〔摘要〕 目的 探討除風(fēng)益損湯對(duì)兔角膜損傷的修復(fù)作用及對(duì)自噬相關(guān)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）的影響。方法 隨機(jī)將84只新西蘭大白兔分為6組，具體為空白組、模型組、中藥組、自噬促進(jìn)組、自噬抑制組、自噬促進(jìn)+中藥組、自噬抑制+中藥組，每組12只，每一組下又分為3個(gè)亞組，每個(gè)亞組4只，分別供造模后第7、14、28天檢測(cè)。動(dòng)物模型建立后各組在第7、14、28天觀察角膜以及角膜熒光素染色情況，記錄角膜混濁評(píng)分，采用激光共焦斷層掃描儀觀察角膜基質(zhì)層修復(fù)情況，用Western blot檢測(cè)角膜中TGF-β1、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）比值、MMP-2的蛋白表達(dá)。結(jié)果 （1）角膜基質(zhì)激光共焦斷層掃描結(jié)果：除空白組外，其余各組角膜在造模后第7天均有成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原沉積。隨著時(shí)間的推移，中藥組、自噬促進(jìn)組、自噬促進(jìn)+中藥組中成纖維細(xì)胞及膠原沉積較其他組減少。（2）顯微鏡觀察白兔角膜情況：空白組白兔的角膜在第7、14、28天皆清晰透明。其余各組白兔的角膜在第7天均出現(xiàn)混濁，熒光素著染，隨著時(shí)間推移熒光素著色范圍縮小，角膜混濁逐漸消褪。角膜混濁評(píng)分顯示，與模型組相比，第28天自噬抑制組、自噬抑制+中藥組評(píng)分較高（Plt;0.05）。（3）LC3-Ⅱ/Ⅰ：與模型組相比，各時(shí)間段中藥組、自噬促進(jìn)組LC3-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)均升高（Plt;0.05），自噬抑制組表達(dá)降低（Plt;0.05）。（4）TGF-β1：與模型組相比，各時(shí)間段中藥組、自噬促進(jìn)組表達(dá)均較低（Plt;0.05），自噬抑制組表達(dá)較高（Plt;0.05）。（5）MMP-2：與模型組相比，各時(shí)間段中藥組、自噬促進(jìn)組表達(dá)均較低（Plt;0.05），自噬抑制組表達(dá)較高（Plt;0.05）。結(jié)論 除風(fēng)益損湯、氯化鋰可以促進(jìn)角膜損傷的愈合，有助于減少瘢痕形成，其機(jī)制是通過(guò)促進(jìn)自噬和調(diào)控TGF-β1、MMP-2的水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

〔關(guān)鍵詞〕 除風(fēng)益損湯;角膜損傷;自噬;微管相關(guān)蛋白輕鏈3;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1;基質(zhì)金屬蛋白酶-2

"〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5"""""""" 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A""""""""" 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.02.004

〔收稿日期〕2024-09-02

〔基金項(xiàng)目〕國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（82174443）;湖南省教育廳“芙蓉學(xué)者”獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃（2022年）;湖南省衛(wèi)生健康委高層次人才計(jì)劃（2023年）;湖南省眼科疾?。ㄖ嗅t(yī)）臨床醫(yī)學(xué)研究中心（2023SK4038）;湖南中醫(yī)藥大學(xué)一流學(xué)科開(kāi)放基金（2021ZYX05）。

〔通信作者〕*姚小磊，男，博士，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：yxlshh@126.com;彭清華，男，博士，教授、主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：pqh410007@126.com。

Effects of Chufeng Yisun Decoction on autophagy related factors and expressions of TGF-β1 and MMP-2 after corneal injury in rabbits

ZENG Lingcong1，3， WU Kai1，2， ZHU Bingyao1，4， LIU Qianhong1，2， CHEN Xiong1，2，

PENG Qinghua1*， YAO Xiaolei1，2*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 3. Chenzhou Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine， Chenzhou， Hunan 424499， China; 4. Shenzhen Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine， Shenzhen， Guangdong 518033， China

〔Abstract〕 Objective To investigate the repair effects of Chufeng Yisun Decoction on corneal injury in rabbits and its impact on autophagy related factors， as well as the expressions of TGF-β1， and MMP-2. Methods A total of 84 New Zealand white rabbits were randomized into six groups， including blank group， model group， Chinese medicines group， autophagy promotion group， autophagy inhibition group， autophagy promotion+Chinese medicines group and autophagy inhibition+Chinese medicines group， with 12 rabbits in each group. Each group was further divided into three subgroups of four rabbits each， for observations and testing at 7， 14， and 28 days post-modeling. After establishing the animal model， the corneal condition and corneal fluorescein staining were observed on days 7， 14， and 28 in each group， and the corneal opacity score was recorded. A confocal laser scanning microscopy was used to observe the repair of the corneal stroma. Western blot was employed to determine the expressions of transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， the ratio of microtubule-associated protein light chain 3 （LC3）-II/I， and matrix metalloproteinase-2 （MMP-2） in the cornea. Results （1） Confocal laser scanning of the corneal stroma： Except for the blank group， all other groups showed fibroblast infiltration and collagen deposition in the cornea on day 7 post-modeling. Over time， the Chinese medicines group， autophagy promotion group， and autophagy promotion+Chinese medicines group exhibited reduced fibroblast and collagen deposition compared to the other groups; （2） Microscopic observation of rabbit corneas： The corneas of rabbits in the blank group were clear and transparent on days 7， 14， and 28. The corneas of rabbits in all other groups were hazy and stained with fluorescein on day 7， with the fluorescein staining area decreasing and corneal opacity gradually" fading over time. Corneal opacity score showed that， compared with the model group， the autophagy inhibition and autophagy inhibition+Chinese medicines groups had higher scores on day 28 （Plt;0.05）. （3） LC3-Ⅱ/Ⅰ： Compared with the model group， the LC3-Ⅱ/Ⅰ expression was higher in the Chinese medicines and autophagy promotion groups at all time points （Plt;0.05）， while it was lower in the autophagy inhibition group （Plt;0.05）. （4） TGF-β1： Compared with the model group， the TGF-β1 expression was lower in the Chinese medicines and autophagy promotion groups at all time points （Plt;0.05）， while it was higher in the autophagy inhibition group （Plt;0.05）. （5） MMP-2： Compared with the model group， the MMP-2 expression was lower in the Chinese medicines and autophagy promotion groups at all time points （Plt;0.05）， while it was higher in the autophagy inhibition group （Plt;0.05）. Conclusion Chufeng Yisun Decoction and lithium chloride can promote the healing of corneal injuries and help reduce scar formation， and their mechanisms involve promoting autophagy and regulating the levels of TGF-β1 and MMP-2.

〔Keywords〕 Chufeng Yisun Decoction; corneal injury; autophagy; microtubule-associated protein light chain 3; transforming growth factor-β1; matrix metalloproteinase-2

本文引用： 曾令聰， 吳" 凱， 朱冰瑤， 劉倩宏， 陳" 雄， 彭清華， 姚小磊. 除風(fēng)益損湯對(duì)兔角膜損傷后自噬相關(guān)因子及TGF-β1、MMP-2表達(dá)的影響[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2025， 45（2）： 212-219.

角膜位于眼球結(jié)構(gòu)最外層，易受到物理、化學(xué)、感染等外界因素的損傷，各種原因?qū)е碌慕悄p傷，皆可使角膜過(guò)度纖維化而形成瘢痕，最終導(dǎo)致角膜盲。角膜混濁或角膜瘢痕在全球范圍內(nèi)影響超1000萬(wàn)人，是全球致盲的主要原因[1]。在臨床上，對(duì)于角膜瘢痕引起的視力障礙主要以角膜移植術(shù)為主要治療手段，但手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高、價(jià)格昂貴，且存在術(shù)后移植排斥的風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此，尋找風(fēng)險(xiǎn)較小、經(jīng)濟(jì)的有效治療方法來(lái)促進(jìn)角膜損傷后修復(fù)及減少瘢痕形成至關(guān)重要。

角膜損傷修復(fù)過(guò)程是一個(gè)多因子參與的過(guò)程，現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）在角膜修復(fù)過(guò)程中起重要的作用：能誘導(dǎo)傷口中成纖維細(xì)胞分化為不透明的肌成纖維細(xì)胞促進(jìn)傷口愈合[3];同時(shí)促使肌成纖維細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），其中ECM中的金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）沉積[4-5]。大量的肌成纖維細(xì)胞、MMP-2的沉積能降低角膜透明度[3]，進(jìn)而損害視力。而自噬過(guò)程存在于角膜損傷修復(fù)整個(gè)過(guò)程，當(dāng)自噬體或者溶酶體活性降低，角膜組織中有害因素或者過(guò)剩因子及蛋白積累，最終導(dǎo)致角膜瘢痕[6]。研究發(fā)現(xiàn)，氯化鋰通過(guò)調(diào)節(jié)自噬水平來(lái)影響TGF-β1的表達(dá)[7]。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)自噬活性來(lái)減少TGF-β1、MMP-2的表達(dá)來(lái)抑制角膜瘢痕的形成。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為角膜損傷所產(chǎn)生的角膜瘢痕“翳”的范疇，《眼科秘訣·論退翳法》中“翳者，氣血津凝而不行，結(jié)聚而成云翳”，歸結(jié)為角膜氣血津液運(yùn)行失常是“翳”產(chǎn)生的病機(jī)，而外傷是導(dǎo)致氣血津液運(yùn)行失常最常見(jiàn)原因。中醫(yī)學(xué)擁有龐大的藥物資源，在眼表?yè)p傷的治療中已取得良好的成效，除風(fēng)益損湯便是代表之一。除風(fēng)益損湯出自《原機(jī)啟微》：“主治目為物所傷”為中醫(yī)治療眼部外傷的常用代表方劑。本方由熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎、藁本、前胡、防風(fēng)組成，具有養(yǎng)血活血、祛風(fēng)明目之功，現(xiàn)代常用于眼外傷及眼科術(shù)后，預(yù)防及治療氣血津液運(yùn)行失常產(chǎn)生翳障的常用方劑，使用除風(fēng)益損湯有助于調(diào)整氣血運(yùn)行，從而促進(jìn)角膜的修復(fù)[8-10]。故除風(fēng)益損湯理論上可減少“翳”的形成。本實(shí)驗(yàn)將以新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，從TGF-β1、MMP-2以及自噬相關(guān)因子著手，研究除風(fēng)益損湯是否有助于減少角膜損傷后瘢痕的形成，并探討其機(jī)制，旨在為除風(fēng)益損湯在角膜損傷中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)借鑒。

1 材料

1.1" 動(dòng)物

健康成年的普通級(jí)新西蘭兔84只，雄性，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，許可證號(hào)：SCXK（湘）2020-0005，購(gòu)自湖南太平生物科技有限公司。均在20～25 ℃環(huán)境中以普通飼料喂養(yǎng)，本研究方案已通過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（編號(hào)：LL20210921001）。

1.2" 藥物配制

除風(fēng)益損湯組成：熟地黃、當(dāng)歸、白芍藥、川芎各3 g;藁本、前胡、防風(fēng)各2.1 g，藥物購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廠家為四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司。該藥為顆粒劑，根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)用量，分袋密封包裝，室溫條件下儲(chǔ)存。

根據(jù)NIE等[7]的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)20 mmol/L氯化鋰處理過(guò)的角膜基質(zhì)細(xì)胞活性高，故將0.84 g氯化鋰顆粒溶于100 mL生理鹽水中用于角膜板層注射。0.5 mg/mL 3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-Ma）：將5 mg 3-Ma溶解于10 mL生理鹽水中。

1.3" 主要試劑與儀器

TGF-β抗體、LC3抗體、MMP-2抗體（Proteintech，批號(hào)：21898-1-AP，14600-1-AP，10373-2-AP）;氯化鋰（阿法丁，批號(hào)：7447418）;3-甲基腺嘌呤（MCE，批號(hào)：HY-19312）;戊巴比妥鈉（Sigma，批號(hào)：P3761）;脫脂奶粉（伊利，批號(hào)：66196131T）;三硫叔糖醇（Biosharp，批號(hào)：Amresco0281）;SDS、甘油、甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：30166428、 10010618、10014118）;TEMED、Trise-Base、溴酚藍(lán)、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、PMSF（Amresco，批號(hào)：Amresc00761、Exp2017/12、BO449-5G、Exp2016109、Amresc00172、329-98-6）;PVDF膜（Millipore，批號(hào)：IPVH00010）;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）（上海碧云天生物有限公司，批號(hào)：P0010S）;電泳儀（Tanon，批號(hào)：EPS300）;酶標(biāo)儀（Thermo，批號(hào)：muLI?SKANMK3）;4 ℃離心機(jī)（Eppendorf，批號(hào)：Centrifuge 5415R）;月形隧道刀頭（宿遷天工醫(yī)療，型號(hào)：2.8 mm月形刀）;共焦激光斷層掃描儀（德國(guó)Heidelberg Engineering GmbH，型號(hào)：HRT3）;7×～50×倍三目顯微鏡、4800萬(wàn)像素高清相機(jī)（深圳市海約電子有限公司，型號(hào)“HY-0750A）;角膜環(huán)鉆（淮安中林東晟醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：直徑6 mm）。

2 方法

2.1" 分組

取84只健康雄性新西蘭大白兔，隨機(jī)分為7組，每組12只，具體為空白組、模型組、中藥組、自噬促進(jìn)組、自噬抑制組、自噬促進(jìn)+中藥組、自噬抑制+中藥組。分別供造模后7、14、28 d檢測(cè)。

2.2" 兔角膜損傷模型制備

根據(jù)所查閱文獻(xiàn)及臨床基礎(chǔ)，參照CONNON[11]及徐路星[12]的方法，對(duì)于造模方式進(jìn)行改良，予空白組不做處理，其他組制作成兔角膜損傷動(dòng)物模型。造模方法：將新西蘭大白兔固定于兔固定箱中，剔除雙耳及雙眼周?chē)l(fā)，充分暴露耳緣靜脈及眼周皮膚，將10%戊巴比妥鈉溶液以耳緣靜脈注射的方式麻醉白兔，待白兔麻醉后置其于干凈手術(shù)臺(tái)，常規(guī)消毒鋪巾，以?shī)W布卡因滴眼劑滴眼表面麻醉3次。在顯微鏡下使用6 mm的角膜環(huán)鉆在角膜中央進(jìn)行旋轉(zhuǎn)按壓，留下直徑約6 mm的圓形印跡，使用2.8 mm月形隧道刀剔除角膜厚度約100 μm，造成直徑為6 mm，深度為100 μm左右的圓形角膜創(chuàng)面。

2.3" 干預(yù)方法

造模完成后，空白組、模型組不做特殊干預(yù)。參照由新英[13]的方法稍作改良，使用32G注射針頭在自噬促進(jìn)組、自噬促進(jìn)+中藥組角膜的3點(diǎn)、6點(diǎn)、9點(diǎn)、12點(diǎn)位置注射20 mmol/L氯化鋰溶液，每個(gè)方位注射0.05 mL。使用32G注射針頭在自噬抑制組和自噬抑制+中藥組角膜的3點(diǎn)、6點(diǎn)、9點(diǎn)、12點(diǎn)位置注射0.5 mg/mL的3-MA溶液，每個(gè)方位注射0.05 mL。術(shù)后均予以左氧氟沙星凝膠抗感染。中藥組、自噬促進(jìn)+中藥組、自噬抑制+中藥組每天予以中藥湯劑灌胃5 mL。

2.4" 觀測(cè)指標(biāo)

分別在造模后第7、14、28天對(duì)白兔進(jìn)行角膜激光共焦斷層掃描儀檢查、高倍顯微鏡眼前段觀察。之后處死動(dòng)物，剪取角膜組織低溫保存以供Western blot檢測(cè)。

2.4.1" 角膜激光共焦斷層掃描儀檢查" 在造模7、14、28 d后，對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行激光共焦斷層掃描儀檢查。將新西蘭大白兔置于兔固定箱中并放于穩(wěn)定平臺(tái)，予以?shī)W布卡因滴眼劑滴眼進(jìn)行表面麻醉3次。將左氧氟沙星凝膠涂于角膜顯微鏡鏡頭表面，蓋上無(wú)菌接觸帽。將兔頭固定，并貼近于激光共焦斷層掃描儀的激光攝像頭。調(diào)整激光頭位置，使激光攝像頭光束位于角膜損傷病灶區(qū)域后向前緩慢推進(jìn)激光攝像頭。當(dāng)前接觸帽與角膜之間相距5～10 mm時(shí)，再緩慢調(diào)整激光攝像頭的位置，讓角膜接觸帽中央對(duì)準(zhǔn)角膜激光束反射光點(diǎn)。然后緩慢旋轉(zhuǎn)推進(jìn)激光攝像頭，讓角膜與角膜接觸帽之間保持一種輕微的接觸。系統(tǒng)上設(shè)定焦距平面為0，擰動(dòng)激光掃描旋鈕改變焦平面，觀察并采集不同深度的角膜圖像。

2.4.2" 高倍顯微鏡眼前段觀察" 在造模7、14、28 d后，對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行高倍顯微鏡觀察。將新西蘭大白兔置于兔固定箱中并放于穩(wěn)定平臺(tái)。予以?shī)W布卡因滴眼劑進(jìn)行表面麻醉3次后放開(kāi)瞼器。調(diào)整顯微鏡位置，使視野落于角膜表面，充分暴露角膜及角膜創(chuàng)面區(qū)域。調(diào)整顯微鏡焦距，觀察兔角膜并采集圖像。然后用2%熒光素鈉滴眼液對(duì)兔角膜進(jìn)行染色，顯微鏡轉(zhuǎn)換為鈷藍(lán)色燈，調(diào)整顯微鏡焦距，觀察并采集圖像。

2.4.3" 角膜混濁評(píng)分來(lái)評(píng)估角膜瘢痕的程度" 在造模7、14、28 d后，對(duì)7組新西蘭大白兔進(jìn)行裂隙燈生物顯微鏡觀察下觀察角膜混濁及基本情況進(jìn)行臨床評(píng)分，臨床評(píng)分根據(jù)SHARMA等[14]和FANTES等[15]報(bào)道的量表進(jìn)行分級(jí)，評(píng)分細(xì)則及具體標(biāo)準(zhǔn)。詳見(jiàn)表1。

2.4.4" Western blot檢測(cè)TGF-β1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、MMP-2蛋白表達(dá)" 準(zhǔn)備1×TBST、10×電泳緩沖液、10×電轉(zhuǎn)緩沖液、5%牛奶封閉液，使用RIPA強(qiáng)裂解液稀釋PMSF，配制裂解液，按每60 mg組織粉末加入150 μL RIPA裂解液振蕩混勻后放入冰盤(pán)上，搖床上搖1 h。將裂解溶液放入4 ℃的低溫冰箱中12 000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)行蛋白定量。采用上海碧云天生物有限公司BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將不同濃度蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入對(duì)應(yīng)的一抗在搖床孵育一夜。第2天回收一抗，清洗后加入對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h。洗去多余二抗，制備AB液，加入AB混合液，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光30/60，觀察結(jié)果并保存圖片。

2.5" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量結(jié)果采用“x±s”表示。多組間定量資料或數(shù)值變量資料比較符合正態(tài)性及方差齊性則采用單因素方差分析及多重比較;不滿足正態(tài)性及方差齊性則采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較。均以Plt;0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1" 角膜基質(zhì)激光共焦斷層掃描結(jié)果

空白組在3次測(cè)量時(shí)間點(diǎn)皆顯示角膜基質(zhì)層的基質(zhì)細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞呈橢圓狀、細(xì)胞核高反光，細(xì)胞間網(wǎng)狀連接，細(xì)胞間未見(jiàn)膠原沉積。模型組在造模后第7天顯示基質(zhì)細(xì)胞密度降低并被細(xì)長(zhǎng)狀成纖維細(xì)胞代替并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞間聯(lián)系模糊;在第14天時(shí)，角膜基質(zhì)見(jiàn)成纖維細(xì)胞浸潤(rùn);第28天時(shí)，基質(zhì)層見(jiàn)大量肌成纖維細(xì)胞及膠原沉積。中藥組在造模7天后顯示基質(zhì)中有成纖維細(xì)胞浸潤(rùn);第14天可見(jiàn)成纖維細(xì)胞及膠原沉積，第28天可見(jiàn)少量成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原沉積。自噬促進(jìn)組在造模第7天時(shí)可見(jiàn)少許炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞;第14天可見(jiàn)少許成纖維細(xì)胞;第28天可見(jiàn)少量成纖維細(xì)胞及膠原沉積。自噬抑制組在造模后第7天可見(jiàn)基質(zhì)細(xì)胞密度降低，可見(jiàn)瘢痕;第14天可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞及膠原沉積;第28天可較多膠原沉積。自噬促進(jìn)+中藥組在造模第7天基質(zhì)細(xì)胞密度較低，少量膠原沉積;第14天可基質(zhì)中少量成纖維細(xì)胞浸潤(rùn);第28天可見(jiàn)少量成纖維細(xì)胞及膠原沉積。自噬抑制+中藥組在造模第7天可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);第14天可見(jiàn)基質(zhì)間存在成纖維細(xì)胞及少量膠原沉積;第28天可見(jiàn)成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞，角膜見(jiàn)褶皺現(xiàn)象。詳見(jiàn)圖1。

3.2" 顯微鏡眼前節(jié)形態(tài)表現(xiàn)

3.2.1" 顯微鏡下角膜情況" 空白組角膜在第7、14、28天皆清晰透明。其余各組第7天均出現(xiàn)角膜混濁，角膜不平整呈半透明狀，熒光素著染，隨著時(shí)間推移熒光素著染范圍縮小，角膜混濁逐漸消褪。在第28天，各組熒光素著染范圍較第7天減小，角膜混濁減輕。其中，模型組角膜表層不均勻，角膜混濁伴有輕微的熒光著染，中藥組及自噬促進(jìn)組在角膜混濁程度較模型組輕，可模糊透間虹膜紋理。自噬促進(jìn)+中藥組角膜混濁程度較其余各組明顯減輕，可模糊透見(jiàn)虹膜紋理。自噬抑制組在建模后第7、14、28天角膜出現(xiàn)質(zhì)地不均勻的混濁，不能窺見(jiàn)虹膜結(jié)構(gòu)，尤其在第28天時(shí)角膜中央可見(jiàn)新生血管蔓延，中央周?chē)梢?jiàn)不均勻的角膜瘢痕。自噬抑制+中藥組在建模后第28天角膜混濁程度接近于模型組。詳見(jiàn)圖2。

3.2.2" 角膜混濁評(píng)分" 與空白組比較，模型組在造模后第7、14、28天的角膜混濁程度均有升高（Plt;0.05）。與模型組相比較，自噬促進(jìn)+中藥組在造模后第7、14、28天角膜混濁程度均均有降低（Plt;0.05），而自噬抑制組在造模后第7、14、28天的角膜混濁明顯高于模型組（Plt;0.05）。詳見(jiàn)表2。

3.3" Western blot檢測(cè)TGF-β1、LC3、MMP-2相關(guān)蛋白表達(dá)

與空白組相比，各時(shí)間段模型組LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)顯著升高（Plt;0.05）。與模型組相比，各時(shí)間段中藥組、自噬促進(jìn)組LC3-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)均升高（Plt;0.05），自噬抑制組表達(dá)降低（Plt;0.05）。與中藥組相比，各時(shí)間段自噬促進(jìn)+中藥組LC3-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)較高（Plt;0.05），自噬抑制+中藥組表達(dá)較低（Plt;0.05）。

與空白組相比，各時(shí)間段模型組TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)顯著升高（Plt;0.05）。與模型組相比，各時(shí)間段中藥組、自噬促進(jìn)組TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)均較低（Plt;0.05），自噬抑制組表達(dá)較高（Plt;0.05）。與中藥組對(duì)比，各時(shí)間段自噬促進(jìn)+中藥組TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)降低（Plt;0.05），自噬抑制+中藥組TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)升高（Plt;0.05）。詳見(jiàn)圖3—4。

4 討論

角膜損傷修復(fù)過(guò)程是一個(gè)由膠原蛋白、糖胺聚糖、基質(zhì)金屬蛋白酶等多因子參與的過(guò)程[3]。而MMP-2作為MMPs重要成員之一，在該過(guò)程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)角膜基質(zhì)受到創(chuàng)傷后，在創(chuàng)傷區(qū)周?chē)せ畹慕悄せ|(zhì)細(xì)胞會(huì)進(jìn)行凋亡來(lái)防止在角膜損傷修復(fù)過(guò)程中有害因素對(duì)周?chē)悄そM織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不良影響[16]。部分激活的角膜基質(zhì)細(xì)胞會(huì)在TGF-β1等作用下分化為角膜成纖維細(xì)胞并遷移至損傷區(qū)域，在TGF-β1的作用下誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向不透明的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化并促進(jìn)ECM分泌[5]。角膜基質(zhì)混濁/瘢痕主要是ECM的沉積以及肌成纖維細(xì)胞存在的結(jié)果[17]。當(dāng)組織修復(fù)到一定程度，成纖維細(xì)胞開(kāi)始凋亡，肌成纖維細(xì)胞侵襲并充滿創(chuàng)傷處最終形成瘢痕，經(jīng)過(guò)數(shù)月或數(shù)年的修復(fù)，規(guī)則正常的ECM逐漸取代肌成纖維細(xì)胞及其產(chǎn)生的混濁ECM[18]。該過(guò)程中肌成纖維細(xì)胞也會(huì)向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，異常ECM被重吸收，角膜細(xì)胞重新組成基質(zhì)，角膜透明度逐漸恢復(fù)[19]。角膜傷口愈合過(guò)程中基質(zhì)中ECM沉積過(guò)多和出現(xiàn)異常的肌成纖維細(xì)胞，將會(huì)產(chǎn)生角膜瘢痕，自噬可能有助于減少或清除多余的ECM來(lái)減輕瘢痕增生。有研究報(bào)道，在角膜疾病中角膜成纖維細(xì)胞中的蛋白質(zhì)如LC3A/B和LAMP-1在角膜傷口表達(dá)增加[20]，氯化鋰原本是一種廣泛應(yīng)用于精神和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療藥物，近期發(fā)現(xiàn)氯化鋰能在一定程度上促進(jìn)自噬[21-22]，CHOI等[23]，發(fā)現(xiàn)氯化鋰能增加角膜基質(zhì)中成纖維細(xì)胞LC3II/I的比例，同時(shí)還TGF-β1的表達(dá)隨著氯化鋰的濃度增加而減少。常鳴[24]等在使用哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白通路抑制劑雷帕霉素作用于小鼠角膜瘢痕后發(fā)現(xiàn)，自噬水平的提高降低角膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志α-SMA的表達(dá)，以及TGF-β1的表達(dá)[24]，從而減輕角膜瘢痕。

角膜歸屬于中醫(yī)學(xué)黑睛范疇，黑睛常暴露于外，易受外傷及邪毒侵襲，絡(luò)脈受損，目珠流失氣血，致氣血不足、瘀血留滯，風(fēng)熱邪氣乘虛而入，留存于黑睛致氣機(jī)郁滯[25]?！秱茀R纂·外邪篇》言“大凡傷損癥，有外邪乃乘虛而入”，并且《原機(jī)啟微·卷二》曰 “翳之所生，多因風(fēng)熱不制”，說(shuō)明角膜損傷后易感風(fēng)熱之邪。《眼科秘訣·論退翳法》載：“翳者，氣血津凝而不行，結(jié)聚而成云翳?！本C合認(rèn)為，角膜損傷所產(chǎn)生的翳證的病機(jī)為氣血失和，風(fēng)熱侵襲。除風(fēng)益損湯由四物湯加藁本、前胡、防風(fēng)組成，方中四物湯補(bǔ)血養(yǎng)血、活血明目，配合藁本、前胡、防風(fēng)祛風(fēng)散邪，使得全方補(bǔ)血而不滯、行血而不過(guò)。諸藥合用，養(yǎng)血活血、祛風(fēng)明目，促使氣血得以暢達(dá)目竅用以療養(yǎng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，眼前節(jié)照相及角膜熒光素染色、角膜混濁評(píng)分中，隨著時(shí)間推移，實(shí)驗(yàn)兔在中藥除風(fēng)益損湯湯劑灌胃治療和LiCl板層角膜注射治療及聯(lián)合治療對(duì)比模型組角膜混濁程度較輕，虹膜紋理更為清晰。而通過(guò)3-MA板層角膜注射治療對(duì)比模型組角膜混濁程度更重，虹膜紋理模糊。以上說(shuō)明除風(fēng)益損湯和LiCl板層角膜注射對(duì)兔角膜損傷修復(fù)有促進(jìn)作用，且提高自噬水平能促進(jìn)角膜損傷修復(fù)。通過(guò)激光共焦斷層掃描在不同時(shí)間進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)模型組在造模第7、14天時(shí)間段內(nèi)存在炎癥細(xì)胞及大量成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)，造模28 d可見(jiàn)成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原沉積，而中藥組、自噬促進(jìn)組、自噬促進(jìn)+中藥組成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原沉積少，而自噬抑制組對(duì)比模型組膠原沉積更多。以上說(shuō)明成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)和LiCl板層角膜注射能減少成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，減輕膠原沉積來(lái)從而減輕角膜瘢痕。在Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)兔LC3-Ⅱ/Ⅰ隨時(shí)間推移升高，本實(shí)驗(yàn)中自噬促進(jìn)+中藥組LC3-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)明顯高于各建模組，中藥組、自噬促進(jìn)組中LC3-Ⅱ/Ⅰ較模型組高說(shuō)明除風(fēng)益損湯和LiCl板層角膜注射能促進(jìn)角膜自噬水平。而TGF-β1、MMP-2表達(dá)在自噬促進(jìn)+中藥組、中藥組、自噬促進(jìn)組中均低于模型組，且隨著時(shí)間的推移而減少，而自噬抑制組TGF-β1、MMP-2表達(dá)高于模型組，這與XU等[26]在角膜損傷予以治療后MMP-2降低相似，由此可知除風(fēng)益損湯和LiCl板層角膜注射能減少TGF-β1、MMP-2表達(dá)，從而減少角膜瘢痕。與空白組相比，模型組TGF-β1、MMP-2蛋白在各時(shí)間段表達(dá)均升高，TGF-β1、MMP-2增加以促進(jìn)角膜瘢痕的形成完成角膜基質(zhì)的重塑，自噬增加以清除多余的ECM，抑制炎癥反應(yīng)。與模型組相比，中藥組和自噬促進(jìn)組在3個(gè)時(shí)間段的LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)升高，TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)降低。提示除風(fēng)益損湯和氯化鋰可增加兔角膜中的自噬效應(yīng)，自噬活性的升高幫助角膜恢復(fù)正常的ECM，限制細(xì)胞應(yīng)激。同時(shí)降低TGF-β1、MMP-2減少瘢痕的形成。相反，自噬抑制組與模型組相比，各時(shí)間段LC3-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)降低，TGF-β1、MMP-2表達(dá)升高，提示3-MA降低了兔角膜中的自噬，細(xì)胞持續(xù)處于應(yīng)激狀態(tài)，不利于角膜透明度的恢復(fù)和傷口的愈合。與中藥組相比，各時(shí)間段自噬促進(jìn)+中藥組增加自噬更明顯，降低TGF-β1與MMP-2的效果也更加顯著，自噬抑制+中藥組則相反，提示促進(jìn)自噬有利于除風(fēng)益損湯發(fā)揮更好的修復(fù)角膜的作用。

綜上可知，角膜損傷后可以調(diào)控TGF-β1、MMP-2和自噬水平來(lái)影響角膜愈合及瘢痕的形成。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)宏觀和微觀的觀察角度，以及分子水平的檢測(cè)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)除風(fēng)益損湯、氯化鋰對(duì)于角膜損傷愈合起到促進(jìn)作用，并能減少瘢痕形成，其機(jī)制可通過(guò)促進(jìn)自噬和調(diào)控TGF-β1、MMP-2的水平來(lái)實(shí)現(xiàn)，二者合用效果更佳。

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（本文編輯" 蘇" 維）