張海琪,梁麗軍,2,何中央,施禮科

(1.浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心,浙江杭州 310012;2.浙江工業(yè)大學化學工程與材料學院,浙江杭州 310032)

水產(chǎn)品中堿性嫩黃O殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定

張海琪1,梁麗軍1,2,何中央1,施禮科1

(1.浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心,浙江杭州 310012;2.浙江工業(yè)大學化學工程與材料學院,浙江杭州 310032)

建立了水產(chǎn)品中堿性嫩黃O工業(yè)染料殘留的高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。樣品經(jīng)甲醇超聲提取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、過濾后,在正離子電噴霧離子源(ESI+),多反應監(jiān)測(MRM)模式下進行測定。方法線性范圍為2.5～100μg·L-1,在添加水平為5.0～20.0μg·kg-1時的平均回收率為78.9%～92.1%,相對標準偏差小于11%,定量限為0.5μg·kg-1。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;堿性嫩黃O;堿性染料;水產(chǎn)品

堿性嫩黃O(Auramine O)別名鹽基淡黃O、鹽基槐黃、堿性熒光黃GR,是一種芳香胺類堿性工業(yè)染料,其結(jié)構(gòu)示于圖1,主要用于棉織品、人造絲、紙張、皮革、油漆等染色[1]。堿性類工業(yè)染料比食用色素更易在食品中染色,且不易褪色、價格低廉,因此常被一些不法水產(chǎn)商用來對魚、蝦等進行染色。

對水產(chǎn)品進行染色來增加產(chǎn)品的色相,以次充鮮[2-4]。有資料表明:堿性嫩黃O對皮膚黏膜有輕度刺激,可引起結(jié)膜炎、皮炎和上呼吸道刺激癥狀,人接觸或者吸入都會引起中毒[5],且很難自然降解,體內(nèi)殘留物具有毒性、致癌性、致突變[6],給消費者的健康帶來了嚴重危害。因此,不允許在食品中使用,且未曾在《食品添加劑食用衛(wèi)生標準》(GB 2760—2007)中列出[7]。

目前,有關(guān)食品中堿性染料檢測方面的研究報道有:水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其它們的代謝物檢測[8-10],豆制品中堿性嫩黃O、堿性橙的檢測[5,11-12]。而關(guān)于水產(chǎn)品中堿性嫩黃O的檢測未見報道。本工作對樣品前處理方法、液相色譜條件、質(zhì)譜條件進行系統(tǒng)優(yōu)化,擬建立水產(chǎn)品中堿性嫩黃O殘留分析的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法。

圖1 堿性嫩黃O的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of Auramine O

1 實驗部分

1.1 主要儀器

Agilent 1100 HPLC儀(美國Agilent公司產(chǎn)品)-API3000三重四極桿質(zhì)譜(美國ABI公司產(chǎn)品),配有自動進樣器、電噴霧離子源;高速冷凍離心機;L G 10-2.4A型高速臺式離心機;WH-866型渦旋混合儀;KQ-800DB型可控溫超聲波儀;Milli-Q純水器;R2OS增強型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;微型高速萬能試樣粉碎機。

1.2 主要材料與試劑

堿性嫩黃O(CAS No.2465-27-2,C.I.41000):購自Sigma-Aldrich公司;甲醇、甲酸(色譜純),無水乙醇(分析純):購自Merck公司;實驗用水為Milli-Q超純水。樣品為均質(zhì)后的中華鱉,黃魚,蟹類水產(chǎn)品。

1.3 標準溶液

精密稱取10 mg堿性嫩黃O標準品,置于100 mL棕色瓶中,用無水乙醇溶解并稀釋至刻度,配成濃度為100 mg·L-1標準品儲備液,置于-4℃冰箱中保存。取2.5 mL標準品儲備液,用無水乙醇定容至100 mL,配成濃度為2.5 mg·L-1標準品工作液,冷藏保存。

1.4 樣品前處理

取5.00 g(精確到0.05 g)已均質(zhì)的樣品于50 mL聚丙烯離心管中,加入10 mL甲醇,超聲提取15 min,8 000 r·min-1離心10 min,重復提取2次,合并提取液,于45℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。用70%甲醇水溶液溶解殘渣并定容至10 mL。取適量的定容液,10 000 r·min-1離心10 min,上清液過0.22μm濾膜,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件 Waters Atlantis C18色譜柱(2.1 mm×150 mm×5μm);柱溫30℃;進樣量10μL;流速200μL·min-1;流動相:乙腈(A)和0.1%甲酸水溶液(B);梯度洗脫:0 min A 10%(φ),1 min A 10%(φ),2 min A 100%(φ),9 min A 100%(φ),9.1 min A 10%(φ),15 min A 10%(φ)。

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧正離子(ESI+)電離模式,多反應監(jiān)測(MRM)方式,單位分辨率,電噴霧電壓5 000 V,輔助氣流速7 L·min-1,離子源溫度500℃,聚焦電壓200 V,入口電壓5 V,出口電壓22 V,霧化氣7.58×104Pa,氣簾氣6.21×104Pa,碰撞氣4.83×104Pa。監(jiān)測離子對,去簇電壓(DP),碰撞氣能量(CE)列于表1。

表1 堿性嫩黃O優(yōu)化后的MRM參數(shù)Table1 Optimized multiple reaction monitoring parameters for Auramine O

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜定量定性

根據(jù)堿性嫩黃O分子結(jié)構(gòu)的特征,實驗選用電噴霧正離子(ESI+)電離模式以流動注射泵連續(xù)進樣對標準液進行Q1全掃描,找出準確的[M+H]+m/z268.3峰為碰撞誘導解離的母離子,繼續(xù)對其子離子進行Q3全掃描,找出2～3個信號較強的碎片離子,示于圖2。再以母離子與子離子組成監(jiān)測離子對,以多反應監(jiān)測模式對待測物進行定性和定量檢測,同時優(yōu)化去簇電壓、聚焦電壓、碰撞能量等質(zhì)譜條件。其中CE對離子對的豐度影響最大,示于圖3。接著用FIA方式優(yōu)化霧化氣,氣簾氣,碰撞氣,電噴霧電壓等參數(shù)(優(yōu)化后的質(zhì)譜條件如1.5.2)。

從離子掃描圖可以得出,堿性嫩黃O的主要碎片離子為m/z252.2、147.1、122.3、107.4,選擇m/z252.2、147.1、107.4作為堿性嫩黃O的特征碎片離子。為了滿足歐盟2002/65/EC指令規(guī)定,對于禁用藥物的質(zhì)譜確證方法需要4個IPs,選擇m/z268.3/147.1為定量離子對,m/z268.3/147.1和m/z268.3/252.2為定性離子對進行定量定性分析。裂解途徑推斷如下:堿性嫩黃O的氯化物m/z303.8脫氯斷裂后得到分子離子m/z268.3,分子離子m/z268.3脫去芳香胺上的甲基得到m/z252.2[M+-HCH3],分子離子m/z268.3脫去其中1個苯胺得到m/z147.1[M+-C6H5NC2H6],m/z14711進一步脫去酰胺得到m/z122.3[M+-C6H4NC2H6-CN]),m/z122.3繼續(xù)脫掉1個甲基得到m/z107.4,示于圖2。

圖2 堿性嫩黃O離子掃描圖和解離圖Fig.2 Product ion scans spectra and proposed fragmentation scheme of Auramine O

圖3 不同碰撞能量對離子對豐強度的影響Fig.3 The effects of collision energy on the intensity of product

2.2 色譜條件優(yōu)化

選擇流動相時,比較了乙腈和含不同體積分數(shù)(0%～0.3%)甲酸的水溶液,發(fā)現(xiàn)當甲酸含量為0.1%時,各待測物的響應值相對較高,在很大程度上增加了目標物的分子離子化程度和檢測靈敏度,所以最終選用乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動相,并采取梯度洗脫程序。加標樣品和標準品的MRM色譜圖示于圖4,從圖4可見,優(yōu)化后的色譜條件可以將4種目標物和基質(zhì)干擾很好的分開,獲得各組分的良好分離。

2.3 線性范圍和檢出限

取適量體積的標準品工作液,用空白樣品提取液配制成濃度為2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0μg·L-1的系列標準工作液,以峰面積y對待測物的質(zhì)量濃度x(μg·L-1)作標準曲線方程,得方程為y=519x+249,相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。實驗表明,堿性嫩黃O在2.5～100 μg·L-1濃度范圍內(nèi),質(zhì)譜均有良好的線性響應。以10倍信噪比計算方法的定量限(LOQ)為0.5μg·kg-1。

2.4 基質(zhì)效應、回收率與精密度實驗

為了考察基質(zhì)離子抑制對定量結(jié)果的影響,在5.0、10.0和20.0μg·kg-1的添加水平下,采用空白樣品提取液加標和標準溶液進行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),空白樣品提取液加標回收率低于35%,標準溶液回收率可達90%以上,離子化效率為40%～75%,可見存在著基質(zhì)減弱效應,嚴重影響實驗回收率。因為沒有找到堿性嫩黃O與之相匹配的內(nèi)標物,所以采取外標法進行,在實驗中考慮扣除基質(zhì)干擾,從而提高定量的準確性。

圖4 多反應監(jiān)測模式下堿性嫩黃O的MRM色譜圖a.空白樣品;b.空白加標樣;c.標準溶液Fig.4 Chromatograms of Auramine O by MRM mode

對中華鱉、黃魚、蟹3種不同基質(zhì)的水產(chǎn)品進行5.0、10.0、20.0μg·kg-1三個水平的添加回收實驗,結(jié)果列于表2。實驗表明,在添加濃度為5.0～20.0 g·kg-1范圍內(nèi),平均回收率在78.9%～92.1%之間,RSD在4.2%～10.8%之間。

表2 水產(chǎn)品中加標回收率試驗結(jié)果(n=4)Table2 Results of spiked recovery experiments(n=4)

2.5 方法應用

應用上述LC-MS/MS法分別對中華鱉,黃魚,蟹類等水產(chǎn)品進行檢測。結(jié)果表明,該方法具有快速簡單、檢出限低、實用性強、抗干擾能力強等特點,能夠?qū)哿繕悠愤M行很好的定性定量認證,滿足動物源性食品中堿性工業(yè)染料殘留檢測的要求,可為水產(chǎn)食品安全監(jiān)督檢測提供有力的技術(shù)依據(jù)。

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Determination of Auramine O in Fishery Products by High-Performance Liquid Chromatography-Electrospray Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Hai-qi1,LIANG Li-jun1,2,HE Zhong-yang1,SHI Li-ke1
(1.Zhejiang Fishery Quality Testing Center,Hangzhou310012,China;2.College of Chemical Engineering and Materials Science,Zhejiang University ofTechnology,Hangzhou310032,China)

Auramine O in fishery products was determined by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectromety.Sample was ultrasonically extracted from homogenized samples with methanol,then concentrated and purified.Analytes were finally determined by electrospray ionization(ESI)in positive mode using multiple reactions monitoring(MRM).The method was validated,and good results were obtained with respect to spiked recovery.The linear range is from 2.5 to 100μg·L-1.The average recoveries are between 78.9%and 92.1%in the spiked range of 5.0—20.0μg·kg-1,its relative standard deviation is lower than 11%.The limit quantification(LOQ)is 0.5μg·kg-1.

high-performanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry;Auramine O;basic dye;fishery products

O 657.63

A

1004-2997(2010)01-0048-05

2009-04-01;

2009-12-03

浙江省重大農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目(No.2007C02002-2)資助

張海琪(1977～),男(漢族),浙江溫嶺人,高級工程師,從事水產(chǎn)種質(zhì)與質(zhì)量安全研究。E-mail:zmk407@126.com