戴婷婷 李圣利

·綜述·

組織工程化脈管組織構(gòu)建的研究進展

戴婷婷 李圣利

1 引言

脈管系統(tǒng)包括心血管和淋巴系統(tǒng)兩部分，脈管移植是臨床用來治療脈管系統(tǒng)疾病的手段之一。自體血管和淋巴管是較理想的脈管移植物，但是人體自身可供移植的非必需脈管的來源有限，而異體脈管移植存在免疫排斥等問題，因此尋找新的治療方法和移植材料成為重要的研究課題，脈管組織工程學研究成為熱點。脈管組織工程是利用種子細胞和可降解生物支架材料來構(gòu)建脈管的科學，主要包括：種子細胞、支架材料和生物反應器的應用?，F(xiàn)就脈管組織工程的研究進展綜述如下。

2 種子細胞

2.1 自體脈管壁細胞

脈管內(nèi)皮細胞（Endothelial cells，ECs）和平滑肌細胞（Smooth muscle cells，SMCs）是脈管組織工程主要的種子細胞。自體的血管內(nèi)皮細胞（Blood endothelial cells，BECs）和SMCs無免疫原性，無倫理學爭議，是首選來源。1986年，Weinberg等[1]首次應用體外培養(yǎng)的牛主動脈的ECs、SMCs以及外膜的成纖維細胞構(gòu)建組織工程化血管。國內(nèi)劉陽等[2]運用犬動脈和人臍靜脈的內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞做了相似的實驗研究。目前自體血管壁細胞已經(jīng)廣泛應用于組織工程化血管的構(gòu)建，但是其增殖能力有限，而且在體外培養(yǎng)過程中易出現(xiàn)老化。異體的BECs和SMCs是另一細胞來源，可是免疫排斥的問題仍然無法解決。迄今為止，細胞增殖的難題仍未得到有效解決，所以需尋找可替代血管壁來源的另一種子細胞來源。同BECs一樣，自體淋巴管來源的淋巴管內(nèi)皮細胞（Lymphatic endothelial cells，LECs）同樣也是淋巴管組織工程種子細胞的最佳選擇。1984年，Johnston等[3]首次利用牛的腸系膜淋巴管成功地分離培養(yǎng)出了LECs。Kriehuber等[4]通過機械擠壓真皮的方法來獲得內(nèi)皮細胞，但是收獲的細胞較少。Hirakawa等[5]通過CD34陰性分選與CD31陽性分選的方法來獲得LECs，雖然在一定程度上提高了細胞的獲取量，但是仍然無法達到組織工程對于種子細胞的需要量。近年來，蔣朝華等[6]采用中性蛋白酶和膠原酶消化結(jié)合免疫磁珠分選，能夠從幼兒包皮組織中獲取LECs，同時還證實了凍存的內(nèi)皮細胞復蘇后無明顯形態(tài)學改變，并保持了較高的活力及體外增殖能力，使淋巴管組織工程種子細胞的來源問題有望得到解決。

自體脈管壁細胞作為種子細胞雖然已經(jīng)成功應用于組織工程，但是細胞的來源及擴增后的數(shù)量仍然很有限，所以需要尋找新的種子細胞來源。

2.2 干細胞

干細胞是一類具有多向分化潛能的未分化的原始細胞，在體外大量增殖不易老化，成為近年來組織工程研究關(guān)注的熱點。根據(jù)其發(fā)育階段不同，可分為胚胎干細胞和成體干細胞兩大類。

2.2.1 胚胎干細胞

胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ES）是一類源于早期胚胎或原始生殖細胞等組織的多能干細胞，具有持續(xù)增殖而保持不分化的能力，經(jīng)誘導后可分化為成熟個體中幾乎所有類型的細胞。沈干等[7]用兔動脈來源的SMCs和ES來源的內(nèi)皮細胞構(gòu)建出完整的血管組織。Levenberg等[8]證實人類胚胎干細胞可以分化為BECs，同時在基質(zhì)膠原上形成管樣結(jié)構(gòu)，移植入重度聯(lián)合免疫缺陷（SCID）鼠的體內(nèi)后可以形成微血管。以上結(jié)果均證實了ES細胞可作為組織工程化血管的種子細胞使用。此外，Sabin[9]通過對豬胚胎發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)，淋巴管系統(tǒng)在發(fā)育過程中與血管系統(tǒng)相互連通，因此ES細胞同樣也有可能成為組織工程化淋巴管的種子細胞。但是，目前相關(guān)的倫理問題限制了其應用。

2.2.2 成體干細胞

成體干細胞（Adult stem cells，ASCs）通常是指分布在成年動物和人體組織中具有構(gòu)建和補充某種組織細胞功能的干細胞。

內(nèi)皮祖細胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）是成體干細胞的一種，為內(nèi)皮細胞的前體細胞，具有增殖、遷移和分化為成熟的內(nèi)皮細胞的能力。已有研究表明，EPCs能夠分化為成熟的BECs，并且擴增20代以上仍維持其分化潛能[10]。Kaushal等[11]將EPCs作為種子細胞種植到豬髂動脈的脫細胞血管支架上，修復羊的頸動脈缺損，130 d后血管仍保持通暢。以上結(jié)果表明，EPCs與BECs功能相似，可以成為血管組織工程的種子細胞來源。而Salyen等[12]也發(fā)現(xiàn)，胚肝中存在CD34+/CD133+/VEGFR-3+的EPCs，這些細胞經(jīng)體外誘導，可以分化為表達LECs特異性標志物的細胞，提示了EPCs作為淋巴管組織工程的種子細胞來源的可能性。

骨髓基質(zhì)干細胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓中一種定向干細胞，也屬于ASCs的一種，在體外具有分化為血管平滑肌的能力。Cho等[13]利用犬骨髓來源的BECs和SMCs成功構(gòu)建了小口徑的組織工程化血管，移植入犬頸動脈，保持通暢達8周。此外，Hibino、Shin′oka和Mastumura等[14-17]已經(jīng)成功地在犬模型和病人體內(nèi)用BMSCs修復了血管缺損。以上研究證實BMSCs能夠成為脈管組織工程的種子細胞來源之一。

近年研究發(fā)現(xiàn)，脂肪基質(zhì)中存在具有多向分化潛能的干細胞，即脂肪干細胞（Adipose derived stem cells，ADSCs），其來源廣泛，是新的種子細胞來源。Zuk等[18]從脂肪組織中分離出ADSCs，并發(fā)現(xiàn)其能夠分化為肌細胞；Martinez-Estrada等[19]在體外三維培養(yǎng)條件下從脂肪組織中分離出Flk+的血管內(nèi)皮前體細胞群，此群細胞能夠分化為成熟的BECs。因此，ADSCs有望成為脈管組織工程新的種子細胞來源。

總之，干細胞作為新的種子細胞的引入，為組織工程種子細胞來源問題的解決帶來了新的希望。

3 支架材料

脈管組織工程支架材料主要是為種子細胞提供生長空間和必要的力學支撐。各種不同的材料已經(jīng)用于血管組織工程，包括天然生物材料和人工合成生物材料。雖然淋巴管組織工程支架材料的相關(guān)文獻未見報道，但是以發(fā)育生物學而言，淋巴管的形成在血管形成之后，淋巴管系統(tǒng)和血管系統(tǒng)相互依賴，它們在結(jié)構(gòu)和功能方面存在相似性和相近性，在支架材料領(lǐng)域很大程度上可以互相借鑒，因此用來構(gòu)建血管的生物材料同樣可以嘗試成為構(gòu)建淋巴管的支架。

3.1 天然生物材料

天然生物材料主要包括來源于天然生物體的大分子無結(jié)構(gòu)材料（如膠原、彈性蛋白等），以及脫細胞及部分基質(zhì)成分的結(jié)構(gòu)性材料（如脫細胞血管基質(zhì)等）。膠原和彈性蛋白是血管壁的主要成分，含有細胞黏附域序列，具有良好的細胞相容性。早在1986年Weinberg等[1]就用膠原凝膠首次成功構(gòu)建了組織工程血管?？墒?，由于膠原等天然生物材料力學強度較差，構(gòu)建的血管遠不能達到正常血管的生物力學性能。而脫細胞基質(zhì)類生物材料完全由天然的細胞外基質(zhì)構(gòu)成，可以用來維持血管的力學特性，同種異體脫細胞血管已經(jīng)用來成功修復了犬股動脈和頸總動脈[20]。

3.2 人工合成生物材料

與天然生物材料相比，人工合成的材料可以調(diào)控其分子量、親水性和降解速率。人工合成的材料主要分為不可降解和可降解材料兩種，血管組織工程目前應用的多為可降解人工合成材料（如PGA、PLA等）。Niklason等[21]應用PGA支架成功構(gòu)建了組織工程化血管，但是由于其降解速度太快，導致構(gòu)建的血管移植物的生物力學性能下降。因此，可以在制作PGA支架時加入降解速度相對較慢的人工合成的聚合物，以此來提高移植物的生物力學強度。此外，通過理化方法對人工合成材料的表面進行修飾改性，可以提高支架的生物相容性。Gao等[22]應用NaOH將PGA纖維表面處理后，血管SMCs的黏附提高到未處理前的2倍。近年來，隨著電紡絲、納米材料等新技術(shù)的出現(xiàn)，人工合成材料的性能得到較大改進，從而使得材料結(jié)構(gòu)更加符合構(gòu)建的需要。

4 生物反應器的應用

天然的脈管在機體內(nèi)一直處于流體動力學環(huán)境中，即管壁始終承受著液體層流產(chǎn)生的切應力，其對管壁細胞的形態(tài)、增殖以及細胞外基質(zhì)的合成與分布都有重要影響。為了提高構(gòu)建的脈管的生物力學性能，需要模擬脈管的生理環(huán)境和力學環(huán)境。Niklason等[21]首先利用生物反應器模擬體內(nèi)血流動力學環(huán)境，構(gòu)建了具有一定生物力學性能的組織工程化血管。Williams等[23]也在生物反應器灌注條件下構(gòu)建組織工程化血管，并且證實了隨著培養(yǎng)時間的延長，可以提高該血管的生物力學性能。而淋巴管和血管在體內(nèi)的生理環(huán)境基本相同，承受的切應力只是程度上有所差異，因此淋巴管的構(gòu)建環(huán)境完全可以借鑒血管組織工程構(gòu)建環(huán)境方面的相關(guān)研究成果。然而，目前生物反應器的力學參數(shù)無法模仿胚胎發(fā)育脈管系統(tǒng)形成的變化規(guī)律，影響了遠期通暢率，因此，尋找生物反應器的最佳參數(shù)值是目前研究的熱點和難點問題。

5 存在問題與展望

近年來，血管組織工程發(fā)展迅速，取得了很大的進步，但也仍然存在很多問題和挑戰(zhàn)。種子細胞來源問題一直是血管組織工程亟待解決的難點，雖然BECs和SMCs的分離培養(yǎng)技術(shù)已漸趨成熟，但是細胞體外擴增易老化問題仍需克服。干細胞的運用，解決了種子細胞來源少的問題，可是其定向分化及培養(yǎng)的機制尚未完全明確，限制了其應用。

隨著材料學技術(shù)的日益精進，支架材料的特性逐漸接近正常的血管壁組織，但是其應用于人體是否存在風險性仍需要長期研究予以佐證，同時血管移植物遠期通暢率及抗血栓形成能力也需要給予長期的關(guān)注。生物反應器的引入不僅增強了血管壁的機械強度，同時遠期通暢率和抗血栓形成能力也有了較大的提高。

應用組織工程技術(shù)構(gòu)建淋巴管相關(guān)文獻尚未見報道。近年來，隨著對LEC特有分子標志和分子特性的逐漸明晰，其分離純化和鑒定技術(shù)也得到了很大的發(fā)展[24-28]。同時，隨著構(gòu)建淋巴管必需的種子細胞來源問題逐步得到解決，以及血管組織工程支架材料和構(gòu)建環(huán)境領(lǐng)域獲得的成功也為淋巴管組織工程提供了重要的參考，使得淋巴管構(gòu)建成為可能。淋巴管和血管諸多相似性的存在，使得兩個領(lǐng)域可以相互借鑒。由于淋巴管相對于血管解剖結(jié)構(gòu)的特殊性，利用組織工程技術(shù)構(gòu)建淋巴管更具有挑戰(zhàn)性。如何在保持LECs具有足夠活性的前提下獲得相當數(shù)量的種子細胞，以及LECs和支架材料的相容性問題和結(jié)合的最適條件等諸多問題仍然亟待研究和解決。

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Q813.1+2

B

1673－0364（2009）－02－0108－03

2008年12月11日；

2009年1月19日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.04.016

上海市教育委員會科研重點項目（07ZZ41）。

200011上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科。