林森 李文峰 張春鴻 方瀟碧 方渭清 廖志蘇

鼻咽癌是耳鼻咽喉頭頸外科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，放療是鼻咽癌目前主要的治療手段，然而初發(fā)鼻咽癌(primary nasopharyngeal carcinoma,pNPC)患者即使經(jīng)過(guò)合理放療和規(guī)范的綜合治療后，仍有部分患者出現(xiàn)鼻咽局部和(或)頸淋巴結(jié)引流區(qū)腫瘤復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率介于8.6%～23.7%[1]。從分子水平探索鼻咽癌相關(guān)基因有助于了解癌變機(jī)制，從中可能找到特征性腫瘤標(biāo)記及治療靶點(diǎn)，是進(jìn)一步提高鼻咽癌防治水平的方向。本研究以pNPC與正常鼻咽黏膜、pNPC與復(fù)發(fā)鼻咽癌(recurrent nasopharyngeal carcinoma,rNPC)兩組為研究對(duì)象，應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)兩組基因差異表達(dá)，分析相關(guān)基因及其功能，以探討pNPC、rNPC癌變分子機(jī)制、臨床分子診斷以及基因治療的靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究共收集pNPC 8例，rNPC 5例，正常鼻咽黏膜3例。pNPC組男性5例，女性3例；年齡28～68歲；經(jīng)病理組織學(xué)均確診為低分化鱗狀細(xì)胞癌；CT、磁共振成像及發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層成像等檢查未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。rNPC組男性3例，女性2例；年齡45～68歲；首次放療后2～6年發(fā)生局部復(fù)發(fā)；病理確診為低分化鱗狀細(xì)胞癌；經(jīng)檢查未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。正常鼻咽黏膜組織3例，均經(jīng)病理確診。在電子鼻咽纖維鏡直視下取活檢組織,分為2份,1份送病理檢查,1份馬上放液氮中凍存。均由本院耳鼻咽喉科提供。實(shí)驗(yàn)分組：pNPC與正常鼻咽黏膜組織和rNPC與pNPC組織。

1.2 方法 采用TRIzol總RNA 提取試劑對(duì)兩組分別進(jìn)行組織總RNA提取，用分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度和純度，-80 ℃保存?zhèn)溆?。利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptional polymerase chain reaction,RT-PCR)，經(jīng)兩輪逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，純化cDNA和片段化單鏈DNA片，加試劑到片斷化的DNA中，混勻，取2 μL樣品檢測(cè)標(biāo)記效率。在1.5 mL離心管中準(zhǔn)備雜交液，混勻，離心，然后在Affymetrix Fluidics Station450洗滌站中洗滌。

Gene array Scanner 3000掃描,經(jīng)GCOS軟件處理給出數(shù)據(jù)。將GCOS軟件讀取的芯片數(shù)據(jù)輸入GeneSpring6.1軟件分析,根據(jù)芯片探針設(shè)計(jì)特點(diǎn),設(shè)定篩選條件為：以組間2倍以上差異表達(dá)為條件且P<0.001分別對(duì)pNPC與正常鼻咽黏膜和rNPC與pNPC兩組差異基因進(jìn)行篩選。從差異表達(dá)基因中隨機(jī)選擇4 個(gè)感興趣基因,內(nèi)參采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶,采用RT-PCR 檢測(cè)上述4個(gè)基因的表達(dá)來(lái)驗(yàn)證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié) 果

兩組標(biāo)本RNA無(wú)降解，質(zhì)量合格。為獲取基因芯片數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩組樣本分別進(jìn)行3次重復(fù)基因芯片檢測(cè)，取重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果存在大量差異表達(dá)基因(見(jiàn)表1)。其中與pNPC相關(guān)的基因394個(gè)，上調(diào)2倍以上161個(gè)，下調(diào)2倍以上233個(gè)；與rNPC發(fā)病相關(guān)的基因104個(gè)，上調(diào)2倍以上89個(gè)，下調(diào)2倍以上15個(gè)；RT-PCR驗(yàn)證：實(shí)驗(yàn)結(jié)果中選取4個(gè)基因，結(jié)果與基因芯片結(jié)果基本一致(見(jiàn)附2頁(yè)圖①)。

表1 用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長(zhǎng)度

對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行聚類分析：pNPC組織和正常鼻咽黏膜組織聚類分析及pNPC組織和rNPC組織聚類分析分別見(jiàn)附2頁(yè)圖②和圖③。

利用Gene Ontology對(duì)pNPC相關(guān)394個(gè)基因和rNPC相關(guān)104個(gè)基因功能進(jìn)行分類(見(jiàn)附2頁(yè)圖④和圖⑤)。分別從2組差異基因表達(dá)譜對(duì)比中挑選出與pNPC、rNPC相關(guān)的可能與癌變相關(guān)的基因(詳見(jiàn)表2)。

表2 初發(fā)、復(fù)發(fā)鼻咽癌相關(guān)的部分上調(diào)和下調(diào)基因

3 討 論

基因芯片是一項(xiàng)高通量篩選技術(shù),能同時(shí)篩檢眾多基因的差異表達(dá)，提供了從整體上分析腫瘤細(xì)胞表達(dá)的信息，為腫瘤診斷、預(yù)防和治療提供依據(jù)。本研究使用基因芯片篩選pNPC與正常鼻咽黏膜及pNPC與rNPC的差異基因表達(dá)，以期發(fā)現(xiàn)其癌變分子過(guò)程以及可能相關(guān)的候選基因。

實(shí)驗(yàn)用Affymetrix Gene 1.0 ST芯片檢測(cè)到與pNPC相關(guān)差異基因394個(gè)，基因功能涉及蛋白結(jié)合和鈣離子結(jié)合、酶活性相關(guān)、免疫相關(guān)等 ，可以推測(cè)這些基因在pNPC癌變發(fā)生過(guò)程中可能扮演重要角色。芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)與pNPC相關(guān)的差異基因有S100A9、KRT6B、 LSAMP、TNFAIP3等。Li等[2]通過(guò)Western blotting和免疫組織化學(xué)方法進(jìn)一步證實(shí)在鼻咽癌組織與正常鼻咽組織中S100A9表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Sengupta等[3]發(fā)現(xiàn)keratins家族包括KRT4、KRT6B、KRT14、KRT23和KRT24，在鼻咽癌組織中顯著下調(diào)；在未分化鼻咽癌以及頭頸鱗狀細(xì)胞癌TNFAIP3高表達(dá)，提示TNFAIP3在這些腫瘤發(fā)病過(guò)程中起重要作用[4]；目前尚罕見(jiàn)報(bào)道LSAMP與鼻咽癌有明顯相關(guān)性，但最近發(fā)現(xiàn)其在骨肉瘤中是一個(gè)新的抑癌基因[5]。還有學(xué)者[6-9]研究發(fā)現(xiàn)與鼻咽癌相關(guān)的基因有：CCL20在鼻咽癌腫瘤細(xì)胞中顯著表達(dá)，可能是鼻咽癌的一種新的生物標(biāo)記；潛伏膜蛋白1可能是通過(guò)MMP1促進(jìn)鼻咽癌發(fā)生與轉(zhuǎn)移；p63基因是屬于鼻咽癌的候選抑癌基因p53的家庭成員之一，p63與細(xì)胞分裂周期有關(guān)，在鼻咽癌細(xì)胞增殖中扮演重要角色，在鼻咽癌組織低表達(dá)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LTF在鼻咽癌組織低表達(dá)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

本文結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，與pNPC相關(guān)差異基因有CCL21、CXCL10、MMP3、MMP12、TNF、MSMB等。其中可能與鼻咽癌發(fā)病相關(guān)的有CXCL10、MMP3、MMP12和TNF等。如MMP家族促進(jìn)癌癥發(fā)生、發(fā)展，其中MMP2在中國(guó)大陸鼻咽癌患者的易感性方面起重要作用；還有在大多數(shù)鼻咽癌腫瘤細(xì)胞中可檢測(cè)到CXCL10顯著表達(dá)[10-11]等。其他差異基因如CCL21，Mumtaz等[12]通過(guò)免疫組織化學(xué)方法研究表明了在大腸組織CCL21低表達(dá)表明癌變與可能依靠由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)因子免疫缺陷有關(guān)以及在大腸CCL21不同水平表達(dá)可能在大腸癌變中有不同機(jī)制。然而這些基因是否與初發(fā)鼻咽癌有關(guān)，有待更加深入研究。

實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)到pNPC組織與rNPC組織之間的差異基因數(shù)目為104個(gè)，涉及功能包含有蛋白結(jié)合和鈣離子結(jié)合、酶活性、細(xì)胞外基質(zhì)、通道和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等。研究發(fā)現(xiàn)，rNPC相關(guān)基因與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后不良明顯相關(guān)，如CLCA2、S100A8、keratin 17、peptidase inhibitor 3等。有研究[13]結(jié)果顯示CLCA2作為p53可誘導(dǎo)生長(zhǎng)抑制因子，說(shuō)明它的下調(diào)有利于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，與腫瘤預(yù)后、治療有關(guān)。 還有S100A8 和S100A9在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中過(guò)度表達(dá)可認(rèn)為是預(yù)后不良的標(biāo)記之一[14]。van de Rijn等[15]研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中keratin 17和keratin 5/6與預(yù)后不良有關(guān)。因此可以推測(cè)CLCA2、S100A8、keratin 17等基因可能與鼻咽癌的復(fù)發(fā)有關(guān)，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上，篩選pNPC、rNPC癌變相關(guān)基因有助于從分子水平闡明其發(fā)病機(jī)制,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的分子診斷指標(biāo)和基因治療靶標(biāo)。如何從本研究結(jié)果中尋找對(duì)癌變發(fā)生起重要作用的相關(guān)候選基因，并對(duì)這些基因進(jìn)一步深入研究，有助于pNPC、rNPC分子機(jī)制的闡明，并為篩選腫瘤標(biāo)記物和鼻咽癌基因治療奠定基礎(chǔ)。

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