摘要：目的" 探討HPV E6/E7 mRNA對(duì)HPV16/18 DNA陽(yáng)性患者的分流價(jià)值。方法" 收集127例HPV16/18 DNA陽(yáng)性的核酸樣本，行HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)，并結(jié)合宮頸液基細(xì)胞學(xué)（TCT）結(jié)果和病理診斷結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果" ①HPV E6/E7 mRNA檢出型別以單一感染為主，占比81.93%。年齡分布顯示呈雙峰狀。②HPV E6/E7 mRNA總陽(yáng)性率為65.35%，且隨著宮頸病變程度升高，HPV E6 /E7 mRNA陽(yáng)性率升高。且LSIL組與炎癥組，HSIL+組與炎癥組陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。③對(duì)HPV 16/18 DNA陽(yáng)性者，用細(xì)胞學(xué)進(jìn)一步分流，可以減少65.35%的陰道鏡檢查，漏診44.83%的HSIL+；采用HPV E6/E7 mRNA進(jìn)行分流，可以減少34.65%的陰道鏡檢查，漏診10.34%的HSIL+；HPV E6/E7 mRNA分流漏診率低于TCT分流方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。④HPV16/18 DNA陽(yáng)性且細(xì)胞學(xué)檢查為≥ASC-US的患者，經(jīng)HPV E6/E7 mRNA分流，可減少11.36%的陰道鏡檢查，無(wú)漏診HSIL+。結(jié)論" HPV16/18 DNA陽(yáng)性者進(jìn)一步用TCT聯(lián)合HPV E6/E7 mRNA進(jìn)行同步分流，可以減少陰道鏡檢查，同時(shí)降低≥ASC-US的患者漏診HSIL+的風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：HPV E6/E7 mRNA；HPV；TCT；高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變

中圖分類號(hào)：R737.33" " " " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.18.010

文章編號(hào)：1006-1959（2024）18-0057-08

Abstract：Objective" To investigate the value of HPV E6/E7 mRNA in the shunt of HPV16/18 DNA positive patients.Methods" A total of 127 cases of HPV16/18 DNA positive nucleic acid samples were collected， and HPV E6/E7 mRNA was detected. The results were statistically analyzed in combination with the results of thinprepcytologic test （TCT） and pathological diagnosis.Results" ①The HPV E6/E7 mRNA was detected by mainly single infection， accounting for 81.93%. The age distribution showed a bimodal shape. ②The total positive rate of HPV E6/E7 mRNA was 65.35%. With the increase of cervical lesions， the positive rate of HPV E6/E7 mRNA increased， while the positive rate of LSIL group and inflammation group， HSIL+ group and inflammation group was statistically significant （Plt;0.05）. ③As the HPV 16/18 DNA positivity triage test， Cytology at the ASC-US+ threshold could reduce colposcopy by 65.35%， but missed diagnosis of HSIL+ by 44.83%; whereas HPVE6 /E7 mRNA could reduce the colposcopy by 34.65% ，and missed diagnosis of HSIL+ by 10.34%. As a triage test in HPV 16/18 DNA positivity patients， the missed diagnosis rate of HPV E6/E7 mRNA was lower than that of TCT （P＜0.05）. ④As a triage test， in patients with HPV16/18 DNA positive and cytological grades ≥ASC-US， E6/E7 mRNA could reduce the colposcopy by 11.36% and none missed diagnosis of HSIL+. Conclusion" TCT combined with HPV E6/E7 mRNA for synchronous shunt in HPV16/18 DNA positive patients can reduce colposcopy and the risk of missed diagnosis of HSIL+ in patients with ≥ASC-US.

Key words：HPV E6/E7 mRNA;HPV;TCT;High-grade squamous intraepithelial lesion

宮頸癌（cervical cancer）是女性常見的生殖道惡性腫瘤，2020年WHO頒布了《加速消除宮頸癌全球戰(zhàn)略》，指出到2030年實(shí)現(xiàn)70%的女性在35歲和45歲之前進(jìn)行高效宮頸癌篩查。2022年我國(guó)發(fā)布《宮頸癌篩查工作方案》，提出應(yīng)創(chuàng)新宮頸癌篩查模式，提高篩查質(zhì)量和效率，2025年底應(yīng)實(shí)現(xiàn)宮頸癌篩查早診率達(dá)到90%以上。近年來(lái)多項(xiàng)指南均推薦HPV檢測(cè)作為初篩方法，HPV16/18陽(yáng)性者轉(zhuǎn)診陰道鏡，HPV其他高危型陽(yáng)性進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分流[1-3]。但HPV DNA檢測(cè)無(wú)法區(qū)分病毒的持續(xù)感染或一過(guò)性感染，易導(dǎo)致陰道鏡過(guò)度轉(zhuǎn)診[4，5]；而宮頸液基細(xì)胞學(xué)（TCT）檢測(cè)則存在診斷質(zhì)量差異，漏診率較高的問(wèn)題[5，6]。研究發(fā)現(xiàn)[7-9]，HPV E6/E7 mRNA過(guò)表達(dá)是宮頸癌前病變的重要原因，檢測(cè)HPV E6/E7 mRNA可以提高宮頸癌篩查特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。本研究對(duì)收集的HPV16/18 DNA陽(yáng)性病例進(jìn)行HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果同TCT及病理診斷結(jié)果進(jìn)行分析，探討HPV E6/E7 mRNA對(duì)HPV16/18 DNA陽(yáng)性患者的分流價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料" 收集廣東省婦幼保健院127例HPV16/18 DNA陽(yáng)性的核酸樣本，其中單一HPV16型感染72例，單一HPV18型感染20例，HPV16+18型雙重感染7例，HPV16+18型+HPV其他型別多重感染1例，HPV16型+HPV其他型多重感染19例，HPV18型+HPV其他型多重感染8例。患者年齡23～65歲，平均年齡（41.07±12.36）歲。病理診斷為炎癥者62例，低度鱗狀上皮內(nèi)瘤變（LSIL）者36例，高度鱗狀上皮內(nèi)瘤變（HSIL）者26例，宮頸惡性腫瘤3例；TCT結(jié)果為未見上皮內(nèi)病變細(xì)胞和惡性細(xì)胞（NILM）者83例，無(wú)明確診斷意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASC-US）者18例，LSIL者12例，不能排除高度鱗狀上皮內(nèi)病變的非典型鱗狀細(xì)胞（ASC-H）者3例，HSIL者11例。納入標(biāo)準(zhǔn)：同時(shí)具有HPV DNA檢測(cè)結(jié)果、TCT檢查結(jié)果及病理診斷結(jié)果；核酸樣本-60 ℃以下保存不超過(guò)6個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：酸樣本量不足以進(jìn)行HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)。

1.2方法

1.2.1試劑及設(shè)備" HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)試劑由廣州市寶創(chuàng)生物技術(shù)有限公司研發(fā)，設(shè)備為全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)SLAN-96，由上海宏石醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)。

1.2.2 HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)" 取出各檢測(cè)試劑，平衡至室溫，待完全解凍后充分混勻各組分。取引物探針工作液2 μl、酶混合液4 μl、逆轉(zhuǎn)錄酶混合液1 μl、DEPC水8 μl，充分混勻后按15 μl/孔分裝到PCR管中，加入5 μl核酸樣本，蓋緊PCR管蓋，轉(zhuǎn)移至SLAN-96熒光PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 3 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 10 s、61 ℃ 35 s（收集信號(hào)）、69 ℃ 15 s，48個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s、45 ℃ 20 s、35 ℃ 20 s、25 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；25 ℃逐漸升溫至70 ℃，升溫過(guò)程收集信號(hào)。檢測(cè)完成后，分析HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果。

1.2.3 HPV E6/E7 mRNA分型" HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)試劑采用MPA（Multiplex Probe Amplification）技術(shù)實(shí)現(xiàn)一管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)14種HPV E6/E7 mRNA。MPA技術(shù)核心是由不完全互補(bǔ)的寡核苷酸對(duì)組成，其中一條寡核苷酸（THO）與目的序列完全互補(bǔ)，并標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，另一條寡核苷酸（PCO）與THO部分互補(bǔ)，THO與PCO組合形成特定Tm值的熔解峰，見圖1[9]。當(dāng)樣本為陽(yáng)性時(shí)，THO與目的序列雜交，被Taq酶剪切消耗，與PCO組合形成的熔解峰信號(hào)強(qiáng)度會(huì)減弱。而陰性質(zhì)控?zé)o陽(yáng)性模板，THO不會(huì)被消耗，可以與PCO組合形成較強(qiáng)信號(hào)的熔解峰。通過(guò)在特定Tm值范圍內(nèi)的陰性質(zhì)控熔解峰與樣本熔解峰的信號(hào)值差值來(lái)識(shí)別HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性型別，見圖2。PCO可以設(shè)計(jì)不同的長(zhǎng)度和不同的錯(cuò)配堿基，與THO組合后可在同一個(gè)熒光通道形成5～6種不同Tm值的熔解峰，即一個(gè)熒光通道可實(shí)現(xiàn)5～6種分型，THO又可以標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，3個(gè)熒光通道（FAM./HEX/ROX）即可實(shí)現(xiàn)14種HPV E6/E7 mRNA的分型檢測(cè)，見圖3～圖5。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法" 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用（n）和（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 HPV E6/E7 mRNA檢出率" 本研究檢測(cè)試劑可對(duì)HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68共14種型別的E6/E7 mRNA進(jìn)行分型檢測(cè)，除HPV45、59、66三種型別未檢出外，其他型別均有檢出，其中HPV16型檢出最多，占比74.70%（62/83），其次是HPV18型，占比18.07%（15/83），見圖6。83例HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性樣本中以單一感染為主，占比81.93%（68/83），其次是兩重感染，占比13.25%（11/83），三重感染和四重感染也有檢出，分別占比3.61%（3/83）和1.20%（1/83），見圖7。

2.2不同年齡組HPV E6/E7 mRNA檢出率比較" ＜30歲組、≥50歲組女性HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率均高于30～49歲年齡組女性，即呈現(xiàn)“雙峰”模式，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.3不同病理分級(jí)HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性檢出率比較" HPV E6/E7 mRNA總陽(yáng)性率為65.35%（83/127），隨著宮頸病變程度升高，HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率升高；LSIL組與炎癥組的陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.63，P＜0.05）；HSIL+組與炎癥組的陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.22，P＜0.05）；HSIL+組與LSIL組的陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.29，P＞0.05），見表2。

2.4 HPV16/18 DNA陽(yáng)性者的TCT和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果情況" HPV16/18 DNA陽(yáng)性且TCT檢查為NILM的患者中共39例HPV E6/E7 mRNA陰性，而HPV E6/E7 mRNA陰性者中僅有3例病理結(jié)果為HSIL+。HPV16/18 DNA陽(yáng)性且TCT檢查為ASC-US/LSIL組的患者中共5例HPV E6/E7 mRNA陰性，且5例HPV E6/E7 mRNA陰性病理檢查均為炎癥/LSIL。HPV16/18 DNA陽(yáng)性且TCT檢查為ASC-H/HSIL患者，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)均為陽(yáng)性，見表3。

2.5 HPV16/18 DNA陽(yáng)性患者分流價(jià)值" 采用TCT對(duì)HPV16/18 DNA陽(yáng)性者進(jìn)一步分流，檢查結(jié)果≥ASC-US判斷為陽(yáng)性，則陽(yáng)性率為34.65%，即可以減少65.35%的陰道鏡轉(zhuǎn)診，此時(shí)臨床靈敏度為55.17%，即將會(huì)有44.83%的患者漏診HSIL+。如選擇HPV E6/E7 mRNA對(duì)HPV16/18 DNA陽(yáng)性者進(jìn)行分流，陽(yáng)性率為65.35%，可以減少34.65%的陰道鏡轉(zhuǎn)診，此時(shí)臨床靈敏度為89.66%，漏診率為10.34%。HPV E6/E7 mRNA分流漏診率低于TCT分流方法，同時(shí)其陰道鏡轉(zhuǎn)診可降低率也低于TCT分流方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。HPV16/18 DNA陽(yáng)性患者若同時(shí)采用TCT和HPV E6/E7 mRNA進(jìn)行分流，TCT檢查為NILM組HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率為53.01%，可減少46.99%的陰道鏡轉(zhuǎn)診，此時(shí)臨床靈敏度為76.92%，漏診率為23.08%。當(dāng)TCT檢查為≥ASC-US時(shí)，HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率為88.64%，可減少11.36%的陰道鏡轉(zhuǎn)診，此時(shí)臨床靈敏度為100.00%，無(wú)漏診HSIL+的患者。采用HPV E6/E7 mRNA對(duì)HPV16/18 DNA陽(yáng)性且TCT為NILM組的患者進(jìn)一步分流，陰道鏡轉(zhuǎn)診可降低率高于HPV16/18 陽(yáng)性且TCT≥ASC-US組，但其漏診率也高，見表5。

3討論

高危型HPV持續(xù)感染是引發(fā)宮頸癌的根本原因。研究表明[10]，超過(guò)99%的宮頸癌前病變和宮頸癌是由高危型HPV感染引起的，其中HPV16/18型占70%左右。HPV病毒是雙鏈環(huán)狀DNA病毒，分為3個(gè)功能區(qū)，其E區(qū)編碼的E6、E7蛋白為其主要的致癌蛋白，可與宿主細(xì)胞的抑癌蛋白p53和pRB結(jié)合，使宿主細(xì)胞無(wú)限分裂不凋亡，進(jìn)而引發(fā)癌變。

HPV感染存在自限性，大約67%的HPV感染在1年內(nèi)被機(jī)體清除，超過(guò)90%的感染在2年內(nèi)清除[10]。一過(guò)性感染階段，HPV病毒的DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，處于游離狀態(tài)，不表達(dá)或低表達(dá)E6/E7 mRNA，一般不導(dǎo)致細(xì)胞惡性改變；當(dāng)高危型HPV持續(xù)感染，HPV DNA和人類基因組DNA發(fā)生整合，E6/E7 mRNA大量表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)宿主細(xì)胞惡性改變，直至癌變[11]。有研究顯示[12，13]，與HPV DNA相比，檢測(cè)HPV E6/E7 mRNA可以降低不必要的診療，節(jié)省篩查成本，使患者獲益。2019年美國(guó)陰道鏡和宮頸病理學(xué)會(huì)（ASCCP）發(fā)布的宮頸癌篩查指南中也支持使用更高特異性的檢測(cè)方法，其中包括HPV E6/E7 mRNA[2]。

不同型別HPV致癌風(fēng)險(xiǎn)存在差異，對(duì)HPV進(jìn)行分型檢測(cè)更具診斷價(jià)值。有文獻(xiàn)報(bào)道[11]，HPV16、18、31、33和45中E6/E7癌蛋白的表達(dá)是導(dǎo)致宮頸癌前病變和宮頸癌的主要原因。本研究在127例HPV 16/18 DNA陽(yáng)性的核酸樣本中共檢出HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性83例，其中HPV16型占比74.70%（62/83），HPV18型占比18.07%（15/83），與文獻(xiàn)報(bào)道的陽(yáng)性型別檢出趨勢(shì)一致[14]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性樣本以單一感染為主，占比81.93%（68/83），其次是雙重感染，占比13.25%（11/83），三重感染和四重感染分別占3.61%（3/83）和1.20%（1/83）。目前大多數(shù)文獻(xiàn)并未對(duì)HPV E6/E7 mRNA進(jìn)行分型檢測(cè)[15，16]，本研究的分型檢測(cè)有利于深入探討不同型別HPV E6/E7的致病風(fēng)險(xiǎn)和臨床價(jià)值，但由于本研究中多重感染病例數(shù)較少，故未對(duì)多重感染的意義進(jìn)一步討論。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)宮頸病變由炎癥逐漸升級(jí)為L(zhǎng)SIL、HSIL+時(shí)，HPV E6/E7 mRNA檢出率由48.39%逐漸提高至75.00%、89.66%，即HPV E6/E7 mRNA的陽(yáng)性率隨著宮頸病變加重而升高。2019年一項(xiàng)研究顯示[17]，HPV E6/E7 mRNA在炎癥組、LSIL、HSIL+組的陽(yáng)性率依次為44.52%、69.66%和90.14%，本研究結(jié)果與之相近。且本研究顯示，HPV E6/E7 mRNA與宮頸病變的病理分級(jí)相關(guān)，HPV DNA檢測(cè)僅證實(shí)了病毒的存在，而HPV E6/E7 mRNA則顯示了致癌基因轉(zhuǎn)錄活性的增加，從而增加了該檢測(cè)的預(yù)后價(jià)值，可以更好的評(píng)估宮頸病變風(fēng)險(xiǎn)。

目前指南推薦的宮頸癌篩查方案，對(duì)于初篩HPV16/18 陽(yáng)性者，即使TCT檢查呈陰性，也建議行陰道鏡檢查[1-3]。但這其中包含了部分一過(guò)性的HPV16、18型感染，造成資源浪費(fèi)[11]。有研究發(fā)現(xiàn)[18]，HPV16 DNA陽(yáng)性且TCT陰性的患者發(fā)生HSIL+病變的風(fēng)險(xiǎn)為9.5%，HPV18 DNA陽(yáng)性且TCT陰性的患者發(fā)生HSIL+病變的風(fēng)險(xiǎn)為5.9%。這些研究提示，HPV16/18 DNA陽(yáng)性直接轉(zhuǎn)診陰道鏡，可能會(huì)導(dǎo)致過(guò)度診療，增加患者的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。鑒于此，針對(duì)HPV16/18 DNA陽(yáng)性的患者，有必要進(jìn)一步分流管理。本研究對(duì)HPV16/18型DNA陽(yáng)性患者分別采用TCT和HPV E6/E7 mRNA進(jìn)行分流，結(jié)果顯示TCT分流可以減少65.35%的陰道鏡轉(zhuǎn)診，但同時(shí)會(huì)漏診44.83%的HSIL+；HPV E6/E7 mRNA分流可以減少34.65%的陰道鏡轉(zhuǎn)診，漏診10.34%的HSIL+，提示HPV16/18型DNA陽(yáng)性患者采用TCT或HPV E6/E7 mRNA方法進(jìn)行分流，都可以減少陰道鏡轉(zhuǎn)診，但同時(shí)也都會(huì)存在一定比例的HSIL+漏診。國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)[19]，HPV DNA陽(yáng)性患者采用HPV E6/E7 mRNA分流可以減少63%的陰道鏡轉(zhuǎn)診，漏診率為32%。其結(jié)果與本研究結(jié)果存在差異，可能的原因?yàn)楸狙芯咳虢M的樣本為HPV16/18型DNA陽(yáng)性，未包含HPV其他型陽(yáng)性的樣本。

為進(jìn)一步探討HPV E6/E7 mRNA的診斷分流價(jià)值，本研究同時(shí)采用HPV E6/E7 mRNA和TCT對(duì)HPV16/18 DNA陽(yáng)性者進(jìn)行分流，結(jié)果顯示HPV E6/E7 mRNA對(duì)NILM組分流可以減少46.99%的陰道鏡轉(zhuǎn)診，但漏檢23.08%的HSIL+；HPV E6/E7 mRNA對(duì)≥ASC-US組分流可以減少11.36%的陰道鏡轉(zhuǎn)診，且無(wú)漏檢HSIL+，表明HPV16/18 DNA陽(yáng)性患者同時(shí)采用TCT≥ASC-US和HPV E6/E7 mRNA進(jìn)行分流，既可以減少陰道鏡轉(zhuǎn)診，又降低宮頸HSIL+的漏診率，提升篩查的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。王富偉等[20]也對(duì)HPV16/18 DNA陽(yáng)性患者進(jìn)一步分流，發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA對(duì)ASC-US/LSIL組分流可以減少34.1%的陰道鏡轉(zhuǎn)診，但漏檢14.8%的HSIL+，與本研究結(jié)果略有差異，分析原因可能是不同研究間的TCT檢查靈敏度存在差異。TCT檢測(cè)易受采樣、制片及醫(yī)生診斷水平等因素的干擾，不同研究之間TCT靈敏度存在差異。另有研究發(fā)現(xiàn)[21]，HPV16/18型DNA陽(yáng)性且TCT檢查為NILM的患者，HPV E6/E7 mRNA分流后陽(yáng)性預(yù)測(cè)值由21.62%提升至了40.54%，同樣支持HPV E6/E7 mRNA對(duì)HPV16/18型DNA陽(yáng)性患者的分流價(jià)值。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)方法的特異性高于HPV DNA，可以用于HPV16/18型DNA陽(yáng)性患者的分流，以減少不必要的陰道鏡檢查。HPV16/18 DNA陽(yáng)性者用TCT聯(lián)合HPV E6/E7 mRNA進(jìn)行分流，可以減少陰道鏡檢查，同時(shí)降低≥ASC-US的患者漏診HSIL+的風(fēng)險(xiǎn)。

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收稿日期：2023-09-18；修回日期：2023-09-26

編輯/杜帆

基金項(xiàng)目：廣東省中醫(yī)藥局科研項(xiàng)目（編號(hào)：20221043）

作者簡(jiǎn)介：王意（1979.9-），女，河北保定人，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事宮頸癌及癌前病變的篩查與防治、陰道鏡規(guī)范化檢查與質(zhì)控的研究