李 喆 王華平 陳仕艷

一種潛在的組織工程支架材料
——細菌纖維素

李 喆 王華平 陳仕艷

纖維素是豐富的天然聚合物，主要分布于植物以及真菌、藻類中。其中，細菌纖維素（Bacterial cellulose,BC）以其獨特的超細纖維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)、卓越的機械性能、良好的生物相容性和生物可降解性在生物醫(yī)用領域引起了人們的廣泛關(guān)注。

自1987年以來，關(guān)于用BC膜治療燒傷、燙傷、褥瘡、皮膚移植、創(chuàng)傷和慢性皮膚潰瘍等成功病例已屢見不鮮，并且已經(jīng)有用于人工皮膚、紗布、繃帶等的敷料產(chǎn)品[1]，如由Fontana等[2]研發(fā)的BC產(chǎn)品BiofillR，已經(jīng)被證明在二級和三級燒傷、燙傷、皮膚移植、慢性皮膚潰瘍等皮膚損傷方面有非常顯著的療效。另外，Xylos公司推出的由Alvarez等[3]研制的XCellsR纖維素創(chuàng)傷敷料和XCellsR抗菌創(chuàng)傷敷料也已在臨床上得到了廣泛的應用。同時，BC已經(jīng)被證明可以應用在人工血管、藥物載體以及引導組織再生等方面[4-6]。

隨著醫(yī)學的發(fā)展，人們對BC作為一種優(yōu)秀的生物材料在組織工程方面的應用進行了大量研究，本文將就BC在組織工程方面的研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 細菌纖維素的特性

細菌纖維素由Acetobacter、Agrobacterium、Pseudomonas、R hizobium和Sarcina等菌株生產(chǎn)，其中研究最多、產(chǎn)量最高的是木醋桿菌（Acetobacter xylinum）[1]。從化學組成來看，BC與植物纖維素相似，都是由吡喃型葡萄糖單體（β-D-葡萄糖）通過β-1,4-糖苷鍵連接而形成的一種無分支、大分子直鏈聚合物，直鏈之間彼此平行，不呈螺旋構(gòu)象，無分支結(jié)構(gòu)[7]。在此合成過程中，培養(yǎng)液的液面形成三維的凝膠狀BC。這種獨特的超微纖維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，使其具有優(yōu)越的機械特性。

BC的微纖絲束直徑為3～4 nm，而由微纖維束連接成的纖維絲帶寬度為70～80 nm，長度為1～9 μm，是目前最細的天然纖維[8]。BC因為不含有植物纖維中的木質(zhì)素、半纖維、果膠和阿拉伯聚糖等，因此具有很高的纖維純度，纖維素含量在99%以上。由于纖維絲束間大量的氫鍵存在，使其具有較高的抗張強度和彈性模量。經(jīng)處理后，楊氏模量可達（78±17）GPa[9]。BC分子內(nèi)存在大量的親水性基團，有很多“孔道”，因此具有良好的透氣、透水性能，能吸收比自身干重大60～700倍的水分。BC具有極佳的形狀維持能力和抗撕裂性，較高的生物適應性和良好的生物可降解性，可最終降解成單糖等小分子[10]。

不同的培養(yǎng)條件下得到的BC，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有很大差異，即BC在生物合成時具有良好的性能和形狀的可控性。如將殼聚糖添加于Acetobacter xylinum的培養(yǎng)基中對合成的BC進行改性，可使得這種改性的纖維素不僅具有纖維素本身的特性還具有殼聚糖的特性，在處理燒傷、褥瘡以及組織工程應用等方面具有良好的應用價值[11]。近期，Honglin等[12]報道了將膠原加入培養(yǎng)基中得到了一種新的潛在的組織工程支架材料，膠原-細菌纖維素（COL/BC）復合材料，研究表明這種材料結(jié)構(gòu)和性能優(yōu)于單純的BC材料。

BC在合成過成中可以任意塑形，并且不會導致其物理性能的變化。通過模板或特定的培養(yǎng)裝置可以控制BC材料的形狀。R oberts等首先申請了關(guān)于BC成形培養(yǎng)的專利，他們將Acetobacter放入一個特制的具有氧滲透性能的聚合物（如：聚氯乙烯）模具中，作為發(fā)酵裝置模具的一側(cè)與氧氣接觸，另一側(cè)與培養(yǎng)液接觸。通過這一靜態(tài)培養(yǎng)裝置，可以合成各種三維形狀的BC材料。White等[13]利用Acetobacter在培養(yǎng)過程中直接形成一種無縫手套形狀的BC產(chǎn)品，用來治療燒傷的手部皮膚。Yasumitsu等[14]使用瓊脂作為模板，通過控制細菌的運動，制備出了具有蜂窩狀結(jié)構(gòu)的BC膜。最近Backdahl等[15]分別使用淀粉、石蠟作為致孔劑，制備出具有一定孔徑的三維組織工程血管支架材料，材料孔徑、厚度、連通性均可通過改變致孔劑的尺寸和發(fā)酵條件來控制。BC良好的塑形性使得其作為組織工程支架時，可以更好地控制孔徑與孔隙率以滿足不同組織構(gòu)建時的需要。

生物相容性是作為組織工程支架材料必備的要素之一。許多研究人員做了BC動物模型的體內(nèi)相容性研究。例如，Kolodziejczyk等在兔子皮下植入BC膜（直徑1 cm），3周后觀察，無肉眼可見的炎癥反應，組織學觀察顯示只有少量的巨細胞和成纖維細胞出現(xiàn)在材料組織界面上。Klemm等[16]的研究同樣證實了BC良好的體內(nèi)相容性，他們將一段中空的BC管植入鼠頸動脈，無排異反應。Helenius等[17]在Wistar大鼠皮下植入BC，使用免疫組化和電子顯微鏡技術(shù)，經(jīng)過1～12周觀察，從慢性炎癥反應、異物排斥反應，以及細胞向內(nèi)生長和血管生成等方面的特征，系統(tǒng)評估了植入BC的體內(nèi)相容性。結(jié)果表明，BC周圍無肉眼和顯微鏡可見的炎癥反應，沒有纖維化被膜和巨細胞生成，而且與宿主組織融為一體，未引起任何慢性炎癥反應，同時還觀察到，許多成纖維細胞可以透過BC材料的多孔結(jié)構(gòu)進入材料內(nèi)部，并且有成纖維細胞增殖和膠原合成，因此可以斷定BC的生物相容性良好，在組織工程化組織構(gòu)建方面具有潛在的價值。馬霞等[18]報道了以BC作為創(chuàng)傷輔料的研究，也發(fā)現(xiàn)BC膜表面孔徑具備作為人工皮膚支架的物理條件，適于成纖維細胞和毛細血管的長入。BC為新生的毛細血管和成纖維細胞提供了合適的三維支架，利于其長入和定位，并可誘導成纖維細胞生長，利于肉芽組織的生成。

2 在組織工程中的研究進展

2.1 軟骨組織工程

在軟骨組織工程研究中，為了支持細胞增殖，確定新生組織的特定形狀，并且維持細胞分化功能，必須使用三維的支架材料。許多天然材料與合成聚合物已經(jīng)被廣泛研究，但這些材料的機械性能不甚理想。BC以其獨特的性能、在濕態(tài)時優(yōu)異的力學性能、原位可塑性開始受到關(guān)注。Svensson等[18]利用牛軟骨細胞對天然BC材料和經(jīng)化學修飾的BC材料進行了評價，結(jié)果表明，未經(jīng)修飾的天然BC材料在保持良好的機械性能的前提下，Ⅱ型膠原基質(zhì)可達到正常軟骨表達的50%左右，并且支持軟骨細胞的增殖。與細胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)皿材料和藻酸鈣相比，天然BC中培養(yǎng)的軟骨細胞表現(xiàn)出明顯的高水平生長，說明BC材料能更好地支持軟骨細胞生長、增殖。通過體外巨噬細胞屏蔽實驗發(fā)現(xiàn)，BC未導致顯著性的致炎細胞因子活化。透射電鏡分析及人軟骨細胞Ⅱ型膠原RNA表達分析表明，天然BC支持軟骨細胞的分化、增殖。此外，軟骨細胞向支架材料內(nèi)部的長入也已通過透射電鏡得到證實。因此，BC材料具有作為軟骨組織工程支架材料的可能。Bodin等[20]用硅樹脂作為模具，制備出半月板形狀的BC材料，并以豬的半月板、已用于臨床半月板修復的膠原質(zhì)材料作為對照，評價了3種材料的力學性能。結(jié)果表明，BC材料的力學性能優(yōu)于膠原質(zhì)材料，其楊氏模量約是膠原質(zhì)材料的100倍，壓縮模量與豬的半月板相似。綜合BC材料的優(yōu)異力學性能，良好的塑形性能，并且維持軟骨分化、支持軟骨細胞的遷移增殖，BC材料在軟骨組織工程構(gòu)建方面有著極大的潛力。

2.2 血管組織工程

小口徑的組織工程血管的移植為微脈管手術(shù)等治療血管疾病提供了有效的途徑。早在2001年，Klemm等[16]就報道了一種利用Acetobacter xylinum原位成形制備的BC應用于顯微外科手術(shù)的人工血管。這種稱為BASYC（BActerial SYnthesized Cellulose）的人造血管具有極強的親水性，光滑的內(nèi)表面，在濕態(tài)下足夠的機械強度，以及良好的生物活性等特性，在顯微外科中作為人工血管有著巨大的應用前景。Backdahl等[21]評價了BC作為潛在的組織工程血管支架的可行性。研究顯示平滑肌細胞可以在BC膜上黏附、增殖，并向內(nèi)部生長。TEM顯示平滑肌細胞在體外培養(yǎng)2周后可向內(nèi)生長約40 μm。同時，他們利用SEM觀察了靜態(tài)培養(yǎng)的BC膜生長形態(tài)學，并比較了BC、豬動脈和膨體聚四氟乙烯支架在機械性能上的差異，發(fā)現(xiàn)BC與動脈相似。眾所周知，BC膜在靜態(tài)原位培養(yǎng)時，有兩個不同結(jié)構(gòu)的表面。作為下表面的氣/液接觸面結(jié)構(gòu)較為密集、表面相對平滑，而上表面為結(jié)構(gòu)較呈疏松的多孔形態(tài)。根據(jù)這一獨特結(jié)構(gòu)，Backdahl提出在BC作為血管支架時，可以在氣/液面上接種內(nèi)皮細胞，因為研究表明，內(nèi)皮細胞在光滑面的黏附性更好。Bodin等[22]研究了Acetobacter xylinum原位靜態(tài)培養(yǎng)時不同濃度的氧含量對BC管機械性能的影響，證明BC管可承受大于25 mmHg（1 mmHg=0.133 KPa）的血壓，在最佳的培養(yǎng)條件下，爆破壓力可達到880 mmHg。同時在BC管內(nèi)腔種植人內(nèi)皮細胞，7 d后細胞融合成片，說明了BC材料可以提供內(nèi)皮細胞良好的黏附增殖。這種以細胞纖維素作為組織工程血管支架的相關(guān)大動物模型正在研究中。近期Backdahl等[15]報道了分別以淀粉和石蠟微球為致孔劑制備出用于血管組織工程的BC支架材料，通過改變致孔劑的粒徑可以控制支架材料的孔徑。在BC支架材料上種植人平滑肌細胞，與靜態(tài)培養(yǎng)的BC膜相比，孔徑三維結(jié)構(gòu)的支架材料內(nèi)部有更多的細胞遷入。

2.3 骨組織工程

骨組織是由無機材料和有機材料結(jié)合在一起形成的復合體，其中無機材料的大部分是磷灰石，有機物質(zhì)大部分為纖維性膠原蛋白。羥基磷灰石[HAp，Ca10(PO4)6(OH)2]作為一種化學組成和晶體結(jié)構(gòu)類似于骨組織磷灰石的生物材料，具有良好的生物活性、生物相容性和骨傳導性，被廣泛用于骨組織工程的研究[23]，但其存在顆粒較大、結(jié)晶度較大、生物力學強度較低等缺陷。有許多研究嘗試將HAp與天然材料（如：膠原、殼聚糖、甲殼素、明膠、蠶絲蛋白等［24－28］）復合以滿足臨床應用的需要，但這些復合材料的生物力學性能并不令人滿意。BC結(jié)構(gòu)與骨膠原纖維的形態(tài)形似，并且具有卓越的力學強度，使其應用于骨組織工程研究成為可能。Wan等[29]對HAp和BC復合進行了研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過磷酸鹽和氯化鈣處理后的BC材料在模擬體液中可以形成HAp的結(jié)晶。進一步的研究顯示，磷酸化的BC可以促進HAp形成，并且形成的HAp晶體是被碳酸鹽包裹的納米級、低結(jié)晶度晶體[30]。這種三維HAp-BC納米復合結(jié)構(gòu)類似于骨骼中的生物磷灰石，在骨組織工程支架應用方面具有良好的發(fā)展前景。Hutchens等[31]以BC為生物陶瓷的沉積基質(zhì)，合成了一種相似的低鈣羥基磷灰石（Calcium-deficient hydroxyapatite，CdHAP）復合材料。在生理pH值和溫度下，通過先在氯化鈣溶液中連續(xù)培養(yǎng)，然后再在磷酸鈉中孵育，最終在BC上形成了磷酸鈣微粒。XRD表征結(jié)果顯示，10～50 nm的晶體顆粒在BC中形成，并且形成的晶體顆粒為各向異性軸向拉伸片晶，這種低鈣磷灰石與骨的主要組分相似。SEM證實了在纖維素中形成的是由片層狀的納米晶體組成的均一的低鈣羥基磷灰石微球，微球直徑約為1 μm。在研究中發(fā)現(xiàn)這種復合材料比天然的BC能更好地支持成骨細胞的生長。Hutchens指出這種模擬天然生物礦化骨的復合材料使有望成為整形外科的一種優(yōu)良生物材料，可以作為骨再生治療的植入物，并且有望成為骨組織工程支架材料而應用于骨組織的構(gòu)建。

2.4 組織工程其他方面的應用

Sanchavanakit等[32]研究了人的角化細胞和成纖維細胞在BC上的體外培養(yǎng)狀況，結(jié)果表明，BC對人的角化細胞和成纖維細胞沒有毒性，并且支持兩種細胞的增殖。對人的角化細胞，BC材料與培養(yǎng)皿材料相比，可以更好地支持細胞的黏附、增殖及遷移，并且可以很好地維持角質(zhì)細胞的表達。對成纖維細胞，雖然支持細胞的增殖及遷移，但BC材料使得成纖維細胞的黏附性較差。因此，BC材料作為組織工程皮膚支架材料，需要進行修飾及改性以滿足皮膚組織構(gòu)建的需要。

3 結(jié)束語

BC作為一種優(yōu)良的生物材料，由于其良好的體內(nèi)、外生物相容性和獨特的機械性能，使其可作為一種潛在的組織工程支架材料應用于多種組織構(gòu)建中。與其他生物材料相比，BC材料用于組織工程學的研究還處于初始階段，大動物模型體內(nèi)的生物相容性研究還未見報道，體外的材料-細胞復合物的長期觀察、材料降解速率與構(gòu)建組織的匹配等都需要進一步的深入研究。

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TQ352.7

B

1673－0364（2009）－02－0111－03

2009年1月8日；

2009年2月23日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.04.017

教育部新世紀人才計劃(NCET-05-0420)，高等學校學科創(chuàng)新引智基地(111-2-04,B07024),上海市重點學科建設項目資助(B603)。

201620上海市東華大學纖維材料改性國家重點實驗室，東華大學材料科學與工程學院。