng)注意到，這可能是抑制細(xì)菌感染的另一有效策略。

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Role of reactive oxygen species in mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria

ZHANG Ya-ni，DUAN Kang-min
(Key Laboratory for Biological Resources and Modern Biotechnology of West China，College of Life Sciences，Northwest University，Xi'an710069，China)

Antibiotic resistance has been spreading at an alarming rate among pathogens，which poses a great threat to human health．It is critical to investigate the mechanisms of action of antibiotics in order to develop new antibiotics and enhance the efficacy of the existing ones．Recent studies indicate bactericidal antibiotics kill pathogens via a common pathway involving reactive oxygen species(ROS)．In this review，the recent progress in the interplay of ROS，SOS and antibiotic resistance has been discussed．These data should prove to be of importance for the development of new antibiotic strategies and encountering with pathogen drug resistance．

antibiotic;drug resistance;reactive oxygen species;SOS;lesion burden;repair damage

R-05;R 378;R 978．1

A

1001－1978(2010)09－1129－03

2010－05－20，

2010－06－21

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 30870097);2010年陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 2010JQ4023);2010年陜西省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目

張亞妮(1975－)，女，博士，研究方向:細(xì)菌的耐藥性，Tel: 029-88302411，E-mail:yani@nwu．edu．cn;段康民(1962－)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:病源菌的致病性和新型抗生素研究，Tel:029-88305288，E-mail:kduan@nwu．edu．cn