劉麗霞， 趙 挺， 陳 揚(yáng)， 孫立新*

(1.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽110016;2.遼寧省藥物研究院，遼寧沈陽110016)

了哥王是瑞香科蕘花屬植物Wikstroemia indica(L.)C.A.Mey的根莖，其性苦味寒、微辛、有毒，具有消腫止痛、清熱解毒、化痰散結(jié)等作用，臨床應(yīng)用于肺熱咳喘、咽喉腫痛、跌打損傷等，療效較好，對肝炎、肝硬化、腎炎等有一定作用［1］，陳揚(yáng)［2］等進(jìn)行藥理研究證實(shí)了哥王具顯著抗腫瘤活性。了哥王藥材化學(xué)成分復(fù)雜，文獻(xiàn)報(bào)道主要為香豆素類、黃酮類、木脂素類、皂苷等，其中黃酮類成分有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用［3-4］。芫花素為黃酮類化合物，目前有關(guān)了哥王藥材中芫花素的含量測定未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)從藥材中分離得到芫花素并采用高效液相色譜法對其進(jìn)行含量測定，為了哥王藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

1 儀器與材料

依利特高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)，UV2000Ⅱ紫外可變波長檢測器(大連依利特分析儀器有限公司)，N3000色譜工作站，QE100藥材粉碎機(jī)(浙江省武義縣屹立工具有限公司)，KQ-100型超聲儀(昆山市超聲波儀器有限公司)，TG332A分析天平(湘儀天平儀器廠)。

對照品:芫花素(本實(shí)驗(yàn)室自制，HPLC法測得純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99.0%)，甲醇、乙腈(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠)，水(娃哈哈飲用純凈水)，其余試劑(分析純，市售)。

了哥王藥材9批，均為市售品，由沈陽藥科大學(xué)孫啟時(shí)教授鑒定為瑞香科蕘花屬植物了哥王［Wikstroemia indica(L.)C.A.Mey.］。

2 方法與結(jié)果

2.1 芫花素的分離與鑒定

了哥王藥材，粉碎，加入10倍量95%乙醇，回流提取3次，1.5 h/次，合并提取液并濃縮，回收溶劑，所得浸膏用適量水分散，依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑得相應(yīng)萃取物浸膏。將了哥王乙酸乙酯萃取物(146 g)干浸膏與約2倍量的硅膠拌樣，上樣于硅膠柱，氯仿-甲醇(100∶0～0∶100)梯度洗脫，共合并收集16個(gè)流分。將流分2再經(jīng)硅膠柱層析，環(huán)己烷-丙酮(100∶0～0∶100)梯度洗脫，在環(huán)己烷-丙酮(20∶1)洗脫液中有黃色結(jié)晶析出，收集結(jié)晶，再經(jīng)重結(jié)晶，干燥，即得芫花素(25 mg)。

樣品的1H-NMR譜數(shù)據(jù)如下1H-NMR(300 MHz，DMSO-d6)δ:3.84(3 H，s，-OCH3)，6.34(1 H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.72(1 H，d，J=2.0 Hz ，H-8)，6.80(1 H，s，H-3)，6.93(2 H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′)，7.94(2 H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′)，10.34(1 H，s，4′-OH)，12.93(1 H，s，5-OH);13C-NMR(75 MHz，DMSO-d6)δ:181.7(C-4)，165.0(C-7)，163.8(C-2)，161.0(C-9)，159.8(C-4′)，157.0(C-5)，128.3(C-2′，6′)，121.0(C-1′)，115.7(C-3′，5′)，109.5(C-5)，104.4(C-10)，103.0(C-3)，97.9(C-6)，92.6(C-8)，56.0(-OCH3)。該化合物光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［5］報(bào)道的芫花素光譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為芫花素(genkwanin)，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 芫花素結(jié)構(gòu)式

2.2 HPLC法測定芫花素的含量

2.2.1 色譜條件

色譜柱:依利特-C18柱 (200 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-水-冰乙酸(65 ∶35 ∶2，v/v);檢測波長:332 nm;柱溫:40 ℃;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。

2.2.2 對照溶液的制備

精密稱取芫花素對照品約5 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解，并稀釋至刻度，即得200.0 μg/mL的芫花素對照品貯備液。

2.2.3 供試溶液的制備

取了哥王干燥藥材細(xì)粉(過60目篩)約3 g，精密稱定。加90%乙醇90 mL浸泡12 h后，超聲提取3次，每次0.5 h。過濾，合并濾液，減壓蒸干，所得浸膏用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜得續(xù)濾液，即為供試溶液。

2.2.4 色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在2.2.1項(xiàng)色譜條件下，理論板數(shù)按芫花素計(jì)，不低于6 000。芫花素與相鄰組分峰的分離度及其拖尾因子均符合要求。色譜圖見圖2。

2.2.5 線性關(guān)系考察

精密量取芫花素對照品貯備液 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL至25 mL量瓶中定容，制成芫花素系列對照溶液，質(zhì)量濃度分別為0.8、1.6、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/mL。上述系列溶液各進(jìn)樣20 μL，以對照溶液的質(zhì)量濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，芫花素A=1.480×104C-4.012×103，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。結(jié)果表明芫花素質(zhì)量濃度在0.8～32 μg/mL內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取芫花素(8.0 μg/mL)對照溶液 20 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，計(jì)算芫花素峰面積的RSD為2.2%，表明儀器精密度良好。

圖2 了哥王藥材HPLC圖譜

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液(NO.4)，室溫放置，分別于 0、2、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣20 μL，記錄色譜峰面積。計(jì)算芫花素峰面積的RSD為4.1%。結(jié)果表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一了哥王干燥藥材細(xì)粉(NO.6)約3 g，精密稱定，按供試溶液制備方法，平行制備6份供試溶液，進(jìn)樣20 μL，根據(jù)芫花素色譜峰面積，計(jì)算芫花素含量的平均值為28.37 μg/g，RSD為3.4%。結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.9 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的了哥王干燥藥材細(xì)粉(NO.4)約1.5 g(芫花素含量為28.37μg/g)，共9份，分別加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的對照品溶液(分別相當(dāng)于藥材原有含量的50%、100%、150%)，每濃度3份，按供試溶液制備方法制備供試液，分別測定，計(jì)算含量，芫花素的平均回收率為99.8%，RSD為2.1%(n=9)，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.10 樣品測定

精密稱取9個(gè)產(chǎn)地的了哥王干燥藥材細(xì)粉3.0 g，按供試溶液制備方法制備供試溶液，進(jìn)樣分析后，計(jì)算芫花素的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 HPLC分離分析條件的選擇 比較甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸洗脫系統(tǒng)作為流動(dòng)相，二者對色譜峰的分離無明顯差異，故選擇經(jīng)濟(jì)的甲醇系統(tǒng)，比較了磷酸、冰醋酸等酸改性劑，都抑制了峰形的拖尾現(xiàn)象，但冰醋酸的改善峰形的效果較好。調(diào)整流動(dòng)相比例，選用甲醇-水-冰醋酸(65∶35∶2，v/v)時(shí)，樣品中待測成分分離效果較好。

表2 不同產(chǎn)地了哥王藥材中芫花素含量(n=3)

3.2 了哥王中芫花素提取條件的優(yōu)化 比較了回流提取法和超聲提取法，結(jié)果回流提取3次，每次2 h與超聲提取3次，每次0.5 h，二者提取含量接近，因此采用方便省時(shí)的超聲提取法。比較了甲醇、無水乙醇作提取溶劑，二者提取率相近，故選用毒性小的無水乙醇，又比較了體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、90%乙醇，選擇提取率高的90%乙醇。

3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地了哥王中芫花素含量差別明顯，其中江西和廣東產(chǎn)地的了哥王中芫花素含量較高，而貴州、廣西和桂林產(chǎn)地的偏低，可能與藥材產(chǎn)地的地理環(huán)境差異有關(guān)，東南地區(qū)的產(chǎn)量較高，西南地區(qū)產(chǎn)量偏低。

［1］朱亞敏，胡敏燦.了哥王的藥理研究和臨床應(yīng)用［J］.浙江中醫(yī)雜志，2004，(1):42-43.

［2］陳 揚(yáng)，李艷春，馬恩龍，等.了哥王抗腫瘤活性部位篩選［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26(11):2520-2521.

［3］謝宗萬主編.全國中草藥匯編(上冊)［M］.第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1996.

［4］羅獻(xiàn)瑞主編.實(shí)用中草藥彩色圖集［M］.第2版.廣州:廣東科技出版社，2000.

［5］耿立冬，張 村，肖永慶.了哥王中的1個(gè)新雙香豆素［J］.中國中藥雜志，2006，31(1):43-44.