戴 敬， 楊曉婧， 郝培培， 馮 麗， 李建晨

(1.河北省藥品檢驗(yàn)所，河北石家莊050011;2.河北科技大學(xué)，河北石家莊050018)

女金丸系由當(dāng)歸、白芍、肉桂、益母草、牡丹皮、延胡索、黃芩、陳皮等二十三味中藥制成的大蜜丸或水蜜丸，具益氣養(yǎng)血，理氣活血，止痛之功效，用于氣血兩虛、氣滯血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)［1］340。女金丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2005年版一部，標(biāo)準(zhǔn)中僅有丹皮酚、桂皮醛和黃芩苷3項(xiàng)薄層色譜鑒別，并且鑒別方法尚不完善，如丹皮酚的鑒別前處理方法較難操作;桂皮醛的鑒別采用的展開劑含因毒性較大而被禁用的溶劑苯，黃芩苷的鑒別重現(xiàn)性較差等問題，因此我們對(duì)女金丸的薄層鑒別方法進(jìn)行了研究，不僅對(duì)現(xiàn)有鑒別進(jìn)行了改進(jìn)和完善，還研究建立了白芍、益母草、延胡索、陳皮的薄層色譜鑒別方法。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

瑞士CAMAG REPROSTAR 3薄層色譜數(shù)碼相機(jī)成像系統(tǒng)。

1.2 對(duì)照品、對(duì)照藥材

均由中國藥品生物制品檢定所提供:丹皮酚(批號(hào):0708-9704)，桂皮醛(批號(hào):111710-200513)，黃芩苷(批號(hào):110715-200514)，芍藥苷(批號(hào):0736-200219)，鹽酸水蘇堿(批號(hào):110712-200508);延胡索(批號(hào):120928-200604)，黃芩(批號(hào):120955-200406)，陳皮(批號(hào):120969-200406)。

1.3 女金丸樣品

大蜜丸由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠(批號(hào):4013142、7013422、6013332)、哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠(批號(hào):0708141、0709104)、河北世濟(jì)唐威藥業(yè)有限公司(批號(hào):20070526)、包頭中藥有限責(zé)任公司(批號(hào):071113)、亞寶藥業(yè)大同制藥有限公司(批號(hào):20070123)提供;水蜜丸由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠(批號(hào):8035235 25)、黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司(批號(hào):20071103、20071104、20071105)、吉林雙士藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號(hào):081001、081101、081102)、西安自力藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號(hào):20060701、20060702)提供。各陰性對(duì)照樣品根據(jù)處方及制法自制。

1.4 試劑

大孔吸附樹脂60～16目，D-101凈品型，天津市海光化工有限公司生產(chǎn);聚酰胺100～200目、聚酰胺薄膜均由浙江省臺(tái)州市陸橋四甲生化塑料廠生產(chǎn);中性氧化鋁100～200目上海五四化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);活性炭天津市紅巖化學(xué)試劑廠生產(chǎn);732陽離子交換樹脂國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);其他試劑均為分析純。

1.5 硅膠G預(yù)制薄層板

青島海洋化工廠分廠生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1丹皮酚的TLC鑒別

取本品水蜜丸10 g，研碎;或取大蜜丸18 g，剪碎。置500 mL圓底燒瓶中，加水200 mL，連接揮發(fā)油測(cè)定器，自測(cè)定器上端加水至刻度并溢流入燒瓶時(shí)為止，再加入石油醚(60～90℃)1 mL，連接回流冷凝器，加熱并保持微沸1 h，放冷，取石油醚層作為供試品溶液。另取丹皮酚對(duì)照品，加石油醚(60～90℃)制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(3∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液-鹽酸(50∶1)。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。牡丹皮與白芍陰性對(duì)照無干擾，方法具專屬性(見圖1)。

圖1 丹皮酚TLC鑒別照片

2.2 桂皮醛的TLC鑒別

取2.1項(xiàng)下的供試品溶液作為供試品溶液。另取桂皮醛對(duì)照品，加石油醚(60～90℃)制成每1 mL含0.5 μL的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液5 μL、對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(17 ∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液，放置至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。肉桂陰性對(duì)照無干擾，方法具專屬性(見圖2)。

圖2 桂皮醛TLC鑒別照片

2.3 延胡索的TLC鑒別

取本品水蜜丸10 g，研碎，加氨水5 mL;或取大蜜丸18 g，剪碎，加硅藻土10 g，研勻，加濃氨溶液10 mL，密塞，振搖，放置10 min，加三氯甲烷60 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液濃縮至約10 mL，移置分液漏斗中，用0.5 mol/L的鹽酸溶液振搖提取2次，每次10 mL，合并酸溶液，加濃氨溶液5 mL(使pH值11以上)，用三氯甲烷振搖提取2次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，殘?jiān)尤燃淄槿芙馐钩?.5 mL，作為供試品溶液。另取延胡索對(duì)照藥材0.5 g，加濃氨溶液0.5 mL，振搖，放置10 min，加三氯甲烷20 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取供試品溶液10～20 μL、對(duì)照藥材溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮(9∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)。延胡索陰性對(duì)照無干擾，方法具專屬性(見圖3)。

圖3-A 延胡索TLC鑒別照片

2.4 黃芩TLC鑒別

圖3-B 延胡索TLC鑒別照片

取本品水蜜丸5 g，研碎;或取大蜜丸9 g，剪碎，加硅藻土5 g，研勻，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀? mL使溶解，用脫脂棉濾過，濾液加于D101型大孔吸附樹脂柱(16～60目，內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為15 cm)上，流速為1.0～1.5 mL/min，依次以水、30%乙醇各50 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇50 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0%乙醇5 mL溶解，加于聚酰胺柱(100～200目，1 g，內(nèi)徑為1 cm，用水濕法裝柱)上，用50%乙醇10 mL洗脫，收集流出液及洗脫液，備用，繼用乙醇10 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芩對(duì)照藥材0.1 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min，搖勻，靜置，取上清液作為對(duì)照藥材溶液。再取黃芩苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以36%醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。黃芩陰性對(duì)照無干擾，方法具專屬性(見圖4)。

圖4-A 黃芩TLC鑒別照片

圖4-B 黃芩TLC鑒別照片

2.5 陳皮的TLC鑒別

取2.4項(xiàng)下備用的聚酰胺柱50%乙醇洗脫液，在水浴上蒸除乙醇，加水至約5 mL，移置分液漏斗中，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次5 mL，合并乙酸乙酯液(水溶液備用)，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取陳皮對(duì)照藥材0.1 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min，搖勻，靜置，取上清液作為對(duì)照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(28∶10∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，在105℃加熱5 min，放冷，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陳皮陰性對(duì)照無干擾，方法具專屬性(見圖5)。

圖5-A 陳皮TLC鑒別照片

圖5-B 陳皮TLC鑒別照片

2.6 芍藥苷的TLC鑒別

取2.5項(xiàng)下乙酸乙酯提取后的水溶液，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次8 mL，合并正丁醇提取液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL分次溶解，加于中性氧化鋁柱(100～200目，2 g，內(nèi)徑為1 cm，干法裝柱)上，用80%甲醇20 mL洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15 ∶40 ∶18 ∶10)10℃以下放置12 h的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。白芍與牡丹皮陰性對(duì)照無干擾，方法具專屬性(見圖6)。

圖6-A 芍藥苷TLC鑒別照片

圖7-A 益母草TLC鑒別照片

圖6-B 芍藥苷TLC鑒別照片

圖7-B 益母草TLC鑒別照片

2.7 鹽酸水蘇堿TLC鑒別

取本品水蜜丸5 g，研碎;或取大蜜丸9 g，剪碎，加水60 mL，攪拌使溶散，微沸回流30 min，放冷，離心，取上清液，加稀鹽酸調(diào)pH至1～2，離心，取上清液，濾過，濾液通過已處理好的732陽離子交換樹脂柱(粒度為0.3～1.2 mm，內(nèi)徑為10 mm，柱高為15 cm)，流速為1.0～1.5 mL/min，以水洗至洗脫液近無色，棄去洗脫液，再以氨水溶液(15→100)30 mL洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘?jiān)?0%乙醇10 mL分次溶解，加于活性炭-中性氧化鋁柱(活性炭100目以上，0.3 g;中性氧化鋁100～200目，2 g;混勻，裝柱，內(nèi)徑為15 mm)上，用80%乙醇20 mL洗脫，收集流出液與洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取鹽酸水蘇堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述兩種溶液各2～5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正丁醇-鹽酸-乙酸乙酯(8 ∶3 ∶1)為展開劑，展開，取出，晾干12 h以上，噴以稀碘化鉍鉀試液，放置2～3 h，在日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。益母草陰性對(duì)照無干擾，方法具專屬性(見圖7)。

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)建立了處方藥味牡丹皮與白芍所含丹皮酚的TLC鑒別方法。該方法供試品溶液制備采用揮發(fā)油提取法，避免了硅藻土研磨操作和大量有機(jī)溶劑的使用，達(dá)到簡化操作，環(huán)保的目的。采用氫氧化鈉改性硅膠G板進(jìn)行薄層層析，可以充分消除雜質(zhì)的干擾。

3.2 由于桂皮醛與丹皮酚的理化性質(zhì)相似，故桂皮醛的鑒別采用與丹皮酚鑒別相同的供試品溶液。2005版中國藥典采用的展開劑含有因毒性較大目前被禁用的溶劑苯，所以我們經(jīng)實(shí)驗(yàn)改變了展開劑的種類和配比，使用毒性較小的溶劑替代了苯。顯色時(shí)，斑點(diǎn)隨放置時(shí)間延長而加深，以放置0.5～1 h后觀察為宜。

3.3 延胡索的主要成分是生物堿類使用氫氧化鈉改性的硅膠G板進(jìn)行薄層層析，可有效改善斑點(diǎn)拖尾現(xiàn)象，展開后的薄層板噴顯色劑后，可覆蓋同樣大小的玻璃片放置一定時(shí)間，板面背景顏色會(huì)逐漸變淺，會(huì)利于觀察斑點(diǎn)顯色情況。

3.4 大孔吸附樹脂柱洗脫溶劑考察結(jié)果表明水和30%乙醇洗脫液中不含黃芩苷，50%乙醇和70%乙醇洗脫液中均含有黃芩苷，故以70%乙醇洗脫。聚酰胺柱洗脫溶劑考察結(jié)果表明50%乙醇洗脫液不含黃芩苷，70%乙醇和乙醇洗脫液中均含黃芩苷，故以乙醇洗脫。曾試用展開劑乙酸乙酯-甲酸(6∶1)，雖然色譜斑點(diǎn)較圓整，但由于陰性有干擾而無法采用，故選用36%醋酸為展開劑。采用黃芩苷對(duì)照品與黃芩對(duì)照藥材同時(shí)作對(duì)照，可以獲得較多的鑒別信息。

3.5 陳皮的供試品溶液制備采用聚酰胺柱50%乙醇洗脫部分，再經(jīng)乙酸乙酯萃取制得。由于橙皮苷對(duì)照品較難溶解，故以陳皮對(duì)照藥材作對(duì)照，對(duì)照藥材制備方法也較簡便，薄層色譜結(jié)果令人滿意。

3.6 芍藥苷供試品溶液采用鑒別陳皮時(shí)用乙酸乙酯提取后剩下的水溶液經(jīng)正丁醇萃取制得，可以減少檢驗(yàn)樣品用量并簡化操作。使用硅膠G薄層板進(jìn)行薄層層析，結(jié)果空白對(duì)照色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯同樣的淡紅色斑點(diǎn)，陰性有干擾。改用氫氧化鈉改性的硅膠G薄層板進(jìn)行薄層層析，可以充分消除陰性的干擾，提高了方法的專屬性。曾試用展開劑三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40 ∶5 ∶10

∶0.2)和三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15 ∶40 ∶22 ∶10)10℃以下放置12 h的下層溶液為展開劑，因色譜結(jié)果均不理想而未予采用。

3.7 益母草供試品溶液的制備采用了732強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂選擇性吸附生物堿，達(dá)到與糖、蜜等水溶性成分分離目的。再經(jīng)活性炭-中性氧化鋁柱進(jìn)一步凈化除雜，供試液點(diǎn)樣容易，色譜結(jié)果無背景，斑點(diǎn)清晰。曾試用展開劑醋酸乙酯-無水乙醇-甲酸(3 ∶2 ∶2)、丙酮-無水乙醇-鹽酸(10∶6∶1)，因色譜結(jié)果均不理想而未予采用。噴顯色劑后開始斑點(diǎn)較淡，放置約2～3 h更容易觀察。

［1］中國藥典［S］.一部.2005.

［2］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典中藥材薄層色譜彩色圖集(第一冊(cè))［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:262.