湯海濤　安春麗

摘 要：慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，為RNA病毒。經(jīng)改造的慢病毒作為外源基因載體，具有其獨特的特點和優(yōu)勢?；蛑委煶晒Φ年P(guān)鍵是選擇合適的載體系統(tǒng)，慢病毒載體作為一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，具有可感染分裂細胞及非分裂細胞、轉(zhuǎn)移基因片段容量較大、目的基因表達時間長、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點，已成為當前基因治療載體研究的熱點。近年來對其基礎(chǔ)生物學(xué)特性、載體改造及其應(yīng)用等研究均取得了較大進展，筆者對慢病毒載體的構(gòu)建以及其在人類疾病基因治療方面的應(yīng)用做簡單的介紹。

關(guān)鍵詞：慢病毒載體；載體構(gòu)建；基因治療

中圖分類號：R373文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2009）02-0142-03

基因治療是向靶細胞或組織中引入外源基因DNA或RNA片段，以糾正或補償基因的缺陷，關(guān)閉或抑制異常表達的基因，從而達到治療的目的。其關(guān)鍵問題之一是如何將目的基因?qū)氚屑毎玫椒€(wěn)定、高效表達。理想的基因載體應(yīng)具備：靶向特異性；高度穩(wěn)定、易制備、可濃縮和純化；無毒性；有利于基因高效轉(zhuǎn)移和長期表達；容量大，易人工合成，缺乏自動復(fù)制載體自身的能力［１］。由于病毒基因組結(jié)構(gòu)簡單、分子背景比較清楚、易于改造和操作、感染效率高、有較高靶細胞特異性，這些都是其他載體系統(tǒng)無法比擬的，而慢病毒載體由于其對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力且轉(zhuǎn)染效率高、靶向性好和持久性表達等特點，病毒載體系統(tǒng)就顯得格外引人注目。

1 慢病毒及其載體的簡介

慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，為RNA病毒。慢病毒除了具有一般逆轉(zhuǎn)錄病毒gag、pol和env3個基本結(jié)構(gòu)基因外，還包含4個輔助基因vif、vpr、nef、vpu和2個調(diào)節(jié)基因tat和rev［２］。慢病毒載體（Lentiviral vector， LV）作為外源基因載體，其產(chǎn)生均包括一個遺傳割裂基因表達的設(shè)計。病毒元件要符合以下條件：①慢病毒組裝輔助蛋白至少含有g(shù)ag-pol基因；②慢病毒轉(zhuǎn)基因載體RNA包括轉(zhuǎn)基因表達盒；③異質(zhì)糖蛋白。目前使用不同種屬來源的慢病毒載體，包括來源于人類（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、貓（FIV）等其它物種［３］。

2 病毒載體的構(gòu)建

由于慢病毒的一些自身因素，我們需對其進行以下的一些改建，使其可以更好地為疾病治療和科研工作服務(wù)。

2.1 最小輔助包裝元件

為了減少病毒序列的數(shù)量從而減少同源重組的風(fēng)險，去除了組裝慢病毒載體結(jié)構(gòu)中不同輔助元件或用其它的特異序列來代替。其中包括原位癌激活基因序列的調(diào)整。另外，去掉附加或調(diào)節(jié)基因與gag-pol基因一樣，已在一些慢病毒載體設(shè)計中得以應(yīng)用［４］。

2.2 去掉附加基因

有幾個HIV-1基因（vif，vpr，vpu，nef）對體外病毒復(fù)制不重要，但對體內(nèi)病毒的致病性非常重要，甚至nef，vif，vpr整合在病毒顆粒內(nèi)從而促進了載體的免疫原性。因此缺乏這些非重要基因時能夠有效生產(chǎn)慢病毒載體是非常重要的［５］。然而，有研究表明在駐留型巨噬細胞和活性Ｂ淋巴母細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)中需要nef，vif，vpr的參與［６］。因此，在去掉附加基因的過程中，要依具體情況決定基因的去留。

2.3 去除調(diào)節(jié)基因

有研究表明反式作用元件tat對全效慢病毒載體基因組RNA中的5-LTR的tat依賴性U3序列已經(jīng)被強效啟動子序列取代。在安全性方面，通過在分散結(jié)構(gòu)中進一步分裂原病毒基因組來表達rev。在設(shè)計雙順反子gag-pol，IRES，rev組裝表達結(jié)構(gòu)時也表達了rev基因結(jié)構(gòu)。載體與rev效應(yīng)元件（RRE）相互作用并影響了非剪接gag-pol mRNAs和轉(zhuǎn)基因載體基因組RNA從核內(nèi)輸出。RRE序列已被異種病毒序列所取代，此種病毒序列能促進非剪接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從核中輸出或促進非剪接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性。用這些異種輸出序列取代RRE/rev引起了HIV-1或SIV載體效價的下降［７］。另外，實驗表明宿主細胞因子參與了RRE包含的RNAs從核中輸出的過程。

2.4 殼體化位點的最低要求

在大多數(shù)慢病毒載體殼體化位點要求在轉(zhuǎn)移載體RNA中存在gag基因區(qū)的最小5'-片段，此片段含有對順式組裝活性有必要的主干環(huán)結(jié)構(gòu)。在大多數(shù)慢病毒載體體系中，包含在N-末端片段落gag ORF，大約有300~400個堿基對，已經(jīng)被移碼突變截斷，因此易感呈現(xiàn)gag肽的轉(zhuǎn)錄/翻譯不會干預(yù)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯［８］。

3 慢病毒載體在疾病治療方面的應(yīng)用

慢病毒載體在基因治療方面已取得了良好的效果，國外已經(jīng)進行了一系列的從基礎(chǔ)到臨床的系統(tǒng)研究工作，包括構(gòu)建有效載體所需的最少的HIV-1基因、SIN載體的構(gòu)建、應(yīng)用HIV-1載體包裝細胞系、非人類慢病毒載體的應(yīng)用等；尤其是在安全性方面，在用H1V-1為載體的體內(nèi)及體外實驗中，迄今尚未發(fā)現(xiàn)誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，表明其安全性是有保證的。

3.1 腫瘤治療

大約30%的乳腺癌中有表皮生長因子受體家族蛋白HER₂的過表達，HER₂表達水平與病人的預(yù)后以及惡性程度密切相關(guān)。在以往鑒定的對HER₂有良好RNAi效應(yīng)的靶序列的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一系列U₆和H雙啟動子小干擾RNA（siRNA）表達載體［９］，并轉(zhuǎn)染HER₂高表達乳腺癌SKBR3細胞定量測定了其HER₂下調(diào)效應(yīng)。程連勝［１０］等做siRNA表達盒經(jīng)LR重組反應(yīng)被克隆入慢病毒載體中并成功包裝成病毒的實驗。由于siRNA是作用于mRNA上并導(dǎo)致其降解的，采用熒光定量PCR對感染siRNA慢病毒后乳腺癌SKBR₃細胞HER₂的mRNA水平進行了相對定量、蛋白印跡雜交和流式細胞儀等一系列實驗證明：慢病毒介導(dǎo)的RNAi確實能有效地下調(diào)腫瘤抗原HER₂的表達，結(jié)果顯示，由于HER₂下調(diào)導(dǎo)致了細胞生長抑制。由此可見，用慢病毒介導(dǎo)的RNAi對乳腺癌的治療將有良好的應(yīng)用前景。

自身分泌活動因子（AMF）是由腫瘤細胞分泌的，并且促進腫瘤細胞的生長。AMP和其受體（AMPR）的表達與許多低成活率和進行性的胃癌、結(jié)腸直腸癌、膀胱癌、食道癌、皮膚惡性黑色素瘤和肺腺癌有著密切的關(guān)系［１１-１７］。最近有研究表明，AMP的突變對乳腺癌的進展和轉(zhuǎn)移有著明顯的促進作用。AMP表現(xiàn)出了與磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的一致的序列，它受小窩蛋白-1（Cav-1）的負向調(diào)節(jié)［１８］。Kojic［１９］等用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)Cav-1基因到乳腺癌細胞中，實驗結(jié)果表明，AMP的表達與Cav-1的表達有著明顯的負相關(guān)性，Cav-1對AMP有強負調(diào)節(jié)作用，對癌細胞的生長有抑制作用。由此可推斷，慢病毒載體介導(dǎo)的Cav-1對與AMP表達相關(guān)的惡性腫瘤應(yīng)該有一定的治療效果。

3.2 血液系統(tǒng)疾病的治療

慢病毒載體不僅能感染造血干細胞（HSCs），使攜帶的目的基因整合至HSCs基因組內(nèi)，且能利用病毒攜帶的調(diào)控元件，使目的基因隨HSCs細胞特異性表達。Michel Sadelain［２０］等用小鼠模擬了人α-地中海貧血的模型，并用慢病毒載體介導(dǎo)治療基因進行治療。實驗載體來源于TNS9 vector，這個載體已表現(xiàn)出良好的轉(zhuǎn)移治療用的人類β-globin基因進入小鼠造血干細胞的能力［２１-２４］。對α-地中海貧血，除了將β-globin基因用α-globin基因替代外，原載體的原件都保留，將載體通過小鼠卵黃囊的血管直接注射進胚胎，但是轉(zhuǎn)移進去的基因在表達過程中出現(xiàn)了衰減現(xiàn)象［２０］，原因還有待于研究。但在對β-地中海貧血的治療中，慢病毒介導(dǎo)的β-globin基因進入小鼠的造血干細胞卻取得了不錯的效果［２５］。雖然慢病毒載體在地中海貧血治療中不盡完美，但可以肯定的是，隨著研究的深入，慢病毒載體在地中海貧血中的應(yīng)用一定會有光明前景。

3.3 半月板的修復(fù)

張經(jīng)緯等［２６］用ViraPower慢病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)載中堿性成纖維細胞生長因子，研究其在新西蘭大白兔的半月板纖維軟骨細胞損傷修復(fù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48h后半月板細胞培養(yǎng)液中堿性成纖維細胞生長因子就有明顯的表達；細胞DNA合成前期、DNA合成期、分裂前期及分裂期的時間較對照組和空白組縮短，并且膠原合成結(jié)果顯示實驗組細胞膠原高于對照組和空白組。表明利用慢病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)能有效地將堿性成纖維細胞生長因子基因轉(zhuǎn)染入半月板纖維軟骨細胞，繼而促進半月板細胞的增殖和基質(zhì)合成，有可能為治療半月板損傷提供新的方法。

總之，盡管慢病毒載體目前還不盡完善，仍然存在很多的問題，但是由于慢病毒載體可轉(zhuǎn)染分裂細胞及非分裂細胞、轉(zhuǎn)移基因片段容量較大、目的基因表達時間長、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)、安全性好等優(yōu)點，對轉(zhuǎn)基因的治療和研究有很大的誘惑力。相信隨著技術(shù)的進步，該類載體將會得到進一步提高，并具有廣闊的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯：姜付平）