〔摘要〕 目的 建立C57BL/6小鼠哮喘肝郁證病證結(jié)合模型并進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 50只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白組、哮喘組、哮喘肝郁組、布地奈德組、柴樸湯組。除空白組外，其余4組小鼠均采用屋塵螨（HDM）25 μg滴鼻，1次/d，5 d/周，持續(xù)4周進(jìn)行哮喘造模，其中哮喘肝郁組、布地奈德組和柴樸湯組同期聯(lián)合予以慢性不可預(yù)知性溫和刺激（CUMS），1次/d，持續(xù)28 d制備哮喘肝郁證模型。布地奈德組（吸入用布地奈德混懸液0.5 g/L霧化吸入）和柴樸湯組（柴樸湯12.48 g/kg灌胃）于造模第15～28天接受治療。觀察各組小鼠一般狀況、體質(zhì)量，并進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)肺功能及血清促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平，HE染色及Masson染色觀察肺組織病理情況。結(jié)果 第28天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，與空白組比較，哮喘組與哮喘肝郁組一般狀況評(píng)分、肺阻力（RL）、ACTH及IL-6均顯著升高（Plt;0.01），用力肺活量（FVC）及呼氣峰流量（PEF）均明顯減少（Plt;0.01），HE染色及Masson染色示氣道周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖維沉積明顯;哮喘肝郁組體質(zhì)量、糖水偏好指數(shù)明顯下降（Plt;0.01），游泳不動(dòng)時(shí)間明顯增加（Plt;0.01）。與哮喘組比較，哮喘肝郁組體質(zhì)量、糖水偏好指數(shù)、FVC及PEF均明顯下降（Plt;0.01），游泳不動(dòng)時(shí)間、ACTH及IL-6均顯著升高（Plt;0.01），HE染色及Masson染色示氣道周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖維沉積更嚴(yán)重。與哮喘肝郁組比較，布地奈德組及柴樸湯組一般狀況評(píng)分、游泳不動(dòng)時(shí)間、RL及IL-6均明顯下降（Plt;0.01），體質(zhì)量、FVC及PEF均明顯升高（Plt;0.01），HE染色及Masson染色示氣道周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖維沉積減輕;柴樸湯組糖水偏好指數(shù)明顯升高（Plt;0.01），ACTH明顯下降（Plt;0.01）。與布地奈德組比較，柴樸湯組體質(zhì)量及糖水偏好指數(shù)均升高（Plt;0.05），游泳不動(dòng)時(shí)間減少（Plt;0.05），HE染色及Masson染色示氣道周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖維沉積程度更輕。結(jié)論 采用HDM 25 μg滴鼻，1次/d，5 d/周，持續(xù)4周，同時(shí)聯(lián)用28 d CUMS能夠成功構(gòu)建小鼠哮喘肝郁證病證結(jié)合模型。

〔關(guān)鍵詞〕 哮喘;肝郁證;動(dòng)物模型;病證結(jié)合;柴樸湯

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5"""""""" 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A""""""""" 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.02.003

〔收稿日期〕2024-10-29

〔基金項(xiàng)目〕湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（22B0383）;湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX20230819）;湖南中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)研究生創(chuàng)新課題（2023CX117）;湖南中醫(yī)藥大學(xué)-湖南明康中錦醫(yī)療科技發(fā)展有限公司聯(lián)合基金項(xiàng)目（2022MKZJ08）;長(zhǎng)沙市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（kq2208184）。

〔通信作者〕*戴愛(ài)國(guó)，男，博士，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：daiaiguo@hnucm.edu.cn。

Establishment and evaluation of a mouse model combining asthma with liver qi stagnation pattern

PENG Guoran1，2， CHENG Beibei2，3， DING Rongzhen2，3， DAI Aiguo2，3，4*

1. School of Integrated Chinese and Western Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. Key Laboratory of Vascular Biology and Translational Medicine， Education Department of Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Research Laboratory of Respiratory Diseases， School of Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 4. Respiratory Medicine Department， the First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Abstract〕 Objective To establish and evaluate a model combining asthma with liver qi stagnation pattern in C57BL/6 mice. Methods Fifty C57BL/6 mice were randomized into blank group， asthma group， asthma with liver qi stagnation group， budesonide group， and Chaipo Decoction （CPD） group. Except for the blank group， the other four groups of mice were intranasally administered with 25μg of house dust mite （HDM） once a day， five days a week， for four weeks to induce the asthma model. Among them， the asthma with liver qi stagnation group， budesonide group， and CPD group were simultaneously subjected to chronic unpredictable mild stress （CUMS） once a day for 28 days to establish the asthma with liver qi stagnation pattern model. The budesonide group （receiving nebulized inhalation of budesonide suspension at 0.5 g/L） and the CPD group （receiving gastric gavage of CPD at 12.48 g/kg） were treated from day 15 to day 28 of modeling. The general condition and body weight of mice in each group were observed， sucrose preference test and forced swimming test were conducted， and lung function and serum levels of adrenocorticotropic hormone （ACTH） and interleukin-6 （IL-6） were measured. Additionally， pathological conditions of lung tissue were observed via HE staining and Masson staining. Results At the end of the 28-day experiment， compared with the blank group， the asthma group and the asthma with liver qi stagnation group showed significant increases in general condition scores， pulmonary resistance （RL）， and levels of ACTH and IL-6 （Plt;0.01）， as well as significant decreases in forced vital capacity （FVC） and peak expiratory flow （PEF） （Plt;0.01）. HE staining and Masson staining revealed marked infiltration of inflammatory cells and deposition of collagen fibers around the airways. Additionally， the asthma with liver qi stagnation group exhibited significant decreases in body weight and sucrose preference index （Plt;0.01）， along with a significant increase in immobility time during swimming （Plt;0.01）. Compared with the asthma group， the asthma with liver qi stagnation group showed significant decreases in body weight， sucrose preference index， FVC， and PEF （Plt;0.01）. Furthermore， there were significant increases in immobility time during swimming， ACTH， and IL-6 levels （Plt;0.01）. HE staining and Masson staining revealed more severe inflammatory cell infiltration and collagen fiber deposition around the airways. Compared with the asthma with liver qi stagnation group， the budesonide group and the CPD group showed significant decreases in general condition score， immobility time during swimming， RL， and IL-6 levels （Plt;0.01）， and significant increases in body weight， FVC， and PEF （Plt;0.01）. HE staining and Masson staining revealed reduced inflammatory cell infiltration and collagen fiber deposition around the airways. Furthermore， the CPD group showed a significant increase in sucrose preference index （Plt;0.01） and a significant decrease in ACTH level （Plt;0.01）. Compared with the budesonide group， the CPD group showed significant increases in body weight and sucrose preference index （Plt;0.05）， as well as a decrease in immobility time during swimming （Plt;0.05）. HE staining and Masson staining revealed milder inflammatory cell infiltration and collagen fiber deposition around the airways. Conclusion A mouse model combining asthma with liver qi stagnation pattern can be successfully established by intranasal administration of HDM 25 μg， once daily， five days a week for four weeks， combined with 28 days of CUMS.

〔Keywords〕 asthma; liver qi stagnation pattern; animal model; combination of disease and pattern; Chaipo Decoction

本文引用： 彭果然， 程貝貝， 丁蓉珍， 戴愛(ài)國(guó). 哮喘肝郁證病證結(jié)合小鼠模型的建立與評(píng)價(jià)[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2025， 45（2）： 204-211.

哮喘是一種由慢性氣道炎癥引起的影響全球3億多人的呼吸系統(tǒng)疾病，其臨床癥狀包括喘鳴、氣促、胸悶、咳嗽等反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。隨著現(xiàn)代社會(huì)工作和生活節(jié)奏的加快，因壓力過(guò)大、情志不遂而表現(xiàn)為肝郁證的人日益增多，在哮喘患者群體中經(jīng)中醫(yī)辨證為肝郁證者頗為常見(jiàn)。此類(lèi)患者往往因哮喘難以根治、癥狀反復(fù)發(fā)作、需要長(zhǎng)期用藥治療而深感困擾，情志不遂日久成肝郁。哮喘肝郁證患者較多，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，且哮喘肝郁證的病證結(jié)合動(dòng)物模型的制備尚未形成公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。各課題組根據(jù)自身對(duì)哮喘肝郁證的理解，選用相應(yīng)的動(dòng)物模型制備方法及評(píng)價(jià)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)論的可靠性受到質(zhì)疑，也不利于科研成果的評(píng)價(jià)。因此，亟須建立規(guī)范的哮喘肝郁證病證結(jié)合動(dòng)物模型。本課題組在前期研究[2-3]的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，建立哮喘肝郁證病證結(jié)合小鼠模型，并對(duì)其一般狀況、體質(zhì)量、糖水偏好指數(shù)、游泳不動(dòng)時(shí)間、肺功能、肺組織病理學(xué)等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。同時(shí)，應(yīng)用具有疏肝行氣解郁、理肺化痰平喘功效的中藥復(fù)方柴樸湯“以方測(cè)證”確認(rèn)模型構(gòu)建成功，以期為中醫(yī)藥防治哮喘肝郁證的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供較為理想的模型，從而推動(dòng)哮喘肝郁證的發(fā)病機(jī)制研究及相關(guān)藥物開(kāi)發(fā)。

1 材料

1.1" 動(dòng)物

50只6周齡SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠均由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SC?XK（湘）2021-0002，合格證號(hào)：430727241102164147]，在湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)單位許可證編號(hào)為SYXK（湘）2019-0009，飼養(yǎng)條件包括12 h光暗周期（日光燈照射），室溫（25±1.5） ℃，濕度45%±10%。在無(wú)特殊實(shí)驗(yàn)要求的情況下，小鼠可以自由飲水和進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)已獲得湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號(hào)為HNUCM21-2407-17。

1.2" 藥物

柴樸湯顆粒由柴胡、法半夏、厚樸、黃芩、人參、茯苓、大棗、紫蘇葉、炙甘草、生姜按照配伍比例7∶5∶3∶3∶3∶3∶3∶2∶2∶1組成，為全成分中藥配方顆粒。中藥均購(gòu)于廣東一方制藥有限公司，批號(hào)分別為：A2070263、A2101473、A2073144、A2033693、A2090353、A208A

163、A2081403、A2121543、A2111503、A2121483。吸入用布地奈德混懸液（商品名：天晴速暢;批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20203063;規(guī)格：2 mL∶1 mg;正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：240510497）。

1.3" 主要試劑

屋塵螨（house dust mite， HDM）提取物（GREER公司，貨號(hào)：XPB91D3A25）;促腎上腺皮質(zhì)激素（adre?nocorticotropic hormone， ACTH）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6 ELISA檢測(cè)試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號(hào)：2409M12、2409M09）;HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒（中國(guó)碧云天有限公司，批號(hào)：C0105S、C0189S）。

1.4" 主要儀器

小動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀（北京普升科技有限公司，型號(hào)：DSI Buxco-PFT）;壓縮式霧化器（北京歐姆龍醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：NE-C28）;透明動(dòng)物霧化箱（自制）;高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，型號(hào)：H1750R）;BioTek吸收光酶標(biāo)儀（北京質(zhì)研科技有限公司，型號(hào)：800 TS）。

2 方法

2.1" 動(dòng)物模型制備及處理

50只SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為5組，即空白組、哮喘組、哮喘肝郁組、布地奈德組、柴樸湯組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。哮喘組參照文獻(xiàn)[4]制備模型，采用HDM

25 μg（溶于35 μL生理鹽水中）滴鼻，1次/d，5 d/周，持續(xù)4周。小鼠出現(xiàn)呼吸急促、點(diǎn)頭樣呼吸、腹肌明顯收縮、背部弓起、頻繁搔鼻和抓耳等癥狀，表明哮喘模型構(gòu)建成功。哮喘肝郁證組、布地奈德組、柴樸湯組在此基礎(chǔ)上同時(shí)予以28 d慢性不可預(yù)知性溫和刺激（chronic unpredictable mild stress， CUMS）進(jìn)行干預(yù)。刺激方式參照前期研究[2-3]及文獻(xiàn)報(bào)道[5]并進(jìn)行優(yōu)化：4 ℃冷水游泳5 min;懸尾刺激5 min;夾尾刺激5 min;束縛2 h;去除墊料6 h;45°傾斜鼠籠6 h;潮濕墊料24 h。上述刺激方式每日1種，1次/d，每種刺激方式均使用4次，且每周每種刺激方式只使用1次，隨機(jī)安排，使動(dòng)物不能預(yù)知次日的刺激方式，并且確保連續(xù)2 d不出現(xiàn)同樣的刺激方式。

柴樸湯組根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[6]中人體和動(dòng)物的藥物量效劑量表，以臨床等效劑量作為小鼠的給藥劑量，從實(shí)驗(yàn)第15天起給予柴樸湯0.2 mL（12.48 g/kg）灌胃，1次/d，連續(xù)14 d。布地奈德組從實(shí)驗(yàn)第15天起參照文獻(xiàn)[7]予吸入用布地奈德混懸液0.5 g/L霧化吸入，1次/d，30 min/次，連續(xù)14 d。

2.2" 評(píng)價(jià)指標(biāo)與檢測(cè)方法

2.2.1" 小鼠一般狀況評(píng)估" 觀察各組小鼠造模前后的精神、皮毛、行為及呼吸等表現(xiàn)。參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行一般狀況評(píng)分：精神狀況（正常為1分;稍差為2分;較差為3分;明顯變差為4分;精神萎靡為5分）;皮毛狀態(tài)（柔順有光澤為1分;稍微雜亂，略微失去光澤為2分;雜亂少光澤為3分;皮毛干燥明顯、較為枯槁，基本無(wú)光澤為4分;嚴(yán)重枯槁，無(wú)光澤為5分）;活動(dòng)度（活動(dòng)靈巧為1分;活動(dòng)略顯遲緩為2分;反應(yīng)明顯緩慢為3分;活動(dòng)減少，行動(dòng)遲鈍，僅在受到較強(qiáng)刺激時(shí)才有輕微移動(dòng)為4分;扎堆不動(dòng)，幾乎無(wú)活動(dòng)，完全缺乏對(duì)外界刺激的反應(yīng)為5分）;抓取反抗程度（反抗明顯為1分;反抗一般為2分;輕微反抗為3分;反抗極少為4分;基本無(wú)反抗為5分）;呼吸情況（呼吸平穩(wěn)為1分;呼吸稍急促為2分;呼吸較急促為3分;呼吸明顯急促為4分;呼吸極度急促，點(diǎn)頭樣淺表呼吸為5分）。評(píng)分越高代表小鼠的一般狀況越差。

2.2.2" 小鼠體質(zhì)量監(jiān)測(cè)" 于第1天造模開(kāi)始前及第28天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定各組小鼠當(dāng)日的體質(zhì)量。

2.2.3" 糖水偏好實(shí)驗(yàn)" 參照前期研究[2]，各組小鼠在正式實(shí)驗(yàn)前禁水24 h以提高其對(duì)糖水的渴望度。測(cè)試于第1天造模開(kāi)始前和第28天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別在同一時(shí)間（12：00）進(jìn)行。每只小鼠被放入獨(dú)立籠中，同時(shí)提供50 mL純水和50 mL的1%蔗糖水，并記錄2 h內(nèi)糖水和純水消耗量。糖水偏好指數(shù)計(jì)算公式：糖水偏好指數(shù)=（糖水消耗量/總液體消耗量）×100%，該指數(shù)用于評(píng)估小鼠的抑郁狀態(tài)[2]。

2.2.4" 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)" 實(shí)驗(yàn)前24 h進(jìn)行15 min的游泳訓(xùn)練，以幫助小鼠適應(yīng)水環(huán)境。在第1天造模開(kāi)始前和第28天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，同一時(shí)間（15：00），在直徑為18 cm、高度為20 cm的透明玻璃杯中加入水，水深調(diào)整為10 cm（即玻璃杯的半高度），水溫控制在23～25 ℃。將小鼠放入水中游泳6 min，記錄最后4 min內(nèi)小鼠的游泳不動(dòng)時(shí)間。游泳不動(dòng)時(shí)間較長(zhǎng)為抑郁樣行為的標(biāo)志，表明動(dòng)物的“絕望行為”增加[9]。

2.2.5" 肺功能檢測(cè)" 第28天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取5只小鼠，麻醉后行氣管插管，采用小動(dòng)物肺功能儀測(cè)量各組小鼠用力肺活量（forced vital capacity， FVC）、呼氣峰流量（peak expiratory flow， PEF）及肺阻力（lung resistance， RL），以評(píng)估造模和不同處理對(duì)小鼠肺功能的影響。

2.2.6" ACTH及IL-6測(cè)定" 每組剩下的5只小鼠麻醉后摘眼球取血，離心機(jī)4 ℃、3 000 r·min-1，離心15 min（離心半徑8 cm）后提取血清，對(duì)血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，用標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便后續(xù)定量分析。血清樣品平衡至室溫后按要求稀釋?zhuān)謩e加入酶標(biāo)板中，與標(biāo)準(zhǔn)品一起進(jìn)行檢測(cè)。加入特異性抗體后，樣品孵育并洗滌，去除未結(jié)合物。加入酶標(biāo)二抗和TMB顯色劑，通過(guò)酶促反應(yīng)顯色后，用終止液停止反應(yīng)，并用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下讀取各孔的吸光度。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣品中ACTH及IL-6的濃度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.2.7" 肺組織病理學(xué)觀察" 在第28天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠肺組織固定于4%多聚甲醛溶液中24 h，隨后經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明和石蠟包埋。將包埋的組織切片（厚度約為4 μm）進(jìn)行常規(guī)HE和Masson染色處理。具體步驟為：脫蠟、蘇木素染色、分化、返藍(lán)、伊紅染色或磷鎢酸-磷鉬酸處理和苯胺藍(lán)染色、脫水、透明和封片。染色后在顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織的結(jié)構(gòu)變化，并拍照記錄，用于評(píng)估不同處理對(duì)肺組織病理結(jié)構(gòu)的影響。

2.3" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布用“x±s”描述。各組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），如方差齊則進(jìn)一步采用LSD法或Dunnett T3法進(jìn)行多重比較，如方差不齊則采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)。Plt;0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1" 各組小鼠一般狀況評(píng)估

第1天造模開(kāi)始前，各組小鼠的一般狀態(tài)無(wú)差異，皮毛光亮順滑，活動(dòng)靈巧，抓取反抗明顯，呼吸平穩(wěn)，一般狀況評(píng)分比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。第28天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，空白組與第1天造模開(kāi)始前的一般狀態(tài)無(wú)差異。哮喘組小鼠皮毛缺少光澤，活動(dòng)反應(yīng)緩慢，抓取反抗一般，呼吸明顯急促伴有哮鳴音，與空白組比較一般狀況評(píng)分顯著升高（Plt;0.01）。哮喘肝郁組皮毛枯槁無(wú)光澤，精神萎靡，喜扎堆不動(dòng)，抓取無(wú)反抗，點(diǎn)頭樣淺表呼吸，與空白組比較一般狀況評(píng)分顯著升高（Plt;0.01）;與哮喘組比較一般狀況評(píng)分有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。與哮喘肝郁組比較，布地奈德組及柴樸湯組小鼠一般狀況均顯著改善，一般狀況評(píng)分均降低（Plt;0.01）。與布地奈德組比較，柴樸湯組一般狀況評(píng)分有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。詳見(jiàn)表1。

3.2" 各組小鼠體質(zhì)量比較

第1天造模開(kāi)始前，各組小鼠的體質(zhì)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。第28天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，與空白組比較，哮喘組體質(zhì)量稍有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。與空白組及哮喘組比較，哮喘肝郁組體質(zhì)量明顯下降（Plt;0.01）。與哮喘肝郁組比較，布地奈德組、柴樸湯組體質(zhì)量顯著增加（Plt;0.01）。與布地奈德組比較，柴樸湯組體質(zhì)量增加（Plt;0.05）。詳見(jiàn)表2。

3.3" 各組小鼠糖水偏好指數(shù)比較

第1天造模開(kāi)始前，各組小鼠的糖水偏好指數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。第28天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，與空白組比較，哮喘組糖水偏好指數(shù)稍下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。與空白組及哮喘組比較，哮喘肝郁組糖水偏好指數(shù)明顯下降（Plt;0.01）。與哮喘肝郁組比較，柴樸湯組糖水偏好指數(shù)明顯增加（Plt;0.01）。與布地奈德組比較，柴樸湯組糖水偏好指數(shù)增加（Plt;0.05）。詳見(jiàn)表3。

3.4" 各組小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間比較

第1天造模開(kāi)始前，各組小鼠的游泳不動(dòng)時(shí)間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。第28天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，與空白組比較，哮喘組游泳不動(dòng)時(shí)間稍增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。與空白組及哮喘組比較，哮喘肝郁組游泳不動(dòng)時(shí)間明顯增加（Plt;0.01）。與哮喘肝郁組比較，布地奈德組及柴樸湯組游泳不動(dòng)時(shí)間均明顯降低（Plt;0.01）。與布地奈德組比較，柴樸湯組游泳不動(dòng)時(shí)間降低（Plt;0.05）。詳見(jiàn)表4。

3.5" 各組小鼠肺功能指標(biāo)比較

與空白組比較，哮喘組與哮喘肝郁組小鼠FVC及PEF顯著下降（Plt;0.01），RL顯著升高（Plt;0.01）;與哮喘組比較，哮喘肝郁組FVC及PEF顯著下降（Plt;0.01）;與哮喘肝郁組比較，布地奈德組及柴樸湯組FVC及PEF明顯增加（Plt;0.01），RL明顯下降（Plt;0.01）。詳見(jiàn)表5。

3.6" 各組小鼠血清ACTH、IL-6比較

與空白組比較，哮喘組和哮喘肝郁組ACTH及IL-6均顯著升高（Plt;0.01）;與哮喘組比較，哮喘肝郁組ACTH及IL-6均顯著升高（Plt;0.01）;與哮喘肝郁組比較，布地奈德組IL-6明顯下降（Plt;0.01），柴樸湯組ACTH及IL-6均明顯下降（Plt;0.01）。詳見(jiàn)表6。

3.7" 各組小鼠病理學(xué)觀察結(jié)果

小鼠HE染色結(jié)果顯示：空白組小鼠肺組織中肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔較薄，肺組織形態(tài)正常，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，組織結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)明顯病理性改變;哮喘組小鼠肺組織可見(jiàn)明顯的氣道壁增厚、平滑肌層增生，伴隨大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔縮小，部分區(qū)域出現(xiàn)炎性浸潤(rùn)和黏液堆積;與哮喘組相比，哮喘肝郁組的氣道壁增厚更加明顯，平滑肌層顯著增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更加嚴(yán)重，伴有明顯的黏液堆積，肺組織結(jié)構(gòu)受損，表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的病理改變;布地奈德組小鼠氣道壁增厚和平滑肌增生有所減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺泡結(jié)構(gòu)較為完整，病理性損傷較哮喘組和哮喘肝郁組有所改善;與布地奈德組比較，柴樸湯組氣道壁和平滑肌層增生明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。詳見(jiàn)圖1。

小鼠Masson染色結(jié)果顯示：空白組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整，氣道壁薄，肺泡間隔無(wú)明顯膠原纖維沉積，組織結(jié)構(gòu)正常;哮喘組小鼠肺組織中氣道壁增厚，周?chē)休^明顯的膠原纖維沉積，表現(xiàn)為藍(lán)色染色加深，尤其是在氣道周?chē)推交?，肺組織出現(xiàn)纖維化特征，提示氣道重塑和纖維化;與哮喘組相比，哮喘肝郁組的氣道壁增厚更顯著，平滑肌增生更加嚴(yán)重，氣道周?chē)哪z原纖維沉積顯著增加，藍(lán)色染色區(qū)域擴(kuò)展，纖維化程度加重，顯示出更明顯的病理改變;與哮喘肝郁組相比，布地奈德組氣道壁厚度有所降低，膠原纖維沉積減少，氣道平滑肌增生有所緩解，藍(lán)色染色區(qū)域縮小，纖維化程度得到一定改善;與布地奈德組相比，柴樸湯組的肺組織結(jié)構(gòu)進(jìn)一步改善，氣道壁厚度顯著降低，膠原纖維沉積顯著減少，藍(lán)色染色區(qū)域較少。詳見(jiàn)圖2。

4 討論

哮喘是一個(gè)全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問(wèn)題，其患病率逐年上升，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[10]。隨著現(xiàn)代社會(huì)生活節(jié)奏的加快和工作壓力的增加，情志因素在哮喘發(fā)病中的作用逐漸受到關(guān)注。研究表明，心理壓力可通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的變化，影響哮喘的發(fā)展并加重哮喘癥狀[11-12]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝主疏泄，調(diào)暢情志，性喜條達(dá)而惡抑郁。肝失條達(dá)，疏泄失司，則氣機(jī)郁滯，津液輸布不利，凝聚成痰，使肺氣宣降失司，肺氣上逆，發(fā)為哮喘。臨床上哮喘患者經(jīng)中醫(yī)辨證為肝郁證的比例較高，如一項(xiàng)對(duì)305例哮喘急性發(fā)作患者的研究中，辨證為肝郁證的患者占68.2%[13]。在另一項(xiàng)對(duì)110例哮喘患兒的研究中，肝郁證患兒的比例達(dá)33.64%[14]。然而，目前尚無(wú)公認(rèn)的哮喘肝郁證動(dòng)物模型制備方案，且缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的造模評(píng)價(jià)指標(biāo)，限制了對(duì)該病證結(jié)合機(jī)制的深入研究。

國(guó)內(nèi)外研究中常使用小鼠、大鼠和豚鼠來(lái)建立哮喘模型，其中小鼠，尤其是C57BL/6小鼠，由于其免疫遺傳背景清楚、品系單純、對(duì)致敏因子敏感，被廣泛應(yīng)用于哮喘研究[15]。此外，C57BL/6小鼠對(duì)CUMS反應(yīng)敏感[16]，是肝郁證模型研究的首選品系。肝郁證以情志抑郁為主要表現(xiàn)，臨床上常以女性為主。既往研究顯示，雌性小鼠更容易出現(xiàn)抑郁樣的負(fù)面情緒，對(duì)慢性應(yīng)激比雄性小鼠更敏感[17]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇C57BL/6雌性小鼠作為研究對(duì)象。在既往研究中，哮喘動(dòng)物模型通常通過(guò)卵清蛋白與氫氧化鋁聯(lián)合使用進(jìn)行致敏，但這種方法與臨床哮喘發(fā)病的實(shí)際情況并不一致。HDM是哮喘患者中最常見(jiàn)的過(guò)敏原之一，約85%的患者對(duì)其過(guò)敏[18-19]。因此，在哮喘動(dòng)物造模中使用HDM能夠更好地模擬臨床哮喘的過(guò)敏性反應(yīng)。在哮喘模型基礎(chǔ)上，為更好地模擬肝郁證狀態(tài)，通常采用慢性束縛法[20]或CUMS法[2-3]進(jìn)行肝郁證造模。肝郁證多因情志抑郁，所思不遂而引起，在制作肝郁證動(dòng)物模型時(shí)，采用慢性束縛限制動(dòng)物活動(dòng)是有效的造模手段[21]。但是，連續(xù)使用單一的慢性束縛方法會(huì)導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生耐受性[20]。相比之下，CUMS方法更為合適，因?yàn)槠鋺?yīng)激因子強(qiáng)度較低，能夠長(zhǎng)期應(yīng)用，更加符合肝郁證的發(fā)病機(jī)制[22]。本研究通過(guò)聯(lián)合使用HDM滴鼻和CUMS構(gòu)建哮喘肝郁證病證結(jié)合的小鼠模型，成功模擬了哮喘肝郁證的病理狀態(tài)。哮喘組表現(xiàn)出皮毛無(wú)光澤、活動(dòng)減弱和呼吸急促等典型哮喘癥狀，而哮喘肝郁組小鼠表現(xiàn)出更為明顯的情緒抑郁、活動(dòng)減少等肝郁癥狀。與空白組和哮喘組相比，哮喘肝郁組小鼠一般狀況評(píng)分顯著增加，說(shuō)明本研究所采用的造模方法可以有效模擬哮喘肝郁證的病理特征，為后續(xù)干預(yù)措施的效果評(píng)價(jià)提供了可靠的動(dòng)物模型。

柴樸湯是本課題組長(zhǎng)期研究用于治療哮喘的中藥復(fù)方，由小柴胡湯（出自《傷寒論·辨太陽(yáng)病脈證并治》）和半夏厚樸湯（出自《金匱要略·婦人雜病脈證并治第二十二》）組成，其功效為疏肝行氣解郁、理肺化痰平喘，從中醫(yī)“以方測(cè)證”的角度分析，柴樸湯適用于哮喘肝郁證。本研究結(jié)果表明，與哮喘組比較，哮喘肝郁組一般狀態(tài)、肺功能及肺組織病理形態(tài)更差，體質(zhì)量及糖水偏好指數(shù)均減少，游泳不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，血清ACTH及IL-6均增加。柴樸湯干預(yù)可有效改善構(gòu)建的哮喘肝郁證模型小鼠的一般狀況、體質(zhì)量、糖水偏好指數(shù)、游泳不動(dòng)時(shí)間、肺功能及肺組織病理?yè)p傷，血清ACTH及IL-6明顯下降。且柴樸湯組在改善小鼠體質(zhì)量、糖水偏好指數(shù)及游泳不動(dòng)時(shí)間方面均優(yōu)于布地奈德組。從中醫(yī)證候治療方面反證小鼠哮喘肝郁證動(dòng)物模型構(gòu)建成功。本研究采用HE和Masson染色對(duì)小鼠肺組織進(jìn)行病理學(xué)觀察，結(jié)果顯示，哮喘和哮喘肝郁小鼠的氣道壁增厚、平滑肌層增生，并伴隨大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖維沉積，提示存在顯著的哮喘樣病變。而柴樸湯組小鼠的肺組織結(jié)構(gòu)接近正常，氣道壁和平滑肌層增生顯著減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖維沉積減少，提示柴樸湯對(duì)哮喘肝郁證小鼠的氣道炎癥及氣道重塑具有顯著的改善作用。

綜上所述，本研究構(gòu)建的哮喘肝郁證模型具備“病”“證”特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)小鼠一般狀況的觀察，同時(shí)結(jié)合體質(zhì)量、糖水偏好指數(shù)、游泳不動(dòng)時(shí)間、肺功能指標(biāo)、血清ACTH及IL-6、小鼠肺組織病理形態(tài)，以及以方測(cè)證多方面評(píng)價(jià)哮喘肝郁證模型構(gòu)建成功。但是本研究也存在不足，對(duì)于哮喘肝郁證有代表性的檢測(cè)指標(biāo)僅考慮了文獻(xiàn)報(bào)道相關(guān)的ACTH[23]與IL-6[24]，這兩個(gè)指標(biāo)是否是哮喘肝郁證有別于哮喘其他證型的典型指標(biāo)尚不清楚，仍需要進(jìn)一步研究。基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)等技術(shù)，為研究哮喘肝郁證有別于其他證型的典型指標(biāo)提供了更多手段和方法，希冀通過(guò)繼續(xù)研究不斷優(yōu)化造模方案及評(píng)價(jià)指標(biāo)，構(gòu)建更加符合中西醫(yī)臨床病證特點(diǎn)的哮喘肝郁證動(dòng)物模型。

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（本文編輯" 周" 旦）