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制備型高效液相色譜法制備和厚樸酚與厚樸酚

2010-01-30 06:23唐驍爽汪永強(qiáng)葛紅麗呂海燕唐玉海
中成藥 2010年11期
關(guān)鍵詞:樣量混合物硅膠

劉 霞, 唐驍爽, 汪永強(qiáng), 葛紅麗, 呂海燕, 唐玉海,*

(1.西安交通大學(xué)理學(xué)院分析科學(xué)研究所,陜西西安710061;2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院,甘肅蘭州730030;3.中科院成都生物所,四川成都610041)

厚樸為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.或凹葉厚樸Magnolia officinalis Rehd.ed Wils.var.biloba Rehd.Et Wils.的干燥干皮,枝皮或根皮,主要化學(xué)成分為和厚樸酚與厚樸酚,約占原藥材的5% ~12%。和厚樸酚與厚樸酚均具有抗菌、抗炎[1],抗氧化作用[2],此外,厚樸酚還具有抗抑郁作用[3],而和厚樸酚(0.1 ~10 μmg/kg)對(duì)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元具有營(yíng)養(yǎng)作用,10 μmg/kg和厚樸酚的營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的活性與40 ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的活性相似[4]。

二者系同分異構(gòu)體,很難分離,本文采用溶劑提取法,利用硅膠柱色譜純化技術(shù)分離得到了4-O-methylhonokiol與和厚樸酚、厚樸酚混合物,再采用制備型高效液相色譜法分離純化和厚樸酚與厚樸酚混合物,運(yùn)用分析型HPLC測(cè)定純度,所得產(chǎn)品純度均大于95%。此方法具有快速、高效、產(chǎn)品純度高的特點(diǎn),可大量制備和厚樸酚與厚樸酚,對(duì)于科學(xué)研究、臨床前和臨床試驗(yàn)具有非常重要的意義,也可制備和厚樸酚與厚樸酚對(duì)照品的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

制備型液相色譜儀;qingqq;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市英峪予華儀器廠);甲醇(色譜純;Fisher Scientific);硅膠G(100~200目,青島海洋化工有限公司);厚樸藥材(陜西西安華陽(yáng)生物科技有限公司);厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品(中國(guó)生物制品檢驗(yàn)鑒定所)。

1.2 色譜條件

分析條件:Akasil-C18柱(4.6 mm ×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-水-冰醋酸(80 ∶20 ∶0.10,V/V/V);流速:0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):294 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

制備條件:Wellchrom K-1800泵;LabAlliance Model 500可變波長(zhǎng)檢測(cè)器;自填 C18柱(50 mm ×300 mm,10 μm);流動(dòng)相甲醇-水-冰醋酸(80 ∶20 ∶0.10,V/V/V);流速80 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm;進(jìn)樣量5 mL(六通閥進(jìn)樣)。

1.3 厚樸中酚類(lèi)化合物的提取

稱(chēng)取厚樸粗粉50 g,90%甲醇回流提取,減壓濃縮,加入2%NaOH溶液,攪拌,靜置,過(guò)濾,在濾液中加2.0 mol/L的鹽酸調(diào)pH值至1~2,靜置,過(guò)濾。用少量氯仿溶解過(guò)濾得的沉淀,過(guò)硅膠柱(柱層析用,100~200目,柱長(zhǎng)約45 cm,內(nèi)徑2.5 cm),以每10 mL洗脫液分段接收。薄層色譜定性每段接受液,減壓濃縮。得到淡黃色油狀化合物以及和厚樸酚與厚樸酚的混合物。

1.4 樣品制備色譜分離

加甲醇溶解和厚樸酚與厚樸酚混合物,采用制備型HPLC進(jìn)行分離純化,多次進(jìn)樣,根據(jù)色譜圖手動(dòng)收集各色譜峰組分,減壓濃縮,析出結(jié)晶,真空干燥。圖1為和厚樸酚與厚樸酚混合物的制備色譜圖。

圖1 樣品的制備色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 厚樸粗提物的硅膠柱色譜純化

根據(jù)厚樸中酚類(lèi)化合物具有弱酸性,采用堿溶解酸沉淀的方法純化甲醇提取液,主要含有和厚樸酚、厚樸酚、以及一個(gè)未知物化合物,峰面積歸一化法測(cè)得三者的含量百分比分別為25.33%、48.51%、15.88%(圖2 A)。采用硅膠進(jìn)一步分離純化,得到淡黃色油狀物,峰面積歸一化法測(cè)得其純度約為95%(圖2 B),以及厚樸酚與和厚樸酚混合物,含量百分比分別為28.94%、63.82%,(圖2 C)所示。

2.2 制備色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 制備色譜流速的選擇

制備色譜條件由高效液相色譜分析條件擴(kuò)展而來(lái),當(dāng)分析型與制備型液相色譜用填料相同,分析型液相色譜向制備型液相色譜轉(zhuǎn)化時(shí),采用放大公式(式中Xp為制備型色譜流速,Xa為分析型色譜流速,rp為制備型柱半徑,為ra分析型柱半徑,CL為制備型色譜柱與分析型色譜柱的長(zhǎng)度之比)[5],制備色譜的理論流速為113 mL/min。當(dāng)流速為113 mL/min時(shí),和厚樸酚與厚樸酚很快的被洗脫出來(lái),但是泵壓很大,分辨率低,兩者的分離效果均不佳,產(chǎn)品純度低。在此基礎(chǔ)上,優(yōu)化最佳流速,選擇流速為80 mL/min。

圖2 A堿溶解酸沉淀后的粗提物色譜圖 B未知化合物的純度測(cè)定色譜圖 C硅膠純化后含和厚樸酚與厚樸酚的色譜圖

2.2.2 最佳進(jìn)樣體積、進(jìn)樣量的優(yōu)化

根據(jù)粗品溶解性能,實(shí)驗(yàn)選擇甲醇為溶劑,確定制備樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL,觀察進(jìn)樣體積對(duì)色譜分辨率影響,隨著進(jìn)樣體積增大,色譜分辨率逐漸降低,色譜峰發(fā)生擴(kuò)散,當(dāng)進(jìn)樣體積大于8 mL時(shí),色譜分辨率急劇下降,且出現(xiàn)嚴(yán)重的峰形不對(duì)稱(chēng)。當(dāng)進(jìn)樣體積越大,餾分中和厚樸酚、厚樸酚的純度降低。因此,選擇進(jìn)樣體積為5 mL。在5 mL進(jìn)樣體積的情況下,隨著進(jìn)樣量的增大,色譜峰變寬,組分峰重疊情況加劇,容量因子K′逐漸減小,分辨率降低,在柱中會(huì)有樣品殘留,影響下一次的分離。因此,選擇最佳進(jìn)樣量為10 mg/mL。

2.3 產(chǎn)品的定性分析及純度檢測(cè)

2.3.1 硅膠分離得淡黃色油狀化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

未知化合物:1H-NMR(400 MHz,CDCl3):δ ppm 3.35(2H,d,aryl-CH2-),3.44(2H,d,aryl-CH2-),3.90(3H,s,-OMe),5.05-5.20(4H,m,2 ×-C=CH2),5.94-6.07(2H,m,2× -CH=C),6.91(1H,d,Ar-H),6.98(1H,d,Ar-H),7.05-7.08(2H,m,ArH),7.24-7.31(2H,m,ArH).13C NMR(400MHz,CDCl3):δ ppm:34.2(C-7),39.3(C-7′),55.5(OMe),110.9(C-3′),115.4(C-4′),115.5(C-9),115.7(C-9′),127.8(C-1′),127.8(C-6),128.7(C-3),129.0(C-1),129.7(C-5),130.1(C-6′),130.4(C-2),132.11(C-5′),136.4(C-8),137.7(C-8′),151.8(C-2′),157.0(C-4). 參考文獻(xiàn)[6],未知化合物為 4-O-methylhonokiol。

2.3.2 制備色譜所得化合物的定性

對(duì)照品定性,制備色譜所得的化合物為和厚樸酚與厚樸酚,產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜檢測(cè),采用峰面積歸一化法,和厚樸酚的純度為99.04%,厚樸酚的純度為98.80%。外標(biāo)法定量,測(cè)得的產(chǎn)品質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為:和厚樸酚98.45%(圖3A);厚樸酚98.01%(圖3B)。測(cè)得所制備的和厚樸酚熔點(diǎn)為87~88℃,厚樸酚熔點(diǎn)為103~104℃。

圖3A 和厚樸酚的純度色譜圖

圖3B 厚樸酚的純度色譜圖

2.3.3 結(jié)構(gòu)鑒定

和厚樸酚:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ ppm:3.33(2H,d,aryl-CH2-),3.44(2H,d,aryl-CH2-),5.04-5.22(4H,m,2 × -C=CH2),5.36(2H,brs,2 ×-OH),5.92-6.08(2H,m,2× -CH=C),6.88-7.25(6H,m,ArH).13C NMR(400MHz,CDCl3)δ ppm:35.1(C-7),39.4(C-7′),115.5(C-3),115.6(C-9′),116.5(C-5′),116.8(C-9),126.4(C-1′),127.7(C-1),128.5(C-6′),128.8(C-4),129.6(C-3′),130.2(C-2′),131.1(C-6),132.2(C-5),136.0(C-8′),137.8(C-8),150.7(C-2),153.90(C-4′).與文獻(xiàn)[6]一致。

厚樸酚:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ ppm:3.37(2H,d,aryl-CH2-),3.39(2H,d,aryl-CH2-),5.08-5.13(4H,m,2× -C=CH2),5.93-6.09(2H,m,2× -CH=C),6.92(2H,br s,2× -OH),6.94-7.26(6H,m,ArH).13C NMR(400MHz,CDCl3)δ ppm:39.3(C-7,7′),115.8(C-9,9′),116.8(C-3,3′),124.2(C-1,1′),129.8(C-4,4′),131.3(C-6,6′),133.3(C-5,5′),137.6(C-8,8′),150.8(C-2,2′).與文獻(xiàn)[6]一致。

3 結(jié)論

隨著和厚樸酚與厚樸酚藥理作用研究的不斷深入,此類(lèi)化合物及其對(duì)照品在實(shí)驗(yàn)室的需求量也日益增加。本試驗(yàn)采用硅膠柱層析與制備型高效液相色譜法分離得到4-O-methylhonokiol、和厚樸酚、厚樸酚,制備色譜法分離和厚樸酚與厚樸酚不僅能夠得到高純度的化合物單體,而且產(chǎn)率高,操作方便,便于收集,純度均大于98%,可作為對(duì)照品使用。該色譜分離方法為在天然產(chǎn)物中分離高純度的化合物單體提供了參考。

致謝 感謝西安交大保賽技術(shù)總監(jiān)常建華教授以及華陽(yáng)生物科技有限公司在工作中的幫助與指導(dǎo)。

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[5]趙維民,張?zhí)煊?,譯.霍斯泰特曼K,馬斯頓A.制備色譜技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,2000:64,142.

[6]鄧世明,程永現(xiàn),周 俊.長(zhǎng)緣厚樸中新苯醌及新木脂素類(lèi)化合物[J].云南植物研究,2001,23(1):121-125.

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