陳根殷　王旭光　楊　展　陳淑瓊

【摘要】 目的 探討七氟醚預(yù)處理對大鼠心臟缺血再灌注過程中心肌細(xì)胞Bcl-2及Bax 基因表達(dá)的影響。方法 24只SD大鼠隨機(jī)分成3組(n=8)：假手術(shù)對照組(C組)、缺血再灌注對照組(IR組)和七氟醚預(yù)處理組(s組)。IR組與S組接受左冠脈3 h阻斷和3 h再灌注。七氟醚預(yù)處理組在缺血前吸入七氟醚，30 min后洗脫15 min。取心肌缺血區(qū)組織，RT-PCR測Bcl-2及Bax基因的mRNA表達(dá)，免疫印跡法(Western-blot)測蛋白表達(dá)。結(jié)果 與C組相比較，IR組和S組Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)，而S組高于IR組；Bax的mRNA和蛋白表達(dá)IR及S組均高于C組，IR組則高于S組。結(jié)論 七氟醚預(yù)處理抑制心肌細(xì)胞凋亡可能與上調(diào)Bd-2基因的表達(dá)、下調(diào)Bax基因的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】

七氟醚；心??；心肌再灌注損傷；凋亡

Effected of sevoflurane pretreatment on myocardial Bcl-2 and Bax gene expression during ischemia/reperfusion in rats

CHEN Gen-yin,WANG Xu-guang,YANG Zhan，et al.Department of Anesthesiology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang，Guangdong 524001，China

【Abstract】 Objective To investigate the effects ofpretreatment with sevoflurane on myocardial Bcl-2 and Bax gene expression during ischemia-reperfusion in rats.Methods 24 SD rats were randomly divided into 3 groups with 8 animals in each group:sham operation group(group C); ischemia-reperfusion group(group IR)，sevoflurane group(group S).In group IR animals were subjected to 3 h of ischemia by 3 h reperfusion.In group S animals inhales 2%sevoflurane for 30 min followed by 15 min of wash-out before IR.In group C animals underwent no I/R.Myocardium was obtained from marginal zone of ischemic area.The mRNA and protein expression of Bcl-2 and Bax gene were detemined by RT-PCR and western-blot.Results The expression of mRNA and protein expression of Bcl-2 were upregulated in group S and group IR compared with that in group C.The expression of mRNA and protein expression of Bax were down-regulated in group S and group IR.The expression of Bcl-2 gene in group S was higher than tha t in group IR While the expression of Bax gene was lower.Conclusion Sevoflurane pretreatment inhibits myocyte apoptosis inIR myocardiumpartly by modulation of expression of Bcl-2 and Bax genes.

【Key words】Sevoflurane；Myocardial；Myocardial reperfusion injury；Apoptosis

研究已表明吸入性麻醉藥預(yù)處理能模擬缺血預(yù)處理效應(yīng)減輕缺血再灌注所致的心肌損傷［1-3］，但這種心肌損傷保護(hù)機(jī)制至今尚未完全清楚，有研究證明這與減少缺血再灌注過程中心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生有關(guān)［4］，但其抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制至今不甚明確。本研究觀察七氟醚預(yù)處理對大鼠心臟缺血再灌注過程中心肌細(xì)胞Bcl-2及Bax 基因表達(dá)的影響，探討其心肌保護(hù)作用機(jī)制與凋亡調(diào)控基因的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、DMSO、DEPC(Sigma公司)；Trizol(Invitrogen公司)；RT-PCR 一步法試劑盒(寶生物(大連)工程有限公司)；GAPDH、Bcl-2、Bax引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)；100 bp DNA marker、TEMED、6×上樣緩沖液(華美生物工程公司)；ECL試劑、Aprotinin(上海華舜生物工程有限公司)；β-actin大鼠多抗IgG、Bcl-2大鼠單抗IgG、Bax大鼠單抗IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗大鼠IgG(Santa Cruz公司)； PVDF膜 (美國Pall Gelman公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 健康成年SD大鼠(250~300 g) 24只，雌雄不限，隨機(jī)分成假手術(shù)對照組(C組)、缺血再灌注組(IR組)、七氟醚預(yù)處理組(S組)，每組8只。C組不進(jìn)行缺血再灌注處理。IR組阻斷冠脈3 h，隨后再灌注3 h。七氟醚預(yù)處理組用麻醉機(jī)吸入2%七氟醚30 min后，洗脫15 min，然后阻斷冠狀動脈3 h，再灌注3 h。其余步驟同對照組。吸入麻醉藥組在吸入麻醉藥期間停用靜脈麻醉藥，以維持麻醉水平相對穩(wěn)定。以上各組動物實(shí)驗(yàn)完畢后，從心底部剪取各組動物心臟，切下心室，用于總RNA和蛋白提取。

1.3 模型制備 大鼠肌內(nèi)注射氯胺酮70 mg/kg。頸部正中分離氣管并切開插管，動物呼吸機(jī)進(jìn)100%純氧機(jī)械通氣，控制呼氣末CO₂分壓在4~4.5 kPa之間。分離頸外靜脈置管，持續(xù)滴注乳酸林格氏液20 ml/(kg?h)，必要時(shí)加少量碳酸氫鈉以維持血液pH值在7.35~7.45之間。麻醉維持用微量泵泵注咪唑安定0.05~0.1 mg/(kg?h)，氯胺酮2~5 mg/(kg?h)和維庫溴胺0.05~0.1 mg/(kg?h)。分離頸動脈，置管連接換能器測壓。正中劈開胸骨，切開心臟，縫線繞過左冠狀動脈前降支近端深面并膠管將其套住。拉緊套管即阻斷冠狀動脈，表現(xiàn)為心肌局部青紫，心電圖ST段上升。放松套管，局部反應(yīng)性充血，表明心肌再灌注。如果發(fā)生室顫，用食指輕叩右室壁除顫。

1.4 觀察指標(biāo)及測定方法

1.4.1 RT-PCR測心肌Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)

將大鼠心臟剪碎，加液氮研磨，用Trizol試劑提取心肌總RNA，按一步法試劑盒步驟進(jìn)行RT-PCR。Bcl-2引物為：上游5'-GCTACGAGTGGGATACTGGAG-3'，下游5'-GACAGCCAGGAGAAATCAAAC-3'，產(chǎn)物長度為559bp，反應(yīng)條件為：50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min；94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸45 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。 Bax引物為：上游5'-CATCCAGGATCGAGCAGAGAG-3'，下游5'-AGCAAAGTAGAAGAGGGCAACC-3'，產(chǎn)物長度為262 bp，反應(yīng)條件為：50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min；94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，52℃退火50 s，72℃延伸45 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。 退火溫度52℃；內(nèi)參照GAPDH上游引物： 5'-CCTTCATTGACCTCAACTACATGG-3'，下游引物:5'-GCAGTGATGGCATDDAC TGTGGT-3'，擴(kuò)增片段長度442 bp，反應(yīng)條件為：50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min；94℃預(yù)變性2 min；94℃變性40 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，GDS 800凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，同時(shí)進(jìn)行光密度分析。以Bcl-2或Bax PCR產(chǎn)物與內(nèi)參照β-actin PCR產(chǎn)物的光密度之比作為Bcl-2或Bax mRNA的相對含量值。

1.4.2 免疫印跡法測心肌Bcl-2和Bax 蛋白表達(dá) 參考文獻(xiàn)方法提取心肌蛋白［5］。取50 μg蛋白質(zhì)樣品加上樣緩沖液煮沸變性后，進(jìn)行10%SDS PAGE；電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；用含5%脫脂奶粉的TBS(pH 8.0)封閉2 h；分別加入適量Bcl-2大鼠單抗IgG (1:400)或Bax大鼠單抗IgG(1:400)或β-actin山羊IgG多克隆抗體(1:400)，搖床上室溫反應(yīng)2 h；洗膜3次，每次20 min；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:6000)，室溫反應(yīng)2 h；洗膜后作ECL化學(xué)發(fā)光，X片曝光顯影。結(jié)果用GDS 800凝膠圖像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，記錄平均灰度值。計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參照β-actin蛋白表達(dá)量的光密度積分值之比作為目的蛋白表達(dá)量的相對含量值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料表示為(x±s)，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，行單因素方差分析。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)情況

RT-PCR結(jié)果顯示(圖1)及圖像分析結(jié)果顯示(表1)，與C組相比較，IR組和S組Bcl-2 的mRNA表達(dá)均下調(diào)，S組高于IR組；而Bax的mRNA表達(dá)IR及S組均高于C組，IR組高于S組。

2.2 各組大鼠心肌組織Bcl-2和Bax 蛋白表達(dá)情況結(jié)果表明(圖2，表1)，Bcl-2基因的蛋白表達(dá)量IR及S組均較C組下降，S組高于IR組。Bax基因的蛋白表達(dá)量IR及S組均高于C組，IR組高于S組。

3 討論

目前認(rèn)為吸入性麻醉藥的心肌保護(hù)作用機(jī)制有多因素參與，細(xì)胞凋亡機(jī)制是其中一個(gè)重要因素。研究表明，在動物缺血模型中，缺血再灌注引起的心肌損傷都有細(xì)胞凋亡的參與。近年來動物實(shí)驗(yàn)觀察到吸入性麻醉藥對IR心肌細(xì)胞凋亡有抑制作用，與缺血預(yù)處理相似的保護(hù)效應(yīng)［6］。但其抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制至今不甚明確，尤其對細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控有何影響，還需進(jìn)一步研究。

心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)基因主要有C-Myc、p53及Bcl-2家族。其中Bcl-2基因家族是一類結(jié)構(gòu)相似包含兩類功能相反的基因，一類是抑制細(xì)胞凋亡的基因如Bcl-2、Bcl-XL和Al等，另一類是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因如Bax、Bak、Bok、Bcl-Xs等。Bcl-2可通過抑制自由基的產(chǎn)生及細(xì)胞內(nèi)鈣超載，抑制線粒體膜的通透性，阻止細(xì)胞色素C的釋放及抑制線粒體凋亡誘導(dǎo)因子等機(jī)制發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2過表達(dá)時(shí)能完全抑制脂質(zhì)過氧化，從而對IR心肌具有強(qiáng)大的抗細(xì)胞凋亡作用［7］。Bax的作用正與Bcl-2蛋白相反，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［8-9］。Bcl-2和Bax兩者的比例決定細(xì)胞是生存還是凋亡，當(dāng)Bcl-2增多時(shí)形成Bcl-2同源二聚體，細(xì)胞受到保護(hù)；當(dāng)Bax增多時(shí)形成Bax/Bcl-2異源二聚體，細(xì)胞趨向凋亡。I/R心肌細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制目前還未十分明確，目前認(rèn)為，IR所致的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，產(chǎn)生的大量氧自由基及多形核中性粒細(xì)胞的積聚是IR期間心肌細(xì)胞凋亡的誘因，通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，啟動內(nèi)部機(jī)制，影響基因表達(dá)的水平，破壞凋亡誘導(dǎo)基因和凋亡抑制基因之間的動態(tài)平衡，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。許多研究結(jié)果證明了吸入性麻醉藥對心肌缺血再灌注的保護(hù)作用與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡有關(guān)，但其與凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax表達(dá)之間的關(guān)系還不是很清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在七氟醚組Bcl-2表達(dá)明顯強(qiáng)于IR組，而Bax表達(dá)則明顯低于IR組，說明七氟醚預(yù)處理對缺血再灌注心肌能夠上調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)、下調(diào)Bax基因的表達(dá)。結(jié)果表明七氟醚對心肌保護(hù)作用，其中一個(gè)機(jī)制可能是通過調(diào)控凋亡相關(guān)的Bcl-2和Bax的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

七氟醚預(yù)處理可調(diào)節(jié)Bcl-2及Bax基因的表達(dá)，但它對其他凋亡相關(guān)基因是否也有作用，以及相關(guān)的機(jī)制是什么，這還需要更全面、更深入的研究。

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