摘" 要：為建立北沙參中花椒毒素含量的測(cè)定方法，采用超高效液相色譜，色譜柱為ACQUITY UPLC■ HSS T3 1.8 μm（2.1×100 mm×1.8 μm），流動(dòng)相為50%甲醇乙腈-0.1%磷酸溶液，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm，進(jìn)樣量為1 μL。在該色譜條件下，在2.005～80.217 μg/mL范圍內(nèi)，北沙參中花椒毒素濃度與峰面積線性關(guān)系良好（R=0.999 8）。方法精密度RSD為0.23%、重復(fù)性RSD為0.87%、穩(wěn)定性RSD為0.91%、加樣回收率在97.0%～105.5%（RSD=2.6%）。該方法快速、準(zhǔn)確、便捷，可應(yīng)用于北沙參中花椒毒素含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜；北沙參；花椒毒素；含量測(cè)定；現(xiàn)狀研究

中圖分類號(hào)：R282" " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " " 文章編號(hào)：2096-9902（2024）24-0074-05

Abstract： To establish a method for the determination of Zanthoxytoxin in Glehniae Radix. Ultra-performance liquid chromatography was used. The column was ACQUITY UPLC■ HSS T3 1.8μm （2.1×100 mm×1.8 μm）， the mobile phase was 50% methanol acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution， the flow rate was 0.3 mL/min， the column temperature was 30 ℃， the detection wavelength was 323 nm， and the injection volume was 1μL. Under the chromatographic conditions， there was a good linear relationship between the concentration of Zanthoxytoxin and peak area in the range of 2.005～80.217 μg/mL（R=0.999 8）. The method precision RSD was 0.23%， the repeatability RSD was 0.87%， the stability RSD was 0.91%， and the sample addition recovery was between 97.0%～105.5%（RSD=2.6%）. The method is rapid， accurate and convenient， and thereby can be applied to determine the content of Zanthoxytoxin in Glehniae Radix.

Keywords： ultra-performance liquid chromatography; Glehniae Radix; Zanthoxytoxin; content determination; current research

北沙參（Glehniae Radix）為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.的干燥根。夏、秋二季采挖，除去須根，洗凈，稍晾，置沸水中燙后，除去外皮，干燥，或洗凈直接干燥[1]。2002年，衛(wèi)生部發(fā)布《可用于保健食品的物品名單》，正式將北沙參歸類為藥食同源物品。作為一種滋補(bǔ)養(yǎng)陰的名貴藥材資源，北沙參在我國(guó)藥用、食用歷史悠久，早在漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]已有對(duì)于沙參功效的記載。北沙參中醫(yī)療效良多，有止痛、祛風(fēng)、養(yǎng)肝[3]、養(yǎng)陰清肺和益胃生津的功效[4]，對(duì)肺熱燥咳、虛癆久咳、咽干口渴[5]等癥狀有一定療效。在膳食應(yīng)用方面，民間通常將北沙參用于煲湯、燉煮菜肴、甜湯和涼茶等，是餐桌上深受歡迎的滋補(bǔ)食材。北沙參主要活性成分有香豆素類、有機(jī)酸類、木脂素類[6]等。

花椒毒素屬于呋喃香豆素類化合物，常見(jiàn)于蛇床子、北沙參等藥材中，是一種植物毒素?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，北沙參中花椒毒素等成分具有抗菌[7-8]、抗炎[9]的作用。與此同時(shí)，由于呋喃結(jié)構(gòu)的致癌性[10]，2017年，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單中，花椒毒素（8-甲氧基補(bǔ)骨脂素）伴紫外線A輻射在一類致癌物清單中[11]。

由此可知，北沙參中花椒毒素含量應(yīng)在一定限度內(nèi)才對(duì)人體安全，然而，《中華人民共和國(guó)藥典》目前對(duì)北沙參中花椒毒素的含量檢定并無(wú)要求，并未規(guī)范北沙參中花椒毒素的含量限度。為保障臨床藥用、日常膳食可安全應(yīng)用北沙參藥材，建立可準(zhǔn)確、高效、便捷地測(cè)定北沙參中花椒毒素含量的測(cè)試方法迫在眉睫?，F(xiàn)有研究多使用普通高效液相色譜儀，洗脫梯度普遍時(shí)間較長(zhǎng)，本文采用超高效液相色譜儀，縮短洗脫梯度時(shí)長(zhǎng)，達(dá)到快速高效的檢測(cè)效果。應(yīng)用該檢測(cè)方法，本文初步研究了目前市面流通的北沙參中花椒毒素質(zhì)量的市場(chǎng)現(xiàn)狀。

1" 材料與方法

1.1" 儀器與試劑

Acquity UPLC H-CLASS超高效液相色譜（沃特世），電子天平（XBR36/XSR204，瑞士梅特勒），超純水機(jī)Comfort I（賽多利斯），數(shù)控超聲波清洗器（安譜），花椒毒素對(duì)照品（批號(hào)：112077-202101，中國(guó)食品藥品檢定研究院），甲醇（AR，天津大茂），實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水。

樣品：北沙參藥材及飲片購(gòu)自市場(chǎng)，其中藥材20份，飲片20份，共40份。經(jīng)鑒定均為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.的干燥根。

1.2" 方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.1" 測(cè)定法

1）對(duì)照品溶液?；ń范舅貙?duì)照品儲(chǔ)備溶液：取花椒毒素對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為花椒毒素對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（1.002 71 mg/mL）。

花椒毒素對(duì)照品溶液：精密量取花椒毒素對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.20 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為花椒毒素對(duì)照品溶液（20.054 μg/mL）。

2）供試品溶液。取本品粗粉（過(guò)四號(hào)篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3）色譜條件。液相色譜柱為ACQUITY UPLC■HSS T3 1.8 μm（2.1×100 mm×1.8 μm）。柱溫為30℃。進(jìn)樣體積為1μL。流速為0.3 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為323 nm。流動(dòng)相A為甲醇-乙腈（1∶1）；B為0.1%磷酸溶液。按表1規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫。

4）測(cè)定法。精密量取供試品溶液與花椒毒素對(duì)照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算濃度。

1.2.2" 專屬性

分別取空白溶液（75%甲醇）、對(duì)照品溶液、供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣，比較儀器圖譜的出峰情況。結(jié)果表明，空白溶液圖譜中沒(méi)有出現(xiàn)目標(biāo)峰；對(duì)照品溶液圖譜中有明顯的目標(biāo)峰，且沒(méi)有其他干擾峰；供試品溶液圖譜有明顯目標(biāo)峰，分離度良好，如圖1所示。

1.2.3" 線性和范圍

精密量取花椒毒素對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.02、0.10、0.20、0.30、0.40和0.80 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。

精密吸取上述溶液注入超高效液相色譜儀中，測(cè)定峰面積。以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程為y=11 606x+4 772.9，R=0.999 8，線性范圍為2.005～80.217 μg/mL。

1.2.4" 檢測(cè)限和定量限

取對(duì)照品溶液不斷稀釋，直到S/N=3，信噪比S/N=3時(shí)的相應(yīng)質(zhì)量濃度為檢測(cè)限，得到檢測(cè)限為0.26 μg/mL。取對(duì)照品溶液不斷稀釋，直到S/N=10，信噪比S/N=10時(shí)的相應(yīng)質(zhì)量濃度為定量限，得到定量限為0.85 μg/mL。

1.2.5" 精密度

取對(duì)照品溶液，按色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算保留時(shí)間和峰面積6次結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），保留時(shí)間RSD為0.06%，峰面積RSD為0.23%，精密度良好。

1.2.6" 重復(fù)性

取同一批北沙參樣品，制備6份供試品溶液，按色譜條件依次進(jìn)樣，得出上述6份供試品溶液的實(shí)測(cè)值，計(jì)算其結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），RSD為0.87%，重復(fù)性良好。

1.2.7" 加樣回收率

取同一批北沙參樣品粗粉（過(guò)四號(hào)篩）約2 g，精密稱定9份，置具塞錐形瓶中，每3份為1組，各精密加入花椒毒素對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.20、0.40、0.60 mL，按1.2.1的2）的供試品溶液步驟制備供試品溶液共9份。按色譜條件依次進(jìn)樣，得出上述9份供試品溶液的實(shí)測(cè)值，計(jì)算其加樣回收率及回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。得到加樣回收率在97.0%～105.5%，平均回收率為101.1%，RSD為2.6%（n=9），加樣回收率良好，準(zhǔn)確度較高。

1.2.8" 穩(wěn)定性

分別制備對(duì)照品溶液、供試品溶液于進(jìn)樣小瓶中，在0、6、12、24、36和48 h分別取樣，按色譜條件進(jìn)行分析，分別計(jì)算對(duì)照品溶液、供試品溶液6次峰面積測(cè)量值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），得到RSD為0.91%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

上述方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，本文的測(cè)定方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快捷，可以應(yīng)用于北沙參中花椒毒素的含量測(cè)定。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 樣品測(cè)定

隨機(jī)從市面上現(xiàn)有售賣的北沙參藥材、飲片中各取樣購(gòu)得20份作為待測(cè)樣品，共40份。經(jīng)鑒定全部確認(rèn)為是傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.的干燥根。經(jīng)檢測(cè)，所有樣品水分均低于13%，符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版對(duì)于藥材及飲片檢定通則要求。

按1.2.1對(duì)待測(cè)樣品中花椒毒素含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2" 結(jié)果分析

從表2結(jié)果可以得出，從市面購(gòu)得的40批北沙參中花椒毒素含量在0.000 017 45%～0.012 19%，平均含量為0.005 260%，不同批次間北沙參中花椒毒素含量差異較大。其中20批北沙參藥材中花椒毒素含量在0.001 705%～0.012 19%，平均含量為0.006 511 %；20批北沙參飲片中花椒毒素含量在0.000 017 45%～0.009 807%，平均含量為0.004 010%。北沙參藥材中花椒毒素含量總體比飲片高。

采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)一步比較北沙參藥材與飲片中的花椒毒素含量。結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

從表3可以看出，方差齊性檢驗(yàn)的顯著性P=0.561，大于顯著水平0.05，可以認(rèn)為樣本數(shù)據(jù)間的方差是齊的，單因素方差分析適用于該批樣本數(shù)據(jù)。

從表4可以看出，組間顯著性P=0.013lt;0.05，說(shuō)明藥材與飲片中的花椒毒素含量存在顯著差異性。

3" 討論與結(jié)論

從上述結(jié)果可分析得出：市面在售整體北沙參中花椒毒素含量差異較大；藥材與飲片比較，藥材中的花椒毒素含量與飲片存在顯著差異性，這顯示炮制工藝可能會(huì)對(duì)北沙參中花椒毒素含量有較大影響，推測(cè)是由于不同廠家炮制工藝間的差異，導(dǎo)致炮制后的北沙參飲片，與原藥材中的花椒毒素含量存在比較明顯的差異；藥材中花椒毒素平均含量高于飲片，推測(cè)是炮制工藝會(huì)減少北沙參中花椒毒素的含量。已有資料表明，經(jīng)硫磺熏蒸后北沙參中花椒毒素含量低于未經(jīng)硫磺熏蒸的[12]，不同干燥法對(duì)北沙參中花椒毒素含量有不同程度的影響[13]，據(jù)此可以推測(cè)北沙參藥材經(jīng)過(guò)炮制，其花椒毒素的含量有所減少，且不同炮制工藝對(duì)其影響程度不同，造成飲片與藥材的花椒毒素含量差異較大，且飲片總體含量比藥材低。

追溯源頭可知，正是由于北沙參原藥材種植及飲片炮制加工環(huán)節(jié)缺乏相關(guān)法律法規(guī)監(jiān)管，其質(zhì)量控制手段長(zhǎng)期缺失，導(dǎo)致市面上流通售賣的北沙參藥材及飲片魚龍混雜，質(zhì)量良莠不齊。

2020年，國(guó)家衛(wèi)生健康委等4部門印發(fā)《關(guān)于印發(fā)新冠肺炎出院患者主要功能障礙康復(fù)治療方案的通知》（國(guó)衛(wèi)醫(yī)函〔2020〕207號(hào)），內(nèi)附推薦處方中北沙參就是其中一味中藥。這表明，作為傳統(tǒng)的滋補(bǔ)藥材，北沙參潤(rùn)肺止咳等功效得到了傳統(tǒng)中醫(yī)及現(xiàn)代藥理學(xué)的認(rèn)可，應(yīng)用廣泛，在多種情景下均為人們習(xí)慣所用。另一方面，由于花椒毒素天然含有呋喃結(jié)構(gòu)，具有致癌的潛在風(fēng)險(xiǎn)。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將呋喃歸為“可能對(duì)人類致癌的物質(zhì)”（2B組）[14]。因此，北沙參的使用安全性必須得到重視，建立快捷高效的測(cè)試方法測(cè)定北沙參中花椒毒素含量作為其質(zhì)量控制手段之一，是急需且有意義的。

本文研究結(jié)果表明，應(yīng)用本文的超高效液相色譜法測(cè)定北沙參藥材及飲片中花椒毒素含量的測(cè)試方法，加樣回收率、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性均良好，整體方法準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)單。采用超高效液相色譜儀搭配超高效液相色譜柱，利用其出峰快速的特性，縮短色譜洗脫梯度，從而減少檢測(cè)所需時(shí)長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)高效，適用于檢驗(yàn)檢測(cè)行業(yè)或機(jī)構(gòu)日常檢驗(yàn)檢測(cè)，為北沙參的廣泛應(yīng)用提供高效便捷而準(zhǔn)確的安全保障。同時(shí)，本文的樣本結(jié)果也對(duì)北沙參中花椒毒素含量的限度標(biāo)準(zhǔn)制定提供一定的參考作用，幫助建立北沙參質(zhì)量控制手段及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范中藥產(chǎn)業(yè)北沙參藥材從種植到炮制的一系列環(huán)節(jié)，幫助整頓市面流通的北沙參質(zhì)量參差不一的市場(chǎng)現(xiàn)狀，促進(jìn)北沙參藥材在醫(yī)藥臨床及日常膳食應(yīng)用的發(fā)展。

本文僅初步研究了北沙參花椒毒素含量的市場(chǎng)現(xiàn)狀，下一步可對(duì)藥材與飲片炮制工藝具體步驟開展影響花椒毒素含量的研究。

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基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2023YFC3504200）；廣州市科技局-廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（SL2022B03J01258）

第一作者簡(jiǎn)介：盧敏茹（1994-），女，助理工程師。研究方向?yàn)橹兴幉?、食品質(zhì)量安全分析。

*通信作者：周勁松（1975-），男，博士，高級(jí)工程師。研究方向?yàn)橹兴幖爸苿┓治觥⒅兴幣谥啤?/p>