〔摘要〕 目的 探討參附注射液治療心力衰竭（以下簡稱“心衰”）的作用機(jī)制。方法 30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組（n=7）和造模組（n=23）。造模組大鼠采用異丙腎上腺素皮下注射法（5 mg·kg-1·d-1，連續(xù)1周）制備心衰大鼠模型，空白組大鼠經(jīng)皮下注射等量生理鹽水。造模完成后，將成模大鼠隨機(jī)分為模型組（n=8）和參附組（n=8）。參附組大鼠腹腔注射參附注射液（6 mL·kg-1·d-1，連續(xù)1周），空白組和模型組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。藥物干預(yù)結(jié)束后，于麻醉狀態(tài)下行心臟超聲心動圖檢測;經(jīng)腹主動脈取血，收集血液樣本檢測炎癥指標(biāo);于結(jié)腸段收集糞便樣本和結(jié)腸組織進(jìn)行16S rRNA測序和HE染色;摘取大鼠心臟行HE染色。運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選參附注射液活性成分、靶點(diǎn)及心衰和差異菌群相關(guān)靶點(diǎn)，并對相同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠射血分?jǐn)?shù)（EF）、縮短分?jǐn)?shù)（FS）下降（Plt;0.001），N末端B型利鈉肽原（NT-proBNP）升高（Plt;0.001），脂多糖（LPS）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β升高（Plt;0.001）。與模型組比較，參附組大鼠EF、FS升高（Plt;0.001），NT-proBNP下降（Plt;0.001），LPS、IL-6、IL-1β下降（Plt;0.01，Plt;0.001）。參附組與空白組的腸道菌群相似度高于模型組與空白組。群落組成和線性判別分析效應(yīng)量（LEfSe）結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠多級物種豐度發(fā)生改變，上述改變在參附組中呈現(xiàn)回調(diào)趨勢。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“參附注射液-腸道菌群-心衰”的共同靶點(diǎn)為IL-10、IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子，并且GO功能、KEGG富集分析結(jié)果也與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。結(jié)論 參附注射液可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善心功能。

〔關(guān)鍵詞〕 參附注射液;心力衰竭;16S rRNA;腸道菌群;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);異丙腎上腺素

〔中圖分類號〕R285.5"""""""" 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A""""""""" 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.02.007

〔收稿日期〕2024-07-31

〔基金項目〕國家自然科學(xué)基金項目（82274412，82305092）;湖南省自然科學(xué)基金項目（2023JJ30453）;湖南省青年科技創(chuàng)新人才項目（2024RC3199）;湖南省中醫(yī)藥科研項目（B2023045）。

〔通信作者〕*胡志希，男，博士，二級教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：003405@hnucm.edu.cn;李" 琳，女，博士，副教授，E-mail：471920830@qq.com。

Mechanism of action of Shenfu Injection in treating heart failure based on 16S rRNA sequencing and network pharmacology approaches

ZHAO Zhenyu1， LI Lin2*， HU Zhixi2*

1. Hunan Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine Diagnostics， Hunan University of Chinese Medicine，

Changsha， Hunan 410208， China; 2. Institute of Chinese Medicne Diagnosis， Hunan University of Chinese

Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Abstract〕 Objective To investigate the mechanism of action of Shenfu Injection in treating heart failure （HF）. Methods Thirty male SD rats were randomly divided into blank group （n=7） and modeling group （n=23）. Rats in the modeling group were administered subcutaneous injections of isoproterenol （5 mg·kg-1·d-1 for one week） to induce HF， while rats in the blank group received an equal volume of normal saline subcutaneously. After model induction， successfully modeled rats were randomly divided into model group （n=8） and" Shenfu group （n=8）. Rats in the Shenfu group were treated with Shenfu Injection （6 mL·kg-1·d-1 for one week） via intraperitoneal injection， while rats in the normal and model groups received intraperitoneal injections of an equal volume of normal saline. After drug intervention， echocardiography was performed under anesthesia， blood samples were collected from the abdominal aorta for the detection of inflammatory markers， fecal samples and colon tissues were collected for 16S rRNA sequencing and HE staining， and rats' hearts were excised for HE staining. Network pharmacology methods were used to screen the active components and targets of Shenfu Injection， as well as targets related to HF and differential microbiota， followed by GO function and KEGG pathway enrichment analysis for common targets. Results Compared with the blank group， the rats in the model group showed decreased ejection fraction （EF） and fractional shortening （FS） （Plt;0.001）， and increased N-terminal pro-B-type natriuretic peptide （NT-proBNP） （Plt;0.001）， lipopolysaccharide （LPS）， interleukin-6 （IL-6）， and interleukin-1β （IL-1β） levels （Plt;0.001）. Compared with the model group， rats in the Shenfu group exhibited increased EF and FS （Plt;0.001） and decreased NT-proBNP （Plt;0.001）， LPS， IL-6， and IL-1β levels （Plt;0.01， Plt;0.001）. The intestinal microbiota composition in the Shenfu group was more similar to that of the normal group than to the model group. Community composition and linear discriminant analysis effect size （LEfSe） results indicated that compared with the blank group， the model group rats had altered multi-level species abundance， and these changes showed a trend of recovery in the Shenfu group. Network pharmacology results revealed that the common targets of \"Shenfu Injection-intestinal microbiota-HF\" were interleukin-10 （IL-10）， IL-1β， IL-6， and tumor necrosis factor， and the GO function and KEGG enrichment analyses results were also closely related to the inflammatory response. Conclusion Shenfu Injection may improve cardiac function by regulating the intestinal microbiota and inhibiting the body's inflammatory response.

〔Keywords〕 Shenfu Injection; heart failure; 16S rRNA; intestinal microbiota; network pharmacology; isoprenaline

本文引用： 趙震宇， 李" 琳， 胡志希. 基于16S rRNA測序和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討參附注射液治療心力衰竭的作用機(jī)制[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2025， 45（2）： 239-249.

心力衰竭（以下簡稱“心衰”）是由心臟結(jié)構(gòu)或功能異常引起的，以肺循環(huán)和（或）體循環(huán)淤血為主的一組臨床綜合征[1]。在過去的半個世紀(jì)里，心血管疾病的預(yù)防、診斷和治療取得了重大進(jìn)展，發(fā)達(dá)國家心血管疾病死亡率顯著降低，但心衰除外[2]。包括利尿劑、β受體拮抗劑、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)抑制劑等在內(nèi)的許多藥物被廣泛用于心衰的臨床治療。然而，目前的治療方法主要針對一小部分假定的病理生理途徑。心衰總體預(yù)后不佳，是患者住院和死亡的最常見原因之一[3-4]。中醫(yī)藥因其毒副作用小且作用靶點(diǎn)、途徑廣泛的特點(diǎn)日益受到重視。許多中藥注射制劑被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療[5]，其中參附注射液有明確治療心衰的效果[6]。楊柳等[7]研究發(fā)現(xiàn)，參附注射液能通過減輕Toll樣受體信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和心肌纖維化，對心衰大鼠心肌起到保護(hù)作用。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)[8]，參附注射液可通過降低血管加壓素及其2型受體的表達(dá)，改善心衰大鼠水鈉潴留現(xiàn)象。人體各處生活著數(shù)萬億微生物群，其在腸道中的密度最高，稱為腸道菌群[9]。腸道菌群是一個復(fù)雜的共生微生物系統(tǒng)，定植著約100萬億微生物，包括細(xì)菌、真菌、古菌、病毒等，其中細(xì)菌占99%以上，在人類健康和疾病中發(fā)揮著重要作用，如調(diào)節(jié)自身代謝與免疫功能、排出體內(nèi)毒素、提供營養(yǎng)等[9-10]。腸道菌群失調(diào)在心衰的發(fā)展過程中扮演著重要角色，調(diào)節(jié)腸道菌群可能是治療心衰的一個新的靶點(diǎn)[11]。ZHAO等[12]研究證實(shí)，四逆湯可通過改善心衰大鼠腸道黏膜屏障功能和菌群結(jié)構(gòu)，降低致病菌豐度，增加產(chǎn)短鏈脂肪酸（short chain fatty acids， SCFAs）細(xì)菌的豐度，從而改善心功能。GAO等[13]研究發(fā)現(xiàn)，芪參顆粒可顯著增加心衰大鼠腸道菌群中擬桿菌門的豐度，并增加SCFAs的產(chǎn)生，同時降低血清脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）水平，改善腸道結(jié)構(gòu)，恢復(fù)腸道屏障功能，提高心功能。故本文運(yùn)用16S rRNA高通量測序聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究參附注射液治療心衰的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1" 動物

30只雄性SD大鼠[動物合格證號：4307272111

01030871，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004]，體質(zhì)量（220±10） g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。本實(shí)驗(yàn)過程符合相關(guān)倫理要求，已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會審核（審批號：LLBH-202105180001）。實(shí)驗(yàn)前，所有大鼠于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)，溫度20～23 ℃，濕度55%～67%，12 h周期性明暗交替，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.2" 藥物

參附注射液（華潤三九雅安藥業(yè)有限公司，批號：201106AK05，國藥準(zhǔn)字：Z51020664，規(guī)格：10 mL/支）;鹽酸異丙腎上腺素（美國MedChemExpress公司，批號：HY-B0468/CS-2582，規(guī)格：5 g）;烏拉坦[阿拉丁試劑（上海）有限公司，批號：U299635-100，規(guī)格：500 g]。

1.3" 主要試劑與儀器

DNA抽提試劑盒（美國Omega Bio-Tek公司，批號：M9636-02）;瓊脂糖（美國Thermo Scientific公司，批號：75510019）;高保真DNA聚合酶（中國TransGen公司，批號：AS221-02）;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（中國逾華公司，批號：C01-10000）;建庫試劑盒（美國Bioo Scientific公司，批號：NOVA-5144）;測序試劑盒（美國Illumina公司，批號：MS-102-3003）。

電泳儀（中國北京六一儀器廠，型號：DYY-6C）;機(jī)械破碎研磨儀（美國MP公司，型號：FastPrep-24 5G）;測序儀（美國Illumina公司，型號：Illumina Miseq）;粉碎研磨儀（中國上海萬柏生物科技有限公司，型號：TL-48R）;便攜式小動物超聲儀（北京益仁恒業(yè)科技有限公司，型號：6 LAB）;-80 ℃低溫冰箱（美國Thermo公司，型號：TDE30086FV-ULTS）。

1.4" 動物分組與造模

采用Excel表格的Random函數(shù)隨機(jī)生成7個數(shù)字，對應(yīng)7只空白組大鼠，空白組大鼠皮下注射等量生理鹽水。其余23只大鼠皮下注射異丙腎上腺素5 mg·kg-1·d-1（給藥濃度2.5 mL·kg-1），連續(xù)1周，制備心肌缺血誘導(dǎo)的心衰大鼠模型[14]。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，經(jīng)眼眶取血檢測N末端B型利鈉肽原（N-terminal pro-brain natriuretic peptide， NT-proBNP）及超聲心動圖。與空白組大鼠比較，射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction， EF）降低20%以上，判定為造模成功[15]。本研究成功構(gòu)建16只模型大鼠（成模率69.57%）。

1.5" 給藥和取材

16只大鼠按照Excel表格的Random函數(shù)隨機(jī)分為模型組和參附組。參附組大鼠腹腔注射參附注射液（6 mL·kg-1·d-1），模型組大鼠腹腔注射生理鹽水（6 mL·kg-1·d-1），連續(xù)1周。所有大鼠實(shí)驗(yàn)期間常規(guī)飼養(yǎng)。末次給藥后禁食24 h，于烏拉坦麻醉下行超聲心動圖檢測。隨后經(jīng)腹主動脈取血，靜置30 min，于4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min（離心半徑10 cm），收集上層血清凍存于-80 ℃冰箱中。在4%多聚甲醛溶液中保存取出的完整心臟。切除大鼠結(jié)腸段，按照SHAO等[16]的方法收集糞便，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中。將結(jié)腸段用生理鹽水沖洗后保存于4%多聚甲醛溶液中。

1.6" 檢測指標(biāo)及方法

1.6.1" 超聲心動圖檢測" 利用大鼠超聲檢測系統(tǒng)，在大鼠探頭上均勻涂抹耦合劑，通過二維超聲的引導(dǎo)，使用M型超聲線陣探頭對大鼠左心室長軸進(jìn)行切面觀察，并運(yùn)用8點(diǎn)法對EF和縮短分?jǐn)?shù)（fractional shortening， FS）進(jìn)行測算，評價心臟功能。

1.6.2" HE染色" 對固定后的心肌與結(jié)腸組織進(jìn)行清洗以去除多余的固定劑，并脫水處理。組織經(jīng)過透明化處理，浸入石蠟中，制成石蠟包埋塊。使用切片機(jī)將石蠟包埋塊切成薄片，貼附在載玻片上。對載玻片上的組織進(jìn)行去蠟和水分恢復(fù)。使用蘇木精染液對細(xì)胞核進(jìn)行染色，使用伊紅染液對細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行染色。染色完成后，對組織進(jìn)行脫水、透明化處理，并使用封片劑封固，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.6.3" 血清ELISA檢測" 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測各組大鼠血清NT-proBNP、LPS、白細(xì)胞介素（interleukin， IL）-6、IL-1β水平。

1.6.4" 腸道菌群的DNA抽提和測序" 根據(jù)FastDNA[R][○] Spin Kit for Soil說明書對大鼠糞便進(jìn)行微生物群落總DNA抽提與檢測。使用338F_806R引物對16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17]。根據(jù)中國上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議，將純化的擴(kuò)增子匯集在等摩爾濃度中，在Illumina MiSeq PE300平臺上進(jìn)行配對末端測序。使用fastp 0.20.0（https：//github.com/OpenGene/fastp）軟件對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH 1.2.7（http：//www.cbcb.umd.edu/software/flash）軟件進(jìn)行拼接[17]。

1.7" 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.7.1" 中藥活性成分、靶點(diǎn)及心衰靶點(diǎn)、腸道菌群靶點(diǎn)的獲取" 通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）篩選參附注射液所含中藥紅參、附子的活性成分和靶點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為Scoregt;20，Plt;0.05，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化靶點(diǎn)名稱，去除重復(fù)靶點(diǎn)后得到中藥靶點(diǎn);以“Heart Failure”為關(guān)鍵詞檢索OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）、GeneCards數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org）、NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）和DisGeNet數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/），GeneCards篩選標(biāo)準(zhǔn)為Relevance scoregt;20，合并后去重，得到心衰靶點(diǎn);通過gutMGene數(shù)據(jù)庫（http：//bio-computing.hrbmu.edu.cn/gutmgene/#/Home）檢索模型組與參附組間顯著差異細(xì)菌所調(diào)控的基因，得到菌群作用靶點(diǎn)。

1.7.2" “中藥-腸道菌群-心衰”共同靶點(diǎn)的可視化分析" 將中藥、腸道菌群和心衰靶點(diǎn)通過PERL 5.38.0軟件進(jìn)行篩選，并利用Venny平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）進(jìn)行可視化分析。

1.7.3" 核心有效成分和靶點(diǎn)的篩選" 將獲得的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING在線數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb.org/），選擇物種“Homo sapiens”，設(shè)置置信度≥0.4。

1.7.4" GO功能富集分析和KEGG通路富集分析" 運(yùn)用Bioconductor數(shù)據(jù)庫及R 4.2.2（64 bit）軟件對潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG富集分析。

1.8" 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料均以“x±s”表示，多組比較采用單因素方差分析。兩組比較若數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，采用參數(shù)t檢驗(yàn);若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，采用非參數(shù)t檢驗(yàn)。以Plt;0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1" 各組心功能指標(biāo)比較

與空白組比較，模型組EF、FS顯著降低（Plt;0.001），NT-proBNP含量顯著升高（Plt;0.001）。與模型組比較，參附組EF、FS顯著升高（Plt;0.001），NT-proBNP含量顯著降低（Plt;0.001）。詳見表1、圖1。

2.2" 各組心肌與結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察

空白組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常，未見炎性細(xì)胞浸潤、水腫、壞死等病理性改變;模型組大鼠心肌組織可見明顯炎性細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞增多，部分心肌纖維溶解;參附組大鼠心肌組織炎性細(xì)胞減少，可見纖維化現(xiàn)象，未見心肌纖維溶解?？瞻捉M大鼠結(jié)腸組織絨毛上皮連續(xù)、光滑、無脫落，未見充血和炎性細(xì)胞;模型組大鼠結(jié)腸組織可見絨毛上皮脫落壞死，炎性細(xì)胞浸潤;參附組大鼠結(jié)腸組織絨毛上皮連續(xù)但欠光滑，炎性細(xì)胞減少。詳見圖2。

2.3" 各組炎癥因子含量比較

與空白組比較，模型組LPS、IL-6、IL-1β含量顯著升高（Plt;0.001）。與模型組比較，參附組LPS、IL-6、IL-1β含量顯著降低（Plt;0.01，Plt;0.001）。詳見表2。

2.4" 各組腸道菌群比較

2.4.1" 稀釋曲線分析" 如圖3所示，各組曲線趨于平緩，測序數(shù)據(jù)達(dá)到飽和，所獲數(shù)據(jù)能夠較全面地反映大鼠腸道菌群信息，可用于后續(xù)分析。

2.4.2" 韋恩圖分析" 所有序列依據(jù)97%相似度水平劃分為872個操作分類單元（operational taxonomic unit， OTU），繪制可直觀表現(xiàn)3組樣本物種組成相似性和重疊狀況的韋恩圖（圖4）。統(tǒng)計并分析空白組、模型組、參附組樣本中共有和特有的OTU數(shù)量。空白組、模型組、參附組的OTU分別為620、497、736個。3組共有OTU為354個（40.60%），其中空白組、模型組、參附組特有的OTU分別為53個（6.08%）、53個（6.08%）、139個（15.94%）。空白組和模型組共有的OTU為384個（44.04%），空白組和參附組共有的OTU為537個（61.59%），模型組和參附組共有的OTU為414個（47.48%）。空白組與參附組的共有菌占比高于模型組與參附組的共有菌占比，空白組大鼠與參附組大鼠的菌群結(jié)構(gòu)更加相近。

2.4.3" PCoA分析（principal co-ordinates analysis， PCoA）" PC1的代表性為26.79%，PC2的貢獻(xiàn)度是10.82%?；谖醇訖?quán)的Unifrac距離算法的PCoA分析（圖5）表明，空白組、模型組、參附組的腸道細(xì)菌存在明顯的組間差異，空白組樣本同參附組樣本的組間距離較空白組樣本同模型組樣本的組間距離縮短。

2.4.4" 群落組成分析" （1）門水平物種組成情況：" 如圖6A所示，結(jié)果表明空白組、模型組、參附組在門水平的最優(yōu)細(xì)菌相同，為厚壁菌門（Firmicutes）;其余優(yōu)勢細(xì)菌門依次為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）。相較于空白組，模型組的厚壁菌門相對豐度由96.30%降低至86.03%，擬桿菌門相對豐度由2.15%降低至0.08%;變形菌門相對豐度由0.28%升高至8.27%，放線菌門相對豐度由0.99%升高至5.23%。相較于模型組，參附組的厚壁菌門相對豐度由86.03%升高至95.91%，擬桿菌門相對豐度由0.08%升高至0.62%;變形菌門相對豐度由8.27%降低至0.64%，放線菌門相對豐度由5.23%降低至1.92%。

（2）科水平物種組成情況：如圖6B所示，空白組的優(yōu)勢細(xì)菌科及其相對豐度依次為乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）48.22%、消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）30.28%、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）6.86%、顫螺旋菌科（Oscillospiraceae）3.99%等。模型組的優(yōu)勢細(xì)菌及其相對豐度依次為乳酸桿菌科44.61%、消化鏈球菌科21.47%、梭菌科（Clostridiaceae）10.28%、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）7.40%等。參附組的優(yōu)勢細(xì)菌科及其相對豐度依次為乳酸桿菌科47.65%、消化鏈球菌科27.39%、丹毒絲菌科（Erysip?elotrichaceae）4.56%、毛螺旋菌科2.90%等。

（3）屬水平物種組成情況：如圖6C所示，相對豐度前8的細(xì)菌屬依次為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、羅姆布茨菌屬（Romboutsia）、Clostridium_sensu_stricto_1、埃希-志賀菌屬（Escherichia-Shig?ella）、毛螺旋菌科NK4A136組（Lachnospiraceae_NK4A136_

group）、UCG-005、異桿菌屬（Allobaculum）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）。相較于空白組，模型組的乳酸桿菌屬相對豐度由48.22%降低至44.61%，羅姆布茨菌屬相對豐度由30.28%降低至21.47%，毛螺旋菌科NK4A136組相對豐度由3.58%降低至0.62%，UCG-005相對豐度由2.93%降低至0.01%;Clostridium_sensu_stricto_1相對豐度由0.58%升高至9.94%，埃希-志賀菌屬相對豐度由0.10%升高至7.40%，異桿菌屬相對豐度由0.12%升高至1.35%，雙歧桿菌屬相對豐度由0.01%升高至2.82%。相較于模型組，參附組的乳酸桿菌屬相對豐度由44.61%升高至47.65%，羅姆布茨菌屬相對豐度由21.47%升高至27.39%，毛螺旋菌科NK4A136組相對豐度由0.62%升高至1.13%，UCG-005相對豐度由0.01%升高至1.17%，異桿菌屬相對豐度由1.35%升高至2.33%;Clostridium_sensu_stricto_1相對豐度由9.94%降低至1.97%，埃希-志賀菌屬相對豐度由7.40%降低至0.34%，雙歧桿菌屬相對豐度由2.82%降低至0.34%。

（4）種水平物種組成情況：如圖6D所示，空白組的優(yōu)勢細(xì)菌種及其相對豐度分別為Romboutsia_ilealis 30.28%、Lactobacillus_intestinalis 18.37%、Lactobacillus_reuteri 12.13%、Lactobacillus_johnsonii 9.87%等。模型組的優(yōu)勢細(xì)菌種及其相對豐度分別為Romboutsia_ilealis 21.47%、Lactobacillus_johnsonii 16.59%、Lactobacillus_murinus 10.59%等。參附組的優(yōu)勢細(xì)菌種及其相對豐度分別為Lactobacillus_johnsonii 31.76%、Romboutsia_ilealis 27.39%、Lactobacillus_reuteri 9.94%等。

2.4.5" 多級物種差異判別分析" 如圖7所示，多級物種差異判別分析法通過檢測顯著豐度差異特征，找到豐度有顯著性差異的細(xì)菌，采用線性判別分析來估算每個物種豐度對差異效果影響的大小。相較于空白組，模型組厚壁菌門等細(xì)菌豐度顯著降低，梭菌目（Clostridiales）、梭菌科、變形菌門、腸桿菌目（Enterobacterales）、放線菌門等細(xì)菌豐度顯著升高。與模型組比較，參附組s_Lactobacillus_murinus、梭菌目、梭菌科、放線菌門等細(xì)菌豐度顯著下降，擬桿菌科（Bac?teroidaceae）、擬桿菌屬（Bacteroides）等細(xì)菌豐度顯著升高。

2.5" 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.5.1" 靶點(diǎn)預(yù)測" 從BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫得到附子有效成分46個、紅參有效成分9個，共獲得55個有效成分;得到附子靶點(diǎn)258種、紅參靶點(diǎn)99種，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到342個中藥靶點(diǎn)。分別從GeneCards數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫、NCBI數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫得到1 108、223、748、473個心衰靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到1 982個心衰靶點(diǎn)。從gutMGene數(shù)據(jù)庫得到21個腸道菌群靶點(diǎn)。利用韋恩圖對“中藥-腸道菌群-心衰”靶點(diǎn)進(jìn)行可視化分析，共有4個相同靶點(diǎn)。詳見圖8。

2.5.2" 核心有效成分及靶點(diǎn)的篩選" 按照Degree值篩選核心有效成分，核心有效成分為：間氨基苯酚、鄰氨基苯酚、對氨基苯酚、棍掌堿和欖香烯。按照Degree值篩選核心靶點(diǎn)，核心靶點(diǎn)為：IL-10、IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF）。詳見圖9。

2.5.3" GO功能和KEGG通路富集分析" GO富集分析結(jié)果顯示，生物過程（biological process， BP）條目1 089條，主要與趨化因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)、趨化因子的生產(chǎn)等相關(guān);細(xì)胞組分（cellular component， CC）條目1條，與吞噬杯相關(guān);分子功能（molecular function， MF）條目0條，詳見圖10。KEGG富集到63條通路，主要與炎癥性腸病等疾病通路相關(guān)，詳見圖11。

3 討論

目前，許多研究證實(shí)腸道菌群及其代謝產(chǎn)物與心衰具有相關(guān)性，即“心力衰竭的腸道假說”[18]。心衰通過影響機(jī)體的血流動力學(xué)，引發(fā)腸黏膜的缺血-再灌注損傷，導(dǎo)致其防御功能減弱，有利于腸道菌群及其內(nèi)毒素向腸外轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)炎性因子的釋放，引起系統(tǒng)炎癥損傷，加重心衰程度[19-20]。可見，心衰的發(fā)展與腸道菌群的改變相互影響，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善腸道微環(huán)境，或可成為治療心衰的新途徑。

動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，韋恩圖和PCoA分析結(jié)果均表明，空白組腸道菌群結(jié)構(gòu)與參附組相近，與模型組存在差異，提示心衰發(fā)展過程中存在菌群失調(diào)現(xiàn)象，參附注射液對菌群結(jié)構(gòu)的恢復(fù)有一定作用。

菌群組成分析結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠變形菌門數(shù)量顯著增加，成為模型組第二豐富的細(xì)菌門，和SUN等[21]的發(fā)現(xiàn)類似。變形菌門被認(rèn)為是腸道菌群失衡的標(biāo)志[22]，該菌門的所有成員都是革蘭氏陰性菌，其外膜主要由LPS構(gòu)成，LPS入血后可激活NF-κB信號通路，促進(jìn)TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)，加重系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，對心衰的發(fā)展產(chǎn)生負(fù)面影響[23-24]。治療后大鼠腸道內(nèi)變形菌門豐度降低，推測參附注射液可能通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮治療心衰的作用。SCFAs是腸道微生物最豐富的代謝產(chǎn)物之一，主要包括乙酸、丙酸、丁酸等，能夠參與心衰相關(guān)的免疫代謝[25]。乙酸可通過上調(diào)TRIM40的表達(dá)，抑制TNF-α、IL-6等炎性因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)[26];丙酸可通過FFAR2依賴的方式增強(qiáng)Treg功能，使結(jié)腸促炎因子水平降低，改善腸道微環(huán)境[27];丁酸作為SCFAs的一種，可以激活活化蛋白1信號通路，抑制IL-6、IL-1β等促炎因子的釋放，并通過抑制NF-κB等信號通路，調(diào)控免疫反應(yīng)，改善機(jī)體炎癥狀態(tài)[28]。毛螺旋菌科和瘤胃菌科（Ruminococcaceae）是丁酸鹽產(chǎn)生菌[29];擬桿菌屬和阿克曼菌屬（Akkermansia）豐度與丁酸鹽、丙酸鹽水平呈正相關(guān)[30];鼠桿菌科（Muribaculaceae）可通過降解特定類型的多糖產(chǎn)生乙酸、丙酸等，其豐度是腸道SCFAs含量的重要預(yù)測指標(biāo)[31]。本研究結(jié)果表明，與空白組大鼠比較，模型組毛螺旋菌科、瘤胃菌科、擬桿菌屬、阿克曼菌屬、鼠桿菌科相對豐度降低，參附注射液治療后上述細(xì)菌豐度增加，其中擬桿菌屬豐度與模型組比較有顯著差異，提示參附注射液治療心衰的機(jī)制可能與促進(jìn)腸道內(nèi)產(chǎn)SCFAs細(xì)菌增殖，進(jìn)而抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)有關(guān)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，“參附注射液-腸道菌群-心衰”共有4個炎癥相關(guān)靶點(diǎn)，分別是IL-10、IL-1β、IL-6和TNF。GO功能富集分析顯示，參附注射液通過腸道菌群治療心衰主要與趨化因子的產(chǎn)生等炎癥反應(yīng)途徑相關(guān)。KEGG分析主要富集在與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的通路。結(jié)合血液炎癥指標(biāo)LPS、IL-6、IL-1β的改變，推測參附注射液對心衰伴發(fā)菌群失調(diào)大鼠的治療與調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過16S rRNA測序聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步開展了基于心衰狀態(tài)下的“腸-心”對話研究，發(fā)現(xiàn)參附注射液治療心衰的潛在靶點(diǎn)、作用通路，及其與腸道菌群的內(nèi)在聯(lián)系。這一發(fā)現(xiàn)不僅可以提高研究人員對參附注射液治療心衰機(jī)制的認(rèn)識，而且揭示了調(diào)節(jié)腸道菌群可能成為治療心衰的一種新策略。但由于本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行菌群移植以驗(yàn)證其抗炎效果的直接作用，參附注射液能否通過調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善心功能，尚需深入探究。

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（本文編輯" 周" 旦）