儲(chǔ)艷秋,蔣公羽,姜 丹,王 青,丁傳凡

(復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系激光化學(xué)研究所,上海 200433)

谷胱甘肽與氨基酸非共價(jià)復(fù)合物的碎片化反應(yīng)

儲(chǔ)艷秋,蔣公羽,姜 丹,王 青,丁傳凡

(復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系激光化學(xué)研究所,上海 200433)

為了探討非共價(jià)復(fù)合物的碎片化反應(yīng)機(jī)理,選擇谷胱甘肽和氨基酸復(fù)合物研究影響碎片化反應(yīng)的主要因素。串級(jí)質(zhì)譜結(jié)果表明,碰撞氣體密度(CGT)和碰撞能量是影響非共價(jià)復(fù)合物碎片化反應(yīng)的兩個(gè)主要因素,對(duì)谷胱甘肽復(fù)合物碎片化產(chǎn)物的生成途徑會(huì)有明顯的影響。當(dāng)碰撞氣體密度恒定在50×1013molecules/cm2,碰撞能量在小于100 eV范圍內(nèi),復(fù)合物His-GSH都能發(fā)生碎裂,斷裂位點(diǎn)容易發(fā)生在非共價(jià)鍵上,生成原來組分[His+H]+和[GSH+H]+離子,但沒有發(fā)生進(jìn)一步碎裂。當(dāng)碰撞能量一定(恒定為30 eV),碰撞氣體密度為50×1013molecules/cm2時(shí),His-GSH復(fù)合物碎裂后的產(chǎn)物同樣為[His+H]+和[GSH+H]+。然而,當(dāng)碰撞氣體密度上升至75×1013molecules/cm2時(shí),除非共價(jià)鍵發(fā)生碎裂外,共價(jià)鍵也會(huì)發(fā)生碎裂,產(chǎn)生更小的碎片離子y2,b2。當(dāng)碰撞氣體密度上升為175×1013molecules/cm2時(shí),His也開始碎裂,生成m/z110[His-H2O-CO+H]+。三級(jí)串級(jí)質(zhì)譜MS3實(shí)驗(yàn)確認(rèn),Lys-GSH復(fù)合物中谷胱甘肽碎裂后產(chǎn)生的y2碎片離子會(huì)進(jìn)一步碎裂。

氨基酸;谷胱甘肽;非共價(jià)復(fù)合物;碰撞誘導(dǎo)解離;碎片化反應(yīng)

在過去的10多年里,質(zhì)譜新技術(shù)和新方法取得了快速的進(jìn)展[1],其中串級(jí)質(zhì)譜已經(jīng)成為一個(gè)重要的工具被廣泛地應(yīng)用于有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)分析和多肽分子中氨基酸序列的測(cè)定。該技術(shù)包括在第一級(jí)質(zhì)量分析器中選擇前體分子,前體分子的激發(fā)并誘導(dǎo)解離和碎片離子分析3部分。前體分子的激發(fā)是由非反應(yīng)性氣體,如氬氣或氦氣的碰撞而獲得,可認(rèn)為是碰撞誘導(dǎo)解離(CID)。

迄今為止,已有大量碰撞誘導(dǎo)解離研究有機(jī)和生物分子的報(bào)道[2-3],其中Harrison用H-D交換和亞穩(wěn)態(tài)離子分析研究了包括質(zhì)子化谷氨酰衍生物等許多質(zhì)子化多肽的碎片化反應(yīng),在質(zhì)子化多肽碎片化機(jī)理的實(shí)驗(yàn)和理論工作中做出了重要貢獻(xiàn)。從解離的觀點(diǎn)來看,酰胺上的氮具有優(yōu)勢(shì),容易加質(zhì)子并發(fā)生斷裂;但從熱力學(xué)的觀點(diǎn)來看,酰胺上的氮并不是最具優(yōu)勢(shì)的,而酰胺上的氧,N-端的氨基和側(cè)鏈的堿性氨基酸,如Arg和Lys卻是優(yōu)勢(shì)基團(tuán);為了解決這一矛盾,Wysocki等[4]提出了“質(zhì)子遷移模型”,在低能碰撞條件下,質(zhì)子化多肽的碎裂主要表現(xiàn)為電荷導(dǎo)向型反應(yīng)。對(duì)于含有多個(gè)官能團(tuán)的化合物,多肽可以在許多位點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)子化,包括N-端氨基、酰胺上的氧和氮,以及側(cè)鏈官能團(tuán)等?！百|(zhì)子遷移模型”得到了質(zhì)譜中H-D交換實(shí)驗(yàn)和理論計(jì)算的支持。

Paizs等[5]綜合評(píng)論了質(zhì)子化多肽碎片化途徑,認(rèn)為僅僅采用“質(zhì)子遷移模型”只能定性地解釋含有質(zhì)子遷移的多肽低能碰撞誘導(dǎo)解離過程,具有一定的局限性。為了深入理解質(zhì)子化多肽機(jī)制,對(duì)“質(zhì)子遷移模型”加以改進(jìn),提出了“競(jìng)爭(zhēng)途徑模型”,即質(zhì)子化多肽碎片離子的形成過程,包括3個(gè)步驟:1)預(yù)解離,包括質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)、異構(gòu)體和互變異構(gòu)體的轉(zhuǎn)換,酰胺鍵的順反異構(gòu)轉(zhuǎn)變等;2)解離;3)解離后,Paizs根據(jù)該模型成功地解釋了二酮哌嗪的碎片化途徑。在探索精氨酸的質(zhì)子化多肽RRM KWKK氣相碰撞誘導(dǎo)解離過程中,祖莉莉等[6]發(fā)現(xiàn)含精氨酸的支鏈?zhǔn)窃摱嚯馁|(zhì)子化時(shí)質(zhì)子優(yōu)先結(jié)合的部位,導(dǎo)致含有Arg的多肽在氣相中碰撞誘導(dǎo)解離條件下解離時(shí)需要較高的解離能。

近年來,有關(guān)非共價(jià)復(fù)合物的碎片化過程的質(zhì)譜研究引起人們的關(guān)注。在有生命的有機(jī)物中,DNA磷酸鹽含有負(fù)電荷,能夠與帶正電荷的質(zhì)子化堿性氨基酸殘基通過離子鍵結(jié)合而形成非共價(jià)復(fù)合物,Buchmann等[7]采用氮?dú)庾鳛榕鲎矚怏w對(duì)該復(fù)合物進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離時(shí)發(fā)現(xiàn),復(fù)合物的電荷態(tài)和多聚堿性氨基酸的性質(zhì)不同會(huì)導(dǎo)致不同的解離途徑,即高電荷態(tài)復(fù)合物由于庫侖斥力的作用容易發(fā)生非共價(jià)解離,斷裂碎片為復(fù)合前的組分,而低電荷態(tài)復(fù)合物的斷裂位點(diǎn)容易發(fā)生在DNA磷酸鹽的共價(jià)鍵部分。聞韌等[8]采用電噴霧-傅里葉回旋共振質(zhì)譜重新研究了藥物藍(lán)色熒光染料Hoechst與雙鏈DNA的非共價(jià)結(jié)合,碰撞誘導(dǎo)解離結(jié)果表明,藥物能夠提高該多電荷體系的穩(wěn)定性,DNA和藥物之間存在較強(qiáng)的鹽橋嵌入作用。Yu等[9]采用傅里葉回旋共振質(zhì)譜碰撞誘導(dǎo)解離碎片分析了該復(fù)合物的鍵合位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)有環(huán)糊精包合藥物芳香基團(tuán)的碎片存在,確認(rèn)黃酮類藥物已經(jīng)插入環(huán)糊精的疏水腔中。因此,深入開展非共價(jià)復(fù)合物的碎片化過程的質(zhì)譜分析,將有助于從分子水平上揭示生物大分子和藥物分子相互作用的結(jié)構(gòu)信息,并為新藥的研發(fā)提供新的思路。

盡管采用碰撞誘導(dǎo)解離技術(shù)研究非共價(jià)復(fù)合物已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展,然而,對(duì)于哪些因素將會(huì)對(duì)非共價(jià)復(fù)合物的碎片化反應(yīng)產(chǎn)生明顯的影響仍然少有報(bào)道,初步探明碰撞氣體密度和碰撞能量等因素的影響將有利于深刻理解非共價(jià)復(fù)合物碎片化的作用機(jī)制和理論模型。

本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)采用電噴霧質(zhì)譜成功地研究谷胱甘肽與L型-芳香性氨基酸非共價(jià)復(fù)合物等[10],為了從分子水平上進(jìn)一步揭示生物大分子和氨基酸等小分子非共價(jià)作用的機(jī)理。本工作采用二級(jí)或三級(jí)質(zhì)譜研究影響谷胱甘肽與氨基酸非共價(jià)復(fù)合物的碎片化過程的主要因素,并探索該非共價(jià)復(fù)合物的斷裂位點(diǎn)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和裝置

API III三重四極桿串級(jí)質(zhì)譜儀(m/z2 400):加拿大PE-Sciex公司產(chǎn)品,質(zhì)譜儀的質(zhì)量由溶菌酶(相對(duì)分子質(zhì)量14 307)校正;PHS-3C精密p H計(jì):上海林達(dá)儀器廠產(chǎn)品。

1.2 主要材料和試劑

還原型谷胱甘肽(99%):購自Sigma公司;氨基酸(His,Lys(99%)):購自上海朝瑞生物科技有限公司;甲醇(分析純):購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;所有化學(xué)試劑溶解于蒸餾水中,并制成1.0 mmol·L-1貯存液。

1.3 試驗(yàn)條件

將1.0 mmol·L-1谷胱甘肽分別與His、Lys貯存液按摩爾比1∶1在室溫下混合,放入20℃培養(yǎng)箱內(nèi),溫育1 h,使之生成谷胱甘肽與氨基酸非共價(jià)復(fù)合物,并使反應(yīng)完全?；旌弦簽閜 H 6～8,取出后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。為了提高質(zhì)譜檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度,質(zhì)譜檢測(cè)前在待測(cè)樣品中加入5%甲醇。碰撞能量數(shù)值由四極桿Q0和碰撞池Q2的電壓差[n(R2-R0)]計(jì)算而得(n為母離子電荷數(shù))。三級(jí)串級(jí)質(zhì)譜MS3實(shí)驗(yàn)是提高錐孔電壓至80 V以上,在接口區(qū)解離產(chǎn)生感興趣的初次碎片離子,其后的步驟與MS2相同,碰撞氣體密度單位為1013molecules/cm2;在考察碰撞氣體密度對(duì)非共價(jià)復(fù)合物的碎片化反應(yīng)影響實(shí)驗(yàn)中,碰撞能量為30 eV。

為了便于討論,谷胱甘肽的碎裂碎片命名采用Biemann規(guī)則[5],示于圖1。

圖1 谷胱甘肽斷裂示意圖Fig.1 Nonmenclature used for the fragments of glutathione

2 結(jié)果和討論

2.1 谷胱甘肽和His、Lys在氣相中形成的非共價(jià)復(fù)合物的電噴霧質(zhì)譜

谷胱甘肽是一個(gè)由γ-谷氨酰、半胱氨酰、甘氨酸組成的三肽(γ-Glu-Cys-Gly),分子式為C10H17N3O6S,相對(duì)分子質(zhì)量為307.3。電噴霧質(zhì)譜測(cè)得的質(zhì)譜峰m/z308.2為谷胱甘肽單電荷離子峰[GSH+H]+,碰撞氣體密度(CGT)單位為1013molecules/cm2(為了使文章簡潔,在下文中省略碰撞氣體密度單位)。

谷胱甘肽與氨基酸His,Lys復(fù)合物的電噴霧質(zhì)譜圖示于圖2?？梢钥吹?除谷胱甘肽(m/z308.2)、His(m/z156.2)和Lys(m/z147.0)的離子峰外,還出現(xiàn)了非共價(jià)復(fù)合物的離子峰,質(zhì)譜峰m/z463.6(圖2a)和m/z454.2(圖2b)可以分別歸屬于[His-GSH+H]+和[Lys-GSH+H]+。從圖2中的2個(gè)插圖可以看到,生成的均為單電荷離子,谷胱甘肽與氨基酸His和Lys混合并反應(yīng)后,可以導(dǎo)致非共價(jià)復(fù)合物的生成。

2.2 碰撞氣體密度對(duì)谷胱甘肽非共價(jià)復(fù)合物碎裂過程的影響

圖2 谷胱甘肽與氨基酸His,Lys混合物及非共價(jià)復(fù)合物質(zhì)譜圖a.His;b.LysFig.2 ESI mass spectra for the complexes of glutathione with His and Lys,the[GSH]is at a fixed concentration of 1.0×10-4mol·L-1

為了研究碰撞氣體密度對(duì)谷胱甘肽-組氨酸非共價(jià)復(fù)合物碎片化過程的影響,對(duì)[GSH+His+H]+前體離子進(jìn)行了碰撞誘導(dǎo)解離實(shí)驗(yàn),結(jié)果示于圖3?？梢钥吹?當(dāng)CGT上升為50時(shí),谷胱甘肽-組氨酸非共價(jià)復(fù)合物已經(jīng)開始斷裂,產(chǎn)生的碎片離子分別位于m/z156.2和308.2,它們可以分別歸屬于[His+H]+和[GSH+H]+的分子離子峰;當(dāng)CGT上升為75時(shí),谷胱甘肽開始碎裂,m/z177.2和231.3碎片離子峰可以分別歸屬于谷胱甘肽碎裂后產(chǎn)生的y2、b2碎片離子;當(dāng)CGT上升為150時(shí),谷胱甘肽-組氨酸復(fù)合物的質(zhì)譜峰幾乎消失,此時(shí)除谷胱甘肽碎裂后產(chǎn)生y2、b2碎片離子外,組氨酸也開始斷裂,產(chǎn)生m/z110.2離子峰;該峰在CGT上升為175時(shí)達(dá)到最大值,繼續(xù)增加CGT至225以上,則進(jìn)一步碎裂成更多強(qiáng)度較小的碎片。值得一提的是,谷胱甘肽與組氨酸形成的復(fù)合物容易在非共價(jià)的位置發(fā)生斷裂。Terrier等[7]研究表明,對(duì)于一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量較大的非共價(jià)復(fù)合物而言,一般高電荷態(tài)部分的斷裂容易發(fā)生在非共價(jià)鍵位置,而低電荷態(tài)部分的斷裂容易發(fā)生在共價(jià)鍵位置,但是由于谷胱甘肽與組氨酸形成的非共價(jià)復(fù)合物的相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)較小,非共價(jià)鍵容易斷裂可能是因?yàn)槠滏I能比共價(jià)鍵鍵能相對(duì)較小。

圖3 谷胱甘肽與His非共價(jià)復(fù)合物碰撞誘導(dǎo)解離質(zhì)譜圖Fig.3 Collision-induced dissociation mass spectra for the non-covalent complexes of glutathione with His

碰撞氣體密度對(duì)谷胱甘肽-賴氨酸非共價(jià)復(fù)合物碎片化過程的影響示于圖4,對(duì)[GSH+Lys+H]+前體離子(m/z453.4)同樣進(jìn)行了碰撞誘導(dǎo)解離實(shí)驗(yàn)。在圖4中,當(dāng)CGT為75時(shí),來自前體離子的斷裂碎片離子m/z147.2和30812可以分別歸屬于[Lys+H]+和[GSH+H]+的分子離子峰。除此之外,還觀察到m/z17712、231.3碎片離子峰,它們可以分別歸屬于谷胱甘肽碎裂后產(chǎn)生的y2、b2碎片離子。當(dāng)CGT為125時(shí),谷胱甘肽-賴氨酸復(fù)合物完全碎裂成m/z17712、231.3、289.5碎片離子峰,它們可以分別歸屬于谷胱甘肽碎裂后產(chǎn)生的y2、b2、b3碎片離子(其中b3為谷胱甘肽N-端脫水后的產(chǎn)物),m/z162和130碎片離子峰可以分別歸屬于谷胱甘肽碎裂后產(chǎn)生的z2和b1碎片離子。m/z130質(zhì)譜峰同時(shí)也可以歸屬于Lys脫水后產(chǎn)物,m/z130可能為Lys脫水后產(chǎn)物與谷胱甘肽碎裂后產(chǎn)生的b1碎片離子的疊加,因此導(dǎo)致該峰強(qiáng)度相對(duì)較高。當(dāng)CGT為175時(shí),與相同條件谷胱甘肽-His非共價(jià)復(fù)合物相比較,谷胱甘肽-Lys非共價(jià)復(fù)合物碎裂后產(chǎn)生的碎片離子峰要略強(qiáng)。

圖4 谷胱甘肽與Lys非共價(jià)復(fù)合物碰撞誘導(dǎo)解離質(zhì)譜圖Fig.4 Collision-induced dissociation spectra of the non-covalent complexes of glutathione with Lys

為了確認(rèn)圖4中m/z177.2碎片離子峰為谷胱甘肽碎裂后產(chǎn)生的y2,又做了MS3實(shí)驗(yàn),結(jié)果示于圖5。圖5a將GSH-Lys復(fù)合物源內(nèi)解離產(chǎn)生的y2離子再次在Q2碰撞池內(nèi)碰撞解離,結(jié)果在譜圖中發(fā)現(xiàn)了y1離子(m/z76.2),以及[y2-H2O]+(m/z159.2)和[y2-H2ONH3]+(m/z142.2)離子峰。類似地,在圖5b中,來自前體離子b1(m/z130.3)的斷裂碎片離子m/z[b1-H2O]+離子峰。在圖5c中,來自前體離子z2(m/z162.2)的斷裂碎片離子m/z144.1、116.3可以分別歸屬于[z2-H2O]+和[z2-H2O-CO]+;而斷裂碎片離子m/z88.2可能為b2z2的分子離子峰,由此可以進(jìn)一步確定y2和b1等碎片離子是谷胱甘肽碎裂后產(chǎn)生的。

2.3 碰撞能量對(duì)谷胱甘肽與組氨酸非共價(jià)復(fù)合物碎裂過程的影響

由圖6可以看到,在碰撞氣體密度為50×1013,碰撞能量(CE)從5 eV增加到80 eV過程中,非共價(jià)復(fù)合物His-GSH都能發(fā)生碎裂反應(yīng),產(chǎn)生的碎片離子分別位于m/z156.2和308.2,它們可以分別歸屬于原來組分[His+H]+和[GSH+H]+的分子離子峰。當(dāng)碰撞能量從5 eV增加到40 eV過程中,前體離子復(fù)合物His-GSH質(zhì)譜峰強(qiáng)度逐漸下降,碎片峰逐漸上升,揭示在此能量范圍內(nèi),隨著碰撞能量的提高,有利于復(fù)合物的碎裂。然而,令人感興趣的是,進(jìn)一步提高碰撞能量至大于40 eV,復(fù)合物前體離子峰強(qiáng)度不但沒有下降,反而逐漸上升,這可能與復(fù)合物前體離子動(dòng)能的提高,其穿過Q2碰撞池的速度接近于亞穩(wěn)態(tài)離子速率,導(dǎo)致前體離子與氬氣碰撞次數(shù)減少有關(guān)。類似的現(xiàn)象在做錳卟啉-His非共價(jià)復(fù)合物前體離子與氬氣的碰撞實(shí)驗(yàn)中同樣可以觀察到(譜圖和數(shù)據(jù)在此沒有列出)。與此同時(shí),還可以看到,當(dāng)碰撞氣體密度維持在50×1013不變,在低碰撞能量范圍內(nèi)(小于100 eV),僅僅靠增加碰撞能量,復(fù)合物His-GSH在非共價(jià)鍵部位發(fā)生碎裂后,不會(huì)在共價(jià)鍵部位再次發(fā)生碎裂。

圖5 谷胱甘肽與Lys非共價(jià)復(fù)合物碰撞誘導(dǎo)解離MS3質(zhì)譜圖Fig.5 CID MS3spectra of the non-covalent complexes of glutathione with Lys

圖6 谷胱甘肽與組氨酸非共價(jià)復(fù)合物在不同碰撞能量下的碰撞誘導(dǎo)解離質(zhì)譜圖Fig.6 CID spectra of the non-covalent complexes of glutathione with His under various collision energy

3 結(jié) 論

采用串級(jí)質(zhì)譜研究了氣體密度和碰撞能量對(duì)氨基酸-谷胱甘肽非共價(jià)復(fù)合物碎片化反應(yīng)的影響。結(jié)果表明,當(dāng)碰撞氣體密度一定(50×1013molecules/cm2),碰撞能量從5 eV增加到80 eV時(shí),復(fù)合物His-GSH都會(huì)發(fā)生碎裂,斷裂位點(diǎn)容易發(fā)生在非共價(jià)鍵上,生成[His+H]+和[GSH+H]+離子。在碰撞能量從5 eV增加到40 eV的過程中,復(fù)合物His-GSH質(zhì)譜峰強(qiáng)度逐漸下降,碎片離子峰逐漸上升,說明在此能量范圍內(nèi),碰撞能量的提高有利于復(fù)合物的碎裂;然而,當(dāng)碰撞能量大于40 eV,His-GSH復(fù)合物的質(zhì)譜峰強(qiáng)度反而逐漸上升,表明此時(shí)的碰撞幾率下降。

當(dāng)碰撞能量恒定為30 eV,碰撞氣體密度為50×1013molecules/cm2時(shí),His-GSH非共價(jià)鍵復(fù)合物碎裂后的產(chǎn)物同樣為[His+H]+和[GSH+H]+。然而,當(dāng)碰撞氣體密度上升為175×1013molecules/cm2時(shí),除非共價(jià)鍵發(fā)生碎裂外,谷胱甘肽的共價(jià)鍵也會(huì)發(fā)生碎裂,產(chǎn)生更小的碎片離子y2和b2,與此同時(shí),His也開始碎裂,并生成m/z110[His-H2O-CO+H]+。同樣條件下,Lys-GSH非共價(jià)鍵復(fù)合物也會(huì)發(fā)生碎裂。為了確認(rèn)m/z177.2碎片離子峰為Lys-GSH復(fù)合物中谷胱甘肽碎裂后產(chǎn)生的y2碎片離子,又進(jìn)行了三級(jí)串級(jí)質(zhì)譜MS3實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)有谷胱甘肽的y1碎片離子。

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Fragmentation Process of Non-Covalent Complexes of Glutathione with Amino Acids

CHU Yan-qiu,J IANG Gong-yu,J IANG Dan,WANG Qing,DING Chuan-fan
(L aser Chemistry Institute,Chemistry Department,Fudan University,S hanghai200433,China)

To explore the fragmentation reactions of non-covalent complex,the complex of glutathione(GSH)and amino acids were chosen to investigate the main factors affecting the fragmentation process.The secondary tandem mass spectrometry(MS2)results indicated that collision gas thickness(CGT)and collision energy are two important conditions affecting the fragmentation pathway of glutathione complex.When the CGT maintained at 50×1013molecules/cm2,increasing collision energy from 5 eV to 80 eV,the dissociation of His-GSH complex took place,leading to the formation of[His+H]+and[GSH+H]+.However,it could be seen that no further dissociation of GSH occurred,and the fragmentationof noncovalent bond was the main pathway of the complex.When CGT rose up to 75×1013molecules/cm2,the covalent bond also began to dissociate,leading to the formation of y2and b2for glutathione.Such phenomena could be also observed in Lys-GSH complex.To confirm the fragment ion y2of glutathione,MS3was also performed and y1was detected.

amino acid;glutathione;non-covalent complexes;collision induced dissociation;fragmentation process

O 657.63;O 641.6

A

1004-2997(2010)01-0012-06

2009-09-09;

2009-11-27

國家自然科學(xué)基金(25027004)資助

儲(chǔ)艷秋(1965～),男,上海人,副教授,從事有機(jī)分子和生物大分子質(zhì)譜研究。E-mail:chuyq@fudan.edu.cn

丁傳凡(1962～),男,安徽人,教授,從事生物質(zhì)譜研究。E-mail:cfding@fudan.edu.cn