王淑民,李鵬飛,趙秀麗,馬 萍,劉麗宏

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院,北京 100730;2.第二炮兵總醫(yī)院藥劑科,北京 100088)

環(huán)孢素A(Cyclosporin,CsA)是一種新型的高效免疫抑制劑,廣泛用于腎、肝、心、骨髓等多種器官移植,療效顯著。除了應(yīng)用于器官和組織移植外,還用于自身免疫疾病的治療。環(huán)孢素A的生物利用度和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)個(gè)體差異大,其主要副作用與劑量相關(guān)。器官移植病人由于用藥時(shí)間較長(zhǎng)和用藥量不足而影響療效,出現(xiàn)排斥反應(yīng),這與用藥過(guò)量而引起的腎功能損害、肝功能失調(diào)等毒性反應(yīng)難以區(qū)別。因此其藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程在國(guó)內(nèi)外都得到了廣泛深入的研究[1-3]。環(huán)孢素A乳劑可明顯增加環(huán)孢素A用藥的有效性和安全性,降低患者的治療成本。環(huán)孢素A滴眼劑大多數(shù)是環(huán)孢素A在油中的混懸液,常用的油有蓖麻油和橄欖油,其濃度有0.5%、1%和2%等。

由于環(huán)孢素A的治療濃度范圍狹窄,個(gè)體差異較大,劑量不易準(zhǔn)確把握,臨床應(yīng)用時(shí)需要進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)。目前環(huán)孢素A日常血藥濃度監(jiān)測(cè)定量范圍為100～1 500 g·L-1,最適合臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)的方法有微粒酶免疫分析法(MEIA)、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等。ELISA法和MEIA法對(duì)環(huán)孢素A的體內(nèi)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng),實(shí)際測(cè)得結(jié)果為環(huán)孢素A及其代謝物之和;LC-MS/MS法測(cè)定結(jié)果為環(huán)孢素A原型藥物濃度,不會(huì)對(duì)環(huán)孢素A體內(nèi)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生交叉反應(yīng),使得測(cè)量值準(zhǔn)確可信,能更準(zhǔn)確的說(shuō)明環(huán)孢素A原型藥物在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征。有文獻(xiàn)報(bào)道[4-12]采用LC-MS/MS法同時(shí)監(jiān)測(cè)多種免疫抑制劑,如環(huán)孢素A、他克莫司、西羅莫司、依維莫司等。Koseki等[13]報(bào)道了同時(shí)定量環(huán)孢素及其3種代謝產(chǎn)物的方法。由于試驗(yàn)劑量下環(huán)孢素眼用乳劑的體內(nèi)血藥濃度極低,LC-MS/MS法的高專屬性和高靈敏度更適合于定量分析。本實(shí)驗(yàn)擬建立LC-MS/MS法測(cè)定人全血中環(huán)孢素A的濃度,并運(yùn)用建立的方法對(duì)中國(guó)健康受試者進(jìn)行環(huán)孢素眼用乳劑藥代動(dòng)力學(xué)研究。

1 儀器與試藥

3200 QTrap型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品,配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1數(shù)據(jù)處理軟件;Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng):美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品,包括四元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、切換閥。

環(huán)孢素A對(duì)照品(純度98.8%,批號(hào):0495-200202):由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;子囊霉素對(duì)照品(純度＞97.0%,批號(hào):045K403):由美國(guó)Sigma公司提供;乙腈為色譜純;其他試劑均為分析純;空白人全血:由第二炮兵總醫(yī)院提供。

2 溶液的配制

對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制:精密稱取10.00 mg環(huán)孢素A對(duì)照品,置于100 mL量瓶中,加入甲醇溶解,并稀釋至刻度,配制成0.10 g·L-1環(huán)孢素A儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)母液的配制:取100μL環(huán)孢素A儲(chǔ)備液,置于10 mL量瓶中,加入空白全血溶解,并用空白全血稀釋至刻度,配制成1.00 mg·L-1環(huán)孢素A母液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本的配制:分別取適量環(huán)孢素A母液,用空白全血稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線所需濃度的全血溶液 ,濃度分別為 0.20、0.50、1.00、3.00、10.00、20.00μg·L-1。分別取適量環(huán)孢素 A母液,用空白全血稀釋至質(zhì)控樣本所需濃度的全血溶液 ,分別為 0.50、3.00、16.00μg·L-1。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制:精密稱取1.00 mg子囊霉素對(duì)照品,置于25 mL量瓶中,加入甲醇溶解,并稀釋至刻度,配制成40.00 mg·L-1儲(chǔ)備液。精密量取250μL上述子囊霉素儲(chǔ)備液,置于500 mL量瓶中,加入甲醇溶解,并稀釋至刻度,即為20μg·L-1子囊霉素溶液。

紅細(xì)胞破碎劑的配制:精密稱取14.38 g ZnSO4·7H2O,置于500 mL量瓶中,加蒸餾水溶解,并稀釋至刻度,即為100 mmol·L-1硫酸鋅溶液。

3 色譜條件及質(zhì)譜條件

Kromasil-C18色譜柱(20 mm×4.6 mm×5 μm);流動(dòng)相甲醇-1 mmol·L-1甲酸銨溶液;洗脫方式:梯度洗脫;流速 1.1 mL·min-1;柱溫60 ℃(50∶50V/V分流);進(jìn)樣量20μL。

離子噴霧離子化源,正離子方式檢測(cè);離子噴射電壓5 500 V;溫度 550℃;源內(nèi)氣體 1(GS1,N2)壓力 345 kPa,氣體 2(GS2,N2)壓力448 kPa;氣簾氣體(N2)壓力 103 kPa;碰撞氣(N2)壓力:Medium;掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);環(huán)孢素A、子囊霉素解簇電壓(DP)分別為 100、55 V;碰撞能量(CE)分別為 70、31 eV;環(huán)孢素A、子囊霉素用于定量分析的離子反應(yīng)分別為 m/z1 203.2→425.5和 m/z809.4→756.4;環(huán)孢素A用于定性分析的離子反應(yīng)為m/z1 203.2 →1 185.2。

4 全血樣品處理

精密取150μL全血樣本,置于1.5 mL EP管中,加入50μL紅細(xì)胞破碎劑,300μL內(nèi)標(biāo)子囊霉素,渦旋 2 min,13 200 r·min-1離心 5 min,上清液轉(zhuǎn)移至另一EP管中,氮?dú)獯蹈?150 μLV(甲醇)∶V(水)=2∶1復(fù)溶,渦流 2 min,13 200 r·min-1離心5 min,取上清液,進(jìn)樣20 μL,進(jìn)行LC-MS/MS分析。

5 分析方法確證

5.1 質(zhì)譜分析

將環(huán)孢素A、子囊霉素貯備液用甲醇稀釋至一定濃度,采用蠕動(dòng)泵進(jìn)樣模式進(jìn)行碎片離子分析,相應(yīng)的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖示于圖1。

5.2 方法的專屬性

分別取150μL空白全血、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本、受試者給藥后收集的全血樣品,按上述全血樣品處理方法及檢測(cè)條件進(jìn)行定量分析,其色譜圖示于圖2。結(jié)果表明:內(nèi)源性物質(zhì)不干擾環(huán)孢素A和內(nèi)標(biāo)子囊霉素的測(cè)定。

圖1 環(huán)孢素A[M+H]+(a)和內(nèi)標(biāo)子囊霉素[M+NH4]+(b)的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Full-scan product ion spectra of[M+H]+for Cyclosporin(a)and[M+NH4]+for Ascomycin(internal standard)(b)

5.3 線性關(guān)系考察

分別取150μL標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本,按4項(xiàng)操作,取上清液,進(jìn)樣20 mL,進(jìn)行LC-MS/MS分析。以全血中待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo) x(μg·L-1),待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo) y,用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,求得直線回歸方程為 y=0.000 728x+0.000 00,r=0.998 5。根據(jù)工作曲線,環(huán)孢素A的線性范圍為0.2～20.0μg·L-1,定量下限為0.2μg·L-1,線性關(guān)系良好。

5.4 準(zhǔn)確度與精密度

分別取100μL質(zhì)控樣本,按4項(xiàng)操作,取上清液,進(jìn)樣20 mL,進(jìn)行LC-MS/MS分析,每濃度6樣本,連續(xù)測(cè)定3天。根據(jù)當(dāng)日的工作曲線,計(jì)算QC樣品的測(cè)得濃度,該方法的準(zhǔn)確度與精密度列于表1。結(jié)果顯示,日間、日內(nèi)變異均小于15%,相對(duì)偏差為-12.60%～12.80%,表明此方法的精密度和準(zhǔn)確度均較高,重現(xiàn)性較好。

圖2 LC-MS/MS法測(cè)定人全血中環(huán)孢素A(Ⅰ)和內(nèi)標(biāo)子囊霉素(Ⅱ)的典型色譜圖a.空白全血;b.0.20μg·L-1環(huán)孢素A標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本和20.00μg·L-1內(nèi)標(biāo)子囊霉素的色譜圖;c.健康受試者右眼使用1滴0.025%環(huán)孢素A滴眼液后30 min的全血樣品Fig.2 Chromatograms of Cyclosporin(Ⅰ)and Ascomycin(Ⅱ)(internal standard)in human blooda.blank blood;b.standard curve sample add intenal standard;c.blood sample 30 min after using one drop 0.025%Cyclosporin to the volunteer

表1 全血中環(huán)孢素A LC-MS/MS法的準(zhǔn)確度與精密度(n=18)Table 1 Results of precision and accuracy in human blood by LC-MS/MS(n=18)

5.5 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察

分別取150μL質(zhì)控樣本,按4項(xiàng)操作,取上清液,進(jìn)樣20 mL,進(jìn)行LC-MS/MS分析,每一濃度進(jìn)行3樣本分析。同時(shí)另取150μL空白全血,加入300μL乙腈沉淀劑,渦旋1 min,13 200 r·min-1離心5 min,上清液轉(zhuǎn)移至另一 EP管中,氮?dú)獯蹈?。分別加入150μL相應(yīng)濃度的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.20、3.00、16.00μg·L-1環(huán)孢素A的乙腈溶液),300μL內(nèi)標(biāo),渦流混勻,13 200 r·min-1離心5 min,上清液轉(zhuǎn)移至另一 EP管中,氮?dú)獯蹈?150μLV(甲醇)∶V(水)=2∶1復(fù)溶,渦流2 min,13 200 r·min-1離心 5 min,取上清液,進(jìn)樣20μL,進(jìn)行LC-MS/MS分析。獲得相應(yīng)峰面積,以每一濃度兩種處理方法測(cè)得的濃度比值計(jì)算提取回收率,環(huán)孢素A的低、中、高3個(gè)濃度提取回收率分別為(98.8±6.2)%、(102.4±7.4)%、(93.0±4.2)%,內(nèi)標(biāo)提取回收率為(84.4±5.1)%。以蒸餾水代替空白全血,按上述條件進(jìn)行樣本前處理,并進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè),低、中、高 3個(gè)濃度基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果顯示,相對(duì)偏差均小于10%。表明此方法的回收率較高,且基質(zhì)效應(yīng)不影響樣本的準(zhǔn)確測(cè)定。

5.6 穩(wěn)定性考察

分別進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性(冰凍放置30 d)和處理后上清液室溫放置12 h穩(wěn)定性的考察,將穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果與理論濃度進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,所有穩(wěn)定性試驗(yàn)中測(cè)定值與添加值的相對(duì)偏差均小于12.9%。表明長(zhǎng)期冰凍放置全血樣品和處理后上清液室溫放置過(guò)程中均較穩(wěn)定,各種貯存條件不影響本方法對(duì)樣品濃度進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定,結(jié)果列于表2。

表2 環(huán)孢素A LC-MS/MS法的2種穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 2 Results of stabilities in human blood by LC/MS/MS

5.7 方法學(xué)應(yīng)用

應(yīng)用本研究所建立的方法測(cè)定8名中國(guó)成年健康志愿者單劑量使用0.025%環(huán)孢素A眼用乳劑1滴后的血藥濃度,所有全血樣本濃度均低于檢測(cè)限。

6 討 論

采用LC-MS/MS法測(cè)定血藥濃度,具有選擇性好、靈敏度高、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于藥物動(dòng)力學(xué)研究。本研究選用LC-MS/MS法對(duì)中國(guó)健康志愿者全血樣本進(jìn)行定量檢測(cè),選用MRM模式定量環(huán)孢素A原型藥物濃度,具有選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。本研究定量下限為0.2μg·L-1,是臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)[4-12]定量下限的1/200。Small等[14]進(jìn)行了相關(guān)眼用乳劑的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究,LC-MS/MS法定量下限為0.1μg·L-1,比本研究所建立的方法低1倍,但其前處理使用 SPE及氮吹干法,較為繁瑣且成本較高。本試驗(yàn)在不影響靈敏度的前提下,全血樣本的前處理采用了極其簡(jiǎn)便的沉淀蛋白法,與液-液萃取法、固相萃取法、在線柱萃取法相比,節(jié)省了大量的前處理時(shí)間,提高了工作效率。試驗(yàn)中選用子囊霉素作為內(nèi)標(biāo),與文獻(xiàn)所用內(nèi)標(biāo)子囊霉素、環(huán)孢素D一致,由于子囊霉素與分析化合物性質(zhì)較近,能盡可能的消除系統(tǒng)誤差和基質(zhì)效應(yīng)。另外,環(huán)孢素A主要分布在全血中,血漿藥物濃度遠(yuǎn)低于全血藥物濃度,因此,本研究選用全血作為分析測(cè)試對(duì)象。

研究發(fā)現(xiàn),環(huán)孢素A在 ESI源正離子方式下,[M+H]+(m/z1 203.2)信號(hào)高于[M+NH4]+(m/z1 219.2),本研究選用[M+H]+作為MRM掃描方式的母離子,二級(jí)碎片掃描時(shí)較高的特征碎片有 m/z1 185.2和 m/z425.5,選用信號(hào)較高的碎片離子 m/z425.5作為子離子進(jìn)行定量,m/z1 185.2進(jìn)行定性考察或同步考察。流動(dòng)相中加入醋酸銨可以提高質(zhì)譜離子化效率,從而提高信噪比。由于本試驗(yàn)的定量限和檢測(cè)限較低,研究初期進(jìn)行等度洗脫很難達(dá)到目標(biāo)定量限,為了提高信噪比,使用梯度洗脫是較為理想的選擇。本研究所選用的色譜柱孔徑和內(nèi)徑均較大,并采用分流模式,可以達(dá)到較高的流速,在此條件下采用梯度方式進(jìn)行梯度洗脫,可以得到較好的色譜峰,降低梯度延遲效應(yīng),縮短分析時(shí)間。全血樣品沉淀蛋白的方法可能會(huì)比較臟,試驗(yàn)中將色譜溶劑前沿切入廢液罐,以免造成質(zhì)譜儀的污染。

運(yùn)用建立的方法進(jìn)行健康人體環(huán)孢素眼用乳劑藥物動(dòng)力學(xué)研究,由于給藥量極低(0.025%環(huán)孢素眼用乳劑1滴滴于右眼),檢測(cè)樣本均低于定量下限,與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致。因此表明,試驗(yàn)劑量下,體內(nèi)環(huán)孢素濃度遠(yuǎn)低于中毒水平。

7 結(jié) 論

本研究所建立的方法靈敏度與文獻(xiàn)報(bào)道相同,但前處理過(guò)程簡(jiǎn)單,分析時(shí)間短,快速、靈敏、專屬性強(qiáng);運(yùn)用建立的方法進(jìn)行健康人體環(huán)孢素眼用乳劑藥物動(dòng)力學(xué)研究,由于給藥量極低,檢測(cè)樣本均低于定量下限,也說(shuō)明試驗(yàn)劑量下,環(huán)孢素濃度遠(yuǎn)低于中毒水平。

[1]郭 濤,秦海旭,夏東亞.3種不同廠家環(huán)孢素A膠囊在健康人體的藥動(dòng)學(xué)和生物等效性[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2008,43(7):536-538.

[2]錢 方,鄧渝林,王亞偉,等.環(huán)抱素國(guó)產(chǎn)微乳膠囊與進(jìn)口微乳膠囊的生物等效性研究[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,25(5):564-565.

[3]蘇 佳,李海燕,高洪志,等.環(huán)孢素軟膠囊在健康人體生物等效性研究[J].中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè),2008,5(3):25-27.

[4]BOGUSZ M J,ENAZI E A,HASSAN H,et al.Simultaneous LC-MS-MS determination of cyclosporine A,tacrolimus,and sirolimus in whole blood as well as mycophenolic acid in plasma using common pretreatment procedure[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2007,850(1/2):471-480.

[5]WANG S,MAGILL J E,VICENTE F B.A fast and simple high-performance liquid chromatography/mass spectrometry method for simultaneous measurement of whole blood tacrolimus and sirolimus[J].Arch Pathol Lab Med,2005,129(5):661-665.

[6]POQUETTE M A,L ENSMEYER GL,DORAN T C.Effective use of liquid chromatography-mass spectrometry(LC/MS)in the routine clinical laboratory for monitoring sirolimus,tacrolimus,and cyclosporine[J].Ther Drug Monit,2005,27(2):144-150.

[7]HATSIS P,VOLMER D A.Evaluation of a cyano stationary phase for the determination of tacrolimus,sirolimus and cyclosporin A in whole blood by high-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2004,809(2):287-294.

[8]STREIT F,ARMSTRONG V W,OELLERICH M.Rapid liquid chromatography-tandem mass spectrometry routine method for simultaneous determination of sirolimus,everolimus,tacrolimus,and cyclosporin A in whole blood[J].Clin Chem,2002,48:955-958.

[9]DETERS M,KIRCHNER G,RESCH K,et al.Simultaneous quantification of sirolimus,everolimus,tacrolimus and cyclosporine by liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS)[J].Clin Chem Lab Med,2002,40(3):285-295.

[10]TAYLOR P J,SALM P,L YNCH S V,et al.Simultaneous quantification oftacrolimusand sirolimus,in human blood,by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Ther Drug Monit,2000,22(5):608-612.

[11]OELL ERICH M,ARMSTRONG V W,STREIT F,et al.Immunosuppressive drug monitoring of sirolimus and cyclosporine in pediatric patients[J].Clin Biochem,2004,37(6):424-428.

[12]BRIGNOL N,MCMAHON L M,LUO S,et al.High-throughput semi-automated 96-well liquid/liquid extraction and liquid chromatography/mass spectrometric analysis of everolimus(RAD 001)and cyclosporin a(CsA)in whole blood[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2001,15(12):898-907.

[13]KOSEKI N,NAKASHIMA A,NAGAE Y,et al.Simultaneous quantitative determination of cyclosporine A and its three main metabolites(AM1,AM4N and AM9)in human blood by liquid chromatography/mass spectrometry using a rapid sample processing method[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2006,20(5):733-740.

[14]SMALL D S,ACHEAMPONG A,REIS B,et al.Blood concentrations of cyclosporin a during long-term treatment with cyclosporin a ophthalmic emulsions in patients with moderate to severe dry eye disease[J].J Ocul PharmacolTher,2002,18(5):411-418.