郭慶海

摘要在制備雛雞透明骨骼標本的過程中，首先進行材料的處理，然后用乙醇固定，氫氧化鉀透明，茜素乙醇飽和液染色，氫氧化鉀和甘油混合液褪色，甘油保存。最后制得的標本生動形象，易于對骨骼進行原位觀察，立體感比較強，能從整體上顯現(xiàn)出骨骼系統(tǒng)在體內(nèi)的自然分布和位置，也能顯現(xiàn)動物體內(nèi)骨骼系統(tǒng)的發(fā)育狀況，是較為理想的骨骼標本制作方法。

關(guān)鍵詞雛雞標本透明骨骼標本固定標本制作

中圖分類號Q-34文獻標識碼B

透明骨骼標本對于研究動物的骨骼及其發(fā)育具有重要的參考價值，其可以顯示一般解剖方法難以觀察清楚的結(jié)構(gòu)，并在保持標本外形完整的情況下顯示出體內(nèi)骨骼部分，從而顯示出生物體的骨骼發(fā)育情況，因而無論在教學(xué)方面還是科學(xué)研究方面都有其實際意義。

透明骨骼標本的制作原理是應(yīng)用化學(xué)藥品和物理方法作用于肌體組織，使組織的折光率和透明劑的折光率相近，以達到透明的目的。小型動物因骨骼纖細軟弱，且小型動物的骨骼各個關(guān)節(jié)部位沒有完全骨化，制作單獨骨骼標本很困難，而制作透明骨骼標本解決了這些難點，且制作出來的透明標本清晰美觀、有立體感，因此，一般小型的脊椎動物都適合做透明骨骼標本。

透明骨骼染色法簡單，易于識別軟硬骨，成本低，國外廣泛使用，但在國內(nèi)則應(yīng)用較少，且由于傳統(tǒng)的透明骨骼標本制作技術(shù)的透明過程復(fù)雜，時間長，有時甚至幾個月，國內(nèi)研究較少。近年來，人們逐漸認識到透明骨骼標本在教學(xué)和科研中的重要作用，開始進行透明骨骼標本的制作，李錦和楊振坦等曾對動物透明骨骼標本做過一些研究，但仍存在一些不足。此外還有一些專家學(xué)者對鳥類以及動物的胚胎進行了研究，且傳統(tǒng)的透明骨骼標本的制作多采用20日齡左右的鳥類，但剛出殼的雛雞從來沒有人做過透明骨骼標本。

為此，本次實驗選用1日齡的烏骨雞雛雞和3日齡的羅曼蛋雞雛雞作為實驗材料，于2009年3-5月采用茜素乙醇飽和溶液進行硬骨染色，使雛雞的全部骨骼在不受任何損傷的情況下清楚的展示出來，制作好的透明標本其肌肉和軟組織結(jié)構(gòu)無色透明，而骨化中心和硬骨組織被染成紫紅色，界限清晰，易于識別，能提供傳統(tǒng)解剖方法不宜得到的信息。現(xiàn)將具體方法及結(jié)果介紹如下。

1材料與方法

1，1供試材料

制作透明骨骼標本的材料要求新鮮，最好是活體或剛剛死去的動物尸體，不新鮮的組織透明效果不好，我們所選用的實驗材料為1日齡的烏骨雞雛雞和3日齡的羅曼蛋雞雛雞，這些雛雞均購置于徐州市果園種雞場，健康且發(fā)育良好。

1，2方法

1，2，1材料的處理

使雛雞窒息而亡，去皮和內(nèi)臟，去皮時應(yīng)先從腹下部提起皮膚，開一“+”型小口，分別向前向后撕去皮，腿部及爪部應(yīng)小心操作，去內(nèi)臟時從肛前開一小口從中掏出內(nèi)臟，且一定要去干凈，并注意保持形體完整。

1，2，2固定

將經(jīng)上述處理后的雛雞，綁在玻璃片上，整理好姿勢后浸在95％乙醇中固定5-7 d，使標本有良好的形態(tài)，利于觀察研究。具體時間要根據(jù)動物的體形大小而定，且要求在固定期間更換1～2次固定液，直至雛雞硬化固定充分為宜。

1，2，3透明

將固定好的雛雞標本移入1％氫氧化鉀溶液中浸泡2-3 d，待肌肉半透明能隱約看到里面的骨骼時就要停止透明，如果浸制標本沒有出現(xiàn)半透明，還要更換一次透明液，直至達到滿意效果為止。此步驟的目的是使標本組織膨脹軟化，利于骨組織的染色。

1，2，4染色

將透明好的能隱約看到里面白色骨骼的標本放人茜素紅乙醇染色液中進行染色1－2 d，至肌肉成凍狀，并可看見骨組織染上紅色為止。茜素乙醇染色液的配制是：先將茜素紅染料溶于95％乙醇制成飽和溶液，然后用1份配好的茜素乙醇飽和液加9份70％乙醇。

1，2，5肌肉的褪色

將1％的氫氧化鉀溶液與5％的甘油溶液以1：1的比例配成混合液，將標本浸泡在混合液中，時間為2-4 d，直至肌肉顏色褪為淡紅色為止。

1，2，6再透明

為了提高透明質(zhì)量，把標本放人氫氧化氨甘油中(75mL水中加入20mL甘油和5mL氫氧化氨)進行漂白透明。然后，再將標本放入25％甘油中浸16 d左右，使標本更加透明，再放入50％甘油中浸2-4 d，脫水，直到標本肌肉完全透明為止。

1，2，7標本的保存

將再透明好的標本調(diào)整好姿態(tài)，使其趨于美觀，放人大小適宜的標本瓶中，用100％甘油浸泡保存，并加入少許麝香草酚以防腐敗和發(fā)霉，瓶口用防水不干膠密封。

2結(jié)果與分析

此次實驗選用了雛雞烏骨雞與羅曼蛋雞雛雞兩種材料，獲得了一套制作雛雞透明骨骼標本的初步制作方法。制好的羅曼蛋雞透明骨骼標本其肌肉和軟組織結(jié)構(gòu)無色透明，而骨化中心和硬骨組織被染成紅色，界限清晰，易于識別，能提供傳統(tǒng)解剖方法不宜得到的信息，顯示出雛雞體內(nèi)骨骼系統(tǒng)的自然分布和位置，立體感比較強。

但實驗中對烏骨雞雖采用同樣的制作方法但效果并不好，可能是由于雛雞烏骨雞的肌肉等組織為黑色，不容易觀察標本制作過程中的透明效果、褪色效果所致。

整個實驗過程均是在室內(nèi)常溫下進行的，且放置于向陽處，保證溫度在20-30℃之間，因溫度高低可影響制作周期，溫度高可縮短制作周期，溫度低則相反，3、4、5三個月溫度剛好適宜。但制好的標本不能讓陽光直射，因為透明物質(zhì)在陽光下會分解，出現(xiàn)渾濁，影響觀察標本的效果。

制作好的雛雞透明骨骼標本其肌肉組織無色透明，因為最初實驗時就避免了影響標本“無色透明”的因素，例如，雛雞選用活的即是新鮮的，去凈了皮和內(nèi)臟，因為腐敗和淤血的材料會影響標本的透明度；藥品力求純凈清潔，因為雜質(zhì)可能使標本染上雜色；水選用蒸餾水，因為自來水中有雜質(zhì)不宜用于制作透明標本。

3討論

此次實驗是在不斷改進中進行的，即實驗中因個別環(huán)節(jié)的失誤導(dǎo)致實驗效果不佳甚至失敗重做。如實驗中一開始由于染色液配制的濃度較高，最后經(jīng)染色的標本在褪色過程中，其肌肉的顏色很難褪去，只好重新開始再做。一般來說，選用低濃度長時間的染色方法的染色效果比高濃度短時間較理想，染色時要經(jīng)常察看，掌握染色時間和染色程度，否則同樣容易產(chǎn)生染色過度，造成脫色困難。

實驗中還發(fā)現(xiàn)，若標本含有的脂肪組織較多，在固定后應(yīng)進行脫脂操作，可選用丙酮或二甲苯脫脂3—7 d，這樣制作的標本效果較好，若標本含有的脂肪組織較少，可不需要進行脫脂操作，因為固定液乙醇和透明液KOH都具有一定的脫脂能力。

通常制作透明骨骼標本的鳥類大多選用20日齡，實驗時特意選用了1日齡和3日齡的雛雞進行實驗，發(fā)現(xiàn)1日齡和3日齡的雛雞同樣可以做標本。只是由于1日齡和3日齡的雛雞肌肉很薄嫩，實驗時應(yīng)該隨時注意觀察，時間上要靈活掌握，尤其是透明這一步驟，適當降低透明液KOH的濃度會更好，常用的濃度為2％，此時可用1％，不能為了加快速度而提高堿液濃度。另外實驗時一定要隨時觀察，發(fā)現(xiàn)肌肉稍透明，隱約可見骨骼就必須立即取出材料，更換溶液，否則時間過長就會使骨架解離，肌肉腐蝕。因為氫氧化鉀是強堿，具有腐蝕性，可使組織膨脹軟化，堅實性大為減低。

制作烏骨雞透明骨骼標本的過程中，發(fā)現(xiàn)適當?shù)难娱L固定以及透明時間很有必要。實驗中，透明之后烏骨雞就能通過肌肉看到里面的骨骼，后來又進行了染色操作，這倒使得骨骼看不大清楚，因而由于烏骨雞骨骼為黑色可不進行染色操作，只要能夠很好的透明，當然若能夠去掉肌肉的顏色，效果會更好。至于如何把肌肉等組織帶有特殊顏色的小型脊椎動物做成理想的透明骨骼標本，還有待進一步的探索研究。