高　燕　袁愛軍　陳　航　賈海紅　袁魯亮　王茹欣

【摘要】 目的 觀察紅花黃色素注射液對腎間質(zhì)纖維化大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的的影響，探討其腎臟保護(hù)機(jī)制。方法 45只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction; UUO)組(B組)、UUO聯(lián)合紅花黃色素治療組(C組)，各15只。C組紅花黃色素5 mg/(kg?d)，造模術(shù)前1 d開始腹腔注射給藥，各組術(shù)后10 d處死大鼠，處死后取術(shù)側(cè)腎組織行HE、Masson染色，TUNEL法檢測腎小管上皮細(xì)胞凋亡。結(jié)果 B組、C組可見明顯腎間質(zhì)纖維化的病理改變，可檢測到凋亡細(xì)胞。C組與B組相比，腎間質(zhì)纖維化病變程度較輕，凋亡細(xì)胞明顯減少(P<0.01)。結(jié)論 注射用紅花黃色素對大鼠腎間質(zhì)纖維化有保護(hù)作用，這種作用可能通過抑制腎小管細(xì)胞過度凋亡實(shí)現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】紅花黃色素；腎間質(zhì)纖維化；腎小管上皮細(xì)胞；凋亡

Effect of safflow yellow injection on apoptosis ofRenal tubular cells In rats with renal interstitial fibrosis

GAO Yan，YUAN Ai-jun，CHEN Hang，et al.The Affiliated Hospital of Hebei University，Baoding，Hebei 071000,China

【Abstract】 Objective To observe the effect and mechanism of Safflow Yellow (SY) on apoptosis of renal tubular cells in rats with renal interstitial fibrosis.Methods 45 Male Sprague-Dawley rats were randomly divide into 3 groups:sham-operated group(A)，the UUO model group(B) and the treatment group treated with Safflow Yellow injection(C).Safflow Yellow injection 5 mg/(kg?d) was administered to rats 1 day before to 9 day after the surgery.Kidney were harvest at day 10.Histological changes were also observed by HE and Masson stain.Apoptosis of renal tubular cells was detected by terminal deoxynucleotidy 1 transferasemediated dUTP nick endlabeling assay(TUNEL).Results Markedrenal interstitial fibrosis changes were found in group B and group C.the lesion area in kidneys of group C significantly decreased compared with that of group B(P<0.01).apoptosis cells in renal tubular were significantly increased in the obstructed kidney and reduced by Safflow Yellow injection treatment(P<0.01).Conclusion Safflow Yellow could ameliorate renal interstitial fibrosis in rats，which might be realized by reducing renal tubular cell apoptosis.

【Key words】Safflow yellow;Renal interstitial fibrosis ;Tubular epithelial cells;Apoptosis

紅花黃色素是紅花中多種水溶性有效成分的混合物，屬查爾酮類有效部位群。多年來，研究發(fā)現(xiàn)其具有擴(kuò)張冠狀動脈、抗血栓、抗動脈粥樣硬化、降血脂、耐缺氧等藥理作用而應(yīng)用于心腦血管疾病。但有關(guān)紅花黃色素對腎臟病變的研究報道較少，且缺乏相應(yīng)的動物實(shí)驗證據(jù)。研究證明，腎小管上皮細(xì)胞的凋亡、轉(zhuǎn)分化及分泌細(xì)胞外基質(zhì)等均參與了腎間質(zhì)纖維化的過程。本實(shí)驗通過UUO建立大鼠腎間質(zhì)纖維化模型，觀察紅花黃色素注射液對腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響，探討其腎臟保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物及分組 清潔健康雄性SD大鼠45只(購自河北醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中心)體質(zhì)量180~220 g。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為：假手術(shù)組(A組)，UUO組(B組)，UUO聯(lián)合紅花黃色素治療組(C組)各15只。

1.2 動物模型制備 大鼠經(jīng)2%戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定在手術(shù)臺上，腹部皮膚消毒，鋪無菌手術(shù)巾。左側(cè)腹腎區(qū)切口2 cm，切開腹壁各層，進(jìn)入腹腔。在左腹壁辨認(rèn)輸尿管后，分離輸尿管，于腎盞處和腎下級處分別結(jié)扎輸尿管，但并不離斷輸尿管，使左側(cè)完全梗阻后逐層縫合腹壁切口。假手術(shù)組開腹后不結(jié)扎輸尿管，然后縫合腹腔作為對照［1］。

1.3 給藥方法 C組在術(shù)前1 d開始給予紅花黃色素注射液［浙江永寧藥業(yè)股份有限公司，5 mg/(kg?d)］，放于適量生理鹽水中腹腔注射至術(shù)后第９天，A組及B組予等量生理鹽水腹腔注射。實(shí)驗期間大鼠自由進(jìn)食水。

1.4 標(biāo)本收集及制備 術(shù)后第10天斷頭處死大鼠，處死后切取左腎，冠狀位剖開，置于4%多聚甲醛固定12 h，制備石蠟切片。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 腎小管間質(zhì)的病理改變 石蠟切片行HE、MASSON染色，光鏡下觀察腎小管間質(zhì)病變程度，測量皮質(zhì)相對間質(zhì)容積值。

1.5.2 腎小管上皮細(xì)胞凋亡檢測(原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒購自北京中山生物有限公司)。

1.5.3 方法

1.5.3.1 腎組織病理檢查 HE染色：切片常規(guī)脫蠟至水。蘇木精染色1 min，自來水沖洗。1%鹽酸分化，自來水沖洗。伊紅染色2 min。常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。MASSON染色：切片常規(guī)脫蠟至水。切片置于麗春紅染液2 min。切片入2%冰醋酸水溶液2 min。5%磷鉬酸水溶液媒染2 min。2%冰醋酸水溶液2 min。甲基綠染色3 min，自來水沖洗。95%乙醇分色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察其病理改變。

1.5.3.2 腎小管上皮細(xì)胞凋亡檢測 TUNEL實(shí)驗步驟：切片經(jīng)二甲苯、梯度酒精脫蠟入水。滴加蛋白酶Ｋ、3%H₂O₂室溫孵育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加反應(yīng)混合溶液20 μl (TdT 2 μl，熒光素連接的核苷酸混合緩沖液18 μl)在濕盒中37℃孵育60 min。切片滴加1:2稀釋的轉(zhuǎn)化劑POD(HRP連結(jié)的抗熒光素抗體)20 μl，在濕盒中37℃孵育30 min，進(jìn)行免疫反應(yīng)，擴(kuò)大信號。DAB H₂O₂顯色。蘇木精復(fù)染。梯度酒精脫水,二甲苯透明,樹膠封片。

1.5.4 圖象分析、結(jié)果判定

1.5.4.1 腎皮質(zhì)相對間質(zhì)容積及腎皮質(zhì)相對膠原含量 采用真彩色病理圖像分析系統(tǒng)(北航 4.0)，Masson染色切片在高倍鏡(×200)下隨機(jī)選擇10個不含腎小球及血管的腎皮質(zhì)視野，以腎間質(zhì)面積占一個視野場面積的百分比，作為相對間質(zhì)容積值。Masson染色綠色為膠原纖維，測定綠色膠原面積占一個視野面積的百分比，作為腎皮質(zhì)相對膠原含量。

1.5.4.2 腎小管上皮細(xì)胞凋亡檢測 陰性對照片為省去TUNEL反應(yīng)液。光鏡下分析結(jié)果。凋亡細(xì)胞胞核呈棕黃色顆粒沉著，應(yīng)用真彩色病理圖像分析系統(tǒng)計算結(jié)果，每張切片隨機(jī)選取10個不含腎小球和小血管的腎皮質(zhì)視野(×400)，計算每個視野凋亡陽性細(xì)胞總個數(shù)占統(tǒng)計場總面積的百分比(數(shù)密度)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用 SPSS 10.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎小管間質(zhì)的病理改變 肉眼觀察，A組腎臟組織紅潤，無腫大，B、C組梗阻側(cè)腎臟體積明顯增大，顏色變白，腎皮質(zhì)變薄。HE染色可見A組腎臟病理未見改變。B組腎小管擴(kuò)張明顯，間質(zhì)中大量單核與淋巴細(xì)胞浸潤。C組與B組相比腎小管擴(kuò)張、間質(zhì)增寬程度、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤程度有顯著降低(P<0.01)。Masson染色可見A組大鼠腎臟膠原染色主要位于腎小球基底膜、Bowman囊、系膜區(qū)和腎小管間的毛細(xì)血管周圍，而小管周圍間質(zhì)部分比較狹窄，B組膠原沉積明顯增加，C組與B組相比膠原沉積的程度有顯著降低(P<0.01)。

2.2 腎小管上皮細(xì)胞凋亡檢測 A組未檢測到明顯的腎小管凋亡細(xì)胞。B組梗阻側(cè)腎臟可檢測到較多的凋亡細(xì)胞，C組與B組相比腎小管上皮細(xì)胞凋亡顯著降低(P<0.01)。見表2。

3 討論

紅花黃色素是從紅花中提取的有效成分，屬水溶性黃酮中查爾酮類物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)其具有擴(kuò)張冠狀動脈、抗血栓、抗動脈粥樣硬化、降血脂、耐缺氧等藥理作用而應(yīng)用心腦血管病的治療［2，3］。但有關(guān)紅花黃色素對腎臟病變的研究報道較少，且缺乏相應(yīng)的動物實(shí)驗證據(jù)。本實(shí)驗通過UUO建立大鼠腎間質(zhì)纖維化模型，觀察紅花黃色素對腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響，旨在探討紅花黃色素對腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。

UUO是研究進(jìn)行性小管間質(zhì)纖維化成熟的實(shí)驗?zāi)Ｐ?。在本研究中，觀察到梗阻后大鼠的腎臟體積增大，腎皮質(zhì)變薄，腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤，腎小管擴(kuò)張、壞死，腎間質(zhì)面積增寬，膠原成分增加，間質(zhì)纖維化病變突出。提示該模型的建立成功［4，5］。

研究結(jié)果表明，腎臟疾病時腎小管上皮細(xì)胞增殖與凋亡之間的不平衡，可能是導(dǎo)致腎小管萎縮和腎功能惡化的機(jī)制之一，雖然以往從組織形態(tài)學(xué)和腎功能影響方面對輸尿管梗阻引起的腎細(xì)胞凋亡進(jìn)行闡述，但從分子水平上研究甚少。TUNEL法是一種分子生物學(xué)與免疫組織化學(xué)相結(jié)合原位檢測凋亡細(xì)胞DNA片段的方法，因其靈敏可靠而被廣泛用于細(xì)胞凋亡的研究。本實(shí)驗使用TUNEL法觀察到UUO組腎皮質(zhì)小管上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加。與黃凌虹等［6］的報道一致。大量腎小管細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腎小管局部環(huán)境破壞，這可能是觸發(fā)間質(zhì)細(xì)胞過度增殖，并最終形成纖維化的重要因素，因此，阻止腎小管細(xì)胞過度凋亡，保護(hù)腎小管周圍環(huán)境，可起到預(yù)防間質(zhì)纖維化的作用。本實(shí)驗觀察到紅花黃色素治療組與UUO組相比，腎小管細(xì)胞凋亡情況明顯改善，提示紅花黃色素可通過減少腎小管細(xì)胞過度凋亡，保護(hù)腎小管周圍環(huán)境來實(shí)現(xiàn)延緩腎間質(zhì)纖維化的作用。

參考文獻(xiàn)

［1］ 劉克劍，張悅，李靖，等.單側(cè)輸尿管梗阻法制作大鼠腎間質(zhì)纖維化模型的改進(jìn).中國實(shí)驗動物學(xué)報，2007，6(15):410-412.

［2］ 樸永哲，金銘，臧寶霞，等.紅花黃色素緩解心肌缺血作用機(jī)制的研究.中華老年心腦血管病雜志，2002，4(1)：67.

［3］ 金鳴，高子淳，王繼峰.羥基紅花黃色素A抑制PAF誘發(fā)的家兔血小板活化的研究.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2004，27(5)：32-35.

［4］ Klahr S，Morrissey.Obstructive nephropathy and renal fibrosis.Am J Physiol Renal Physiol，2002，283(5):861-875.

［5］ Liu Y.Renal fibrosis:new insights into the pathogenesis and therapeutics.Kidney Int，2006，69(2):213-217.

［6］ 黃凌虹，張國強(qiáng)，葉任高，等.細(xì)胞增殖與凋亡在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化發(fā)病中的意義.中華腎臟病雜志，2000，16(1):24-27.