摘要 ［目的］為解析小麥（Triticum aestivum L.）白葉突變體葉色白化機(jī)制，以白葉突變小麥體和正常小麥為試驗(yàn)材料，從轉(zhuǎn)錄水平方向展開(kāi)研究。［方法］以正常小麥和溫敏白葉突變體小麥為材料，進(jìn)行葉色變化過(guò)程的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，挖掘調(diào)控小麥光合色素形成的調(diào)控機(jī)制。［結(jié)果］參與正常小麥葉片發(fā)育過(guò)程的DGEs數(shù)目是白葉小麥葉色由白轉(zhuǎn)綠過(guò)程的2.57倍，且正常葉片發(fā)育過(guò)程的DGEs主要參與脂類、氨基酸、蛋白質(zhì)、嘌呤、肌醇等生物大分子的代謝，而葉色由白轉(zhuǎn)綠過(guò)程的DGEs主要參與光合作用、呼吸作用和糖代謝等過(guò)程；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，小麥擁有已知植物光合色素代謝途徑中的所有基因，其中的75個(gè)基因?yàn)镈GEs，這些DGEs包含了所有葉綠素合成途徑的基因和2個(gè)類胡蘿卜素合成途徑的基因，這些基因的表達(dá)模式分為7類（Ⅰ-Ⅶ），表達(dá)模式表明小麥葉綠素的生物合成受反饋調(diào)節(jié)，并且葉綠素合成受阻導(dǎo)致試驗(yàn)材料形成白葉，TaCAO可能是葉綠素合成受阻的主要影響因子。［結(jié)論］該研究為進(jìn)一步研究小麥葉綠素形成機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 小麥；白葉性狀；比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)

中圖分類號(hào) Q 75 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）23-0085-09

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.019

Transcriptomic Analysis of White Leaf Traits in Triticum aestivum L. at Regreening Stage

WANG Zhi-long，NAN Wen-zhi，LIU Ting-ting et al

（Life Science College of Yulin University，Yulin，Shaanxi 719000）

Abstract ［Objective］To decipher the mechanism of leaf color albinism in Triticum aestivum L.white-leaf mutants.［Method］This study conducted a comparative transcriptomic analysis of the leaf color change process using normal Triticum aestivumL.and temperature-sensitive white-leaf mutants.The aim was to uncover the regulatory mechanisms governing the formation of photosynthetic pigments in Triticum aestivum L..［Result］The results showed that the number of Differentially Expressed Genes （DGEs） involved in the development of normal Triticum aestivum L.leaves was 2.57 times that in the process of white leaf color turning green.DGEs in the normal leaf development process were mainly involved in the metabolism of lipids，amino acids，proteins，purines，and inositol，among other biomacromolecules.In contrast，DGEs in the process of leaf color turning from white to green were primarily involved in photosynthesis，respiration，and carbohydrate metabolism.Furthermore，it was found that Triticum aestivum L.possesses all the genes in the known plant photosynthetic pigment metabolic pathways，75 of which were DGEs.These DGEs included all genes of the chlorophyll synthesis pathway and two carotenoid synthesis pathway genes.Their expression patterns can be classified into seven categories （I to VII）.These patterns suggest that the biosynthesis of Triticum aestivum L.chlorophyll is subject to feedback regulation，and that impaired chlorophyll synthesis leads to the formation of white leaves，with TaCAO likely being the main factor affecting chlorophyll synthesis.［Conclusion］These findings provide a theoretical basis for further research into the chlorophyll formation mechanism in Triticum aestivum L..

Key words Triticum aestivum L.;White-leaf trait;Comparative transcriptomics

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32160462）;榆林學(xué)院研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2022YLYCX08）。

作者簡(jiǎn)介 王志龍（1998—），男，陜西榆林人，碩士研究生，研究方向：作物遺傳育種。*通信作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事旱區(qū)農(nóng)作物節(jié)水技術(shù)研究。

收稿日期 2024-01-11；修回日期 2024-02-26

葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，在葉片中葉綠素是最重要的光合色素之一，類胡蘿卜素是輔助光合色素，葉綠素和類胡蘿卜素在植物的生物過(guò)程中有著重要的作用［1-2］。調(diào)控葉綠素和類胡蘿卜素的基因發(fā)生變化往往會(huì)導(dǎo)致植物葉色的異常［3-4］。目前，植物合成葉綠素和類胡蘿卜素的一般通路已較為明晰［5］，在擬南芥中，已發(fā)現(xiàn)有15種酶和27個(gè)基因參與葉綠素的生物合成調(diào)控途徑［6］。從細(xì)菌、真菌、藻類和植物等生物中分離出150余個(gè)調(diào)控類胡蘿卜素形成的基因，它們編碼類胡蘿卜素合成途徑中的20余種酶［7］。這些基因變異均都可能導(dǎo)致葉綠素和葉黃素含量發(fā)生變化［8-9］。葉色突變材料是研究光合色素生物合成、葉綠體發(fā)育以及開(kāi)發(fā)基因遺傳轉(zhuǎn)化標(biāo)記性狀的理想材料［10］。

高通量測(cè)序具有測(cè)序成本低、時(shí)間短的特點(diǎn)［11］。這種技術(shù)可同時(shí)對(duì)數(shù)百萬(wàn)條序列進(jìn)行測(cè)序，不僅豐富物種的遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)，在功能基因的篩選和鑒定中也可以發(fā)揮作用。該技術(shù)促進(jìn)了植物葉色研究領(lǐng)域發(fā)展，通過(guò)de novo轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)生物種的遺傳信息和預(yù)測(cè)可能的非編碼 RNA。目前，多種葉色變異植物已被測(cè)序分析，如已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多由CHI生物合成途徑突變而引起葉色變化的高等植物，如病毒誘導(dǎo)的CHLI（鎂螯合酶I亞基）基因沉默降低了葉綠素含量并改變了葉綠體功能，導(dǎo)致豌豆中的葉綠體結(jié)構(gòu)異常［12］，在銀杏中下調(diào)的HEMA會(huì)導(dǎo)致葉綠素積累減少［13］。然而，在小麥葉色突變體中僅報(bào)道了少數(shù)編碼Mg-螯合酶D、H和I亞基的CHRD、CHLH和CHLI基因［14］。小麥中葉綠素生物合成的調(diào)控機(jī)制還有待繼續(xù)深入研究。筆者選用白葉突變小麥葉色變化前后的葉片，以及同一時(shí)期葉色正常的小麥葉片，構(gòu)建4個(gè)RNA文庫(kù)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析葉色變化過(guò)程中葉片基因表達(dá)譜，挖掘調(diào)控小麥葉色變白的分子機(jī)制，以期為進(jìn)一步研究小麥葉色變異的分子調(diào)控機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和生長(zhǎng)條件

試驗(yàn)材料于2020年10月4日種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)楊凌試驗(yàn)站（34.16°N，108.05°E）。白葉小麥在正常溫度時(shí)葉色為綠色，越冬時(shí)，低溫誘導(dǎo)葉色變白，返青期葉色逐漸變綠。正常葉色小麥和白葉小麥分2組種植，每組3次重復(fù)，每次重復(fù)取10片葉子作為轉(zhuǎn)錄組混池。第1天，分別取白葉小麥的白色葉片及正常小麥的綠色葉片構(gòu)建6個(gè)轉(zhuǎn)錄組混池；第5天，分別取白葉小麥變綠后的葉片，以及正常小麥的葉片構(gòu)建6個(gè)轉(zhuǎn)錄組混池；共12個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)。第1次取樣，白葉小麥的白色葉片轉(zhuǎn)錄組混池記為WL，正常葉色小麥葉片的轉(zhuǎn)錄組混池記為GL。5 d后取樣，白葉小麥轉(zhuǎn)綠葉片的轉(zhuǎn)錄組混池記為HWL，正常葉色小麥葉片的轉(zhuǎn)錄組混池記為RGL。

1.2 RNA提取和Rna-Seq數(shù)據(jù)處理

利用Trizol試劑盒提取 RNA，Nanodrop 2000 對(duì) RNA 的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA 完整性，IN 值檢測(cè)方法為 Agilent 2100 Nano，檢測(cè)合格后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和 Illumina 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序由百邁克生物科技有限公司完成。測(cè)序獲得的原始序列 （Raw reads）去除接頭（Adaptor）、含有 N（N 表示無(wú)法確定堿基信息）的比例大于 5%和低質(zhì)量（質(zhì)量值Q≤10 的堿基數(shù)占整個(gè) read 的 20%以上）的數(shù)據(jù)后，得到凈序列數(shù)（Clean reads）。利用Clean reads進(jìn)行有參轉(zhuǎn)錄組分析，使用 HISAT2v2.0.5 將配對(duì)末端凈序列數(shù)與小麥的參照基因組進(jìn)行比對(duì)［15］。參考基因組為Triticum_aestivum.TGACv1.genome.fa。

1.3 差異表達(dá)基因、GO富集和通路分析

基因表達(dá)水平和差異基因富集分析通過(guò)featureCounts［16］計(jì)算匹配到每個(gè)基因的數(shù)據(jù)，并結(jié)合該基因的長(zhǎng)度計(jì)算每個(gè)基因的 FPKM （reads per kilobases per million reads）值。利用 DESeq2 軟件［17］對(duì)白葉小麥和正常小麥的基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，獲得差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）。使用clusterProfiler［18］軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因的 GO 和 KEGG 富集分析。

1.4 小麥光合色素相關(guān)基因的分離

利用BLAST 2.2.28+ （ ftp：//ftp.ncbi.nih.gov/blast/executables/LATEST/）軟件，通過(guò)其他植物中已知的調(diào)控光合色素合成的基因檢索小麥基因組和轉(zhuǎn)錄組中的小麥同源基因。將檢索得到的50分以上且匹配序列長(zhǎng)度大于120 bp的序列保留備用，進(jìn)一步利用CDD （ https：/ / www.ncbi.nlm.nih.gov / cdd / ） 數(shù)據(jù)庫(kù)分析它們的保守結(jié)構(gòu)域。利用 MEGA 11 軟件進(jìn)行小麥中葉綠素調(diào)控基因的多序列比對(duì)和進(jìn)化分析，采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)， bootstrap為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常葉片和白葉突變體葉片發(fā)育的Rna-Seq分析

利用正常葉色小麥和白葉小麥的葉片構(gòu)建了12個(gè)mRNA文庫(kù)并測(cè)序，獲得了50 634 256～ 62 110 976條原始序列（表1）。去除接頭和低質(zhì)量的序列后得到50 096 610～61 562 006條高質(zhì)量序列，并且94.25%～95.40%的序列可以比對(duì)到基因組，表明測(cè)序質(zhì)量和參考基因組滿足高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組的分析要求。

2.2 小麥葉片發(fā)育的差異表達(dá)基因

為了挖掘與小麥葉色變白相關(guān)的代謝機(jī)制，進(jìn)行了樣本間的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。結(jié)果表明，WL和HWL之間共有6 298個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)量上調(diào)的基因有3 654個(gè)，表達(dá)量下降的基因有2 644個(gè)。GL和RGL之間共有16 192差異表達(dá)基因，其中表達(dá)量上調(diào)的基因有8 973個(gè)，表達(dá)量下降的基因有7 219個(gè)。白葉小麥樣本間的顯著性差異基因極大減少，可能是由于光合作用顯著降低，導(dǎo)致光合產(chǎn)物生物合成及其一系列相關(guān)的代謝在樣本間受到抑制，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的生命活動(dòng)。白葉小麥WL vs HWL和正常葉色小麥GL vs RGL間的共同表達(dá)基因?yàn)? 489個(gè)，數(shù)量顯著少于2個(gè)材料間特異表達(dá)的基因，表明小麥葉色變白后顯著影響了基因的表達(dá)，致使細(xì)胞生命活動(dòng)發(fā)生了顯著變化（圖1）。

2.3 GO、KEGG富集和通路分析

分別對(duì)GL vs RGL顯著性差異表達(dá)的基因以及WL vs HWL顯著性差異表達(dá)的基因分別進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果表明，正常葉色小麥和白葉小麥的基因主要在細(xì)胞組分和分子功能有差異，其中正常葉色小麥顯著差異基因特異參與核（nucleoid）、細(xì)胞連接（cell junction）、共質(zhì)體（symplast）、超分子復(fù)合體（supramolecular complex）等細(xì)胞組分，白葉小麥顯著性差異基因特異參與分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性（molecular transducer activity）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性（signal transducer activity）分子功能（圖2、圖3）。為了進(jìn)一步挖掘調(diào)控小麥葉色變白相關(guān)基因參與的代謝通路，筆者將GL和RGL之間的顯著差異表達(dá)基因及WL和HWL之間的

顯著差異表達(dá)基因分別進(jìn)行 KEGG 注釋和富集分析（表2、表3）。結(jié)果表明，正常葉色小麥的差異表達(dá)基因主要參與糖類、脂類、氨基酸、蛋白質(zhì)等初生代謝產(chǎn)物以及黃酮、類黃酮和光合色素等次生代謝產(chǎn)物的代謝過(guò)程，并且上述多種生物大分子的合成代謝都顯著富集；白葉小麥由于光合同化作用受影響，初生物質(zhì)代謝和次生物質(zhì)代謝相對(duì)較少，并且光合作用、氧化磷酸化、淀粉和蔗糖代謝等顯著富集。

2.4 小麥光合色素生物合成基因的特征

為了挖掘小麥中參與光合色素代謝相關(guān)的調(diào)控基因，利用植物中已知的36個(gè)光合色素合成途徑的調(diào)控基因，通過(guò)TBLASTN（le-10）檢索小麥轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，共發(fā)現(xiàn)135個(gè)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，且每個(gè)已知的調(diào)控基因均能在小麥中找到轉(zhuǎn)錄本（表4）。篩選上述135個(gè)光合色素合成途徑的轉(zhuǎn)錄本在GL vs RGL以及WL vs HWL中的顯著差異表達(dá)基因（P<0.01），共發(fā)現(xiàn)75個(gè)顯著差異表達(dá)基因。其中，與葉綠素相關(guān)的差異表達(dá)基因有56個(gè)，與葉黃素相關(guān)的差異表達(dá)基因有19個(gè)。通過(guò)對(duì)75個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行熱圖分析，筆者將它們的表達(dá)模式大致分為7類（Ⅰ～Ⅶ）。參與葉綠素代謝的差異基因中，除第 Ⅰ 類外，其余Ⅱ～Ⅳ類中所有的基因在WL中的表達(dá)均高于GL中，Ⅱ類基因在GL vs RGL中上調(diào)表達(dá)，在WL vs HWL中下調(diào)表達(dá)（圖4）。參與葉黃素代謝相關(guān)的差異基因中，V類基因在WL中的表達(dá)均高于GL，第Ⅶ類基因在白葉小麥和正常小麥中的表達(dá)趨勢(shì)相反（圖5）。

3 結(jié)論與討論

葉綠素（chlorophyll，Chl）是植物葉綠體參與光合作用的重要色素，葉色突變往往都伴隨著葉綠素含量的降低，因此也被人稱為葉綠素缺失突變。HirschBerg等［7］已經(jīng)完成擬南芥葉綠素生物合成過(guò)程中全部27個(gè)基因的鑒定，其任一步驟異常都可能導(dǎo)致葉綠素的合成障礙。目前，在植物中發(fā)現(xiàn)了許多由Chl生物合成途徑突變而引起的葉色變化，如鎂螯合酶亞基Chl H氯氧化蛋白（CHLH）、鎂原卟啉IX螯合酶（CHLD）和鎂原卟啉IX甲基轉(zhuǎn)移酶（CHLM）的表達(dá)受到抑制，可能是缺鋅脅迫下玉米葉片葉綠素含量降低的原因［19］ 。有學(xué)者利用VIGS技術(shù)沉默合成第一步谷氨酸-tRNA合成酶相關(guān)基因得到的突變體材料葉綠素含量明顯下降，植物葉片呈現(xiàn)白化、黃化現(xiàn)象［20］。CAO在Chl a/b比率調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，植物在CAO過(guò)表達(dá)的植物中過(guò)度積累Chl b 。Zhu等［4］研究表明HEMC、HEME、CHLD、CHLM、PORA和CHLG的表達(dá)不同程度降低，可能是導(dǎo)致水稻葉色突變體中Chl a水平降低的主要因素。Zhang等［19-21］研究認(rèn)為，作物中CHLM上調(diào)或者下調(diào)會(huì)引起葉綠素的上調(diào)或者下調(diào)，會(huì)導(dǎo)致作物中葉綠素的上升或者下降。然而，在小麥葉色突變體中僅報(bào)道了少數(shù)編碼Mg-螯合酶D、H和I亞基的CHRD、CHLH和CHLI基因［14，19］。

該研究以正常葉色的小麥和溫敏白葉突變體小麥為材料，進(jìn)行葉色變化過(guò)程的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，挖掘調(diào)控小麥光合色素形成的調(diào)控機(jī)制。DGE分析結(jié)果表明，正常葉色小麥GL vs RGL的DGEs數(shù)目是白葉小麥的葉色由白轉(zhuǎn)綠（WL vs HWL）的2.57倍，表明白葉小麥由于光合色素缺乏，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育延緩，參與調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)的DGEs較正常葉色小麥顯著減少。GL vs RGL的DGEs主要參與脂類、氨基酸、蛋白質(zhì)、嘌呤、肌醇等生物大分子的形成，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育；WL vs HWL的DGEs主要參與光合作用、呼吸作用和糖代謝等過(guò)程，合成代謝能力較正常葉色小麥顯著降低，更傾向于通過(guò)調(diào)節(jié)基礎(chǔ)代謝過(guò)程維持細(xì)胞的生命活動(dòng)。

小麥擁有植物中已知光合色素代謝途徑的所有基因，筆者共發(fā)現(xiàn)75個(gè)小麥光合色素代謝相關(guān)的DGEs，它們的表達(dá)模式可以分為7類（Ⅰ～Ⅶ）。第Ⅰ類和第Ⅶ類中的DGEs主要包含TaCAO、TaZEP，它們?cè)赪L中的表達(dá)豐度最低。TaCAO和TaZEP分別位于葉綠素和胡蘿卜素合成途徑的下游，他們的基因表達(dá)豐度調(diào)控這2種光合色素的形成［20，22］。TaCAO和TaZEP的表達(dá)特征暗示了它們功能的缺失可能是小麥葉色變白的重要影響因素，與此同時(shí)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ類中的DGEs在WL中的表達(dá)均高于GL，表明光合色素的生物合成途徑存在普遍的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，途徑下游基因的功能缺失會(huì)促進(jìn)途徑上游基因的表達(dá)。第Ⅴ類基因中的GGPPs基因在GL vs RGL中上調(diào)表達(dá)，在WL vs HWL中下調(diào)表達(dá)，香葉基二磷酸合酶（geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS）可以催化合成GGPP，用于包括葉綠素、類胡蘿卜素、VE等一系列重要化合物的合成，增強(qiáng)GGPPS表達(dá)可以提升煙草葉片葉綠素及類胡蘿卜素含量［23-24］；第Ⅱ類基因，包含了TaGSA到TaCHLM通路的所有基因，它們的表達(dá)模式與GGPPs相同，表達(dá)模式表明在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，正常葉片葉綠素合成代謝增強(qiáng)；然而在白色葉片中，植物通過(guò)增強(qiáng)葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)葉綠素的形成，當(dāng)白葉反綠后，積累的葉綠素通過(guò)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制抑制上游調(diào)控基因的表達(dá)。75個(gè)DGEs除參與葉綠素合成途徑外，只有GGPPs和TaZEP參與類胡蘿卜素的形成，因此葉綠素合成受阻可能是該試驗(yàn)中白葉性狀形成的主要原因，并且由葉綠素缺乏導(dǎo)致光合同化物合成受阻最終引起類胡蘿卜素合成減少，形成白葉性狀。綜上所示，TaCAO可能是該試驗(yàn)中導(dǎo)致葉綠素合成受阻的主要因子，進(jìn)一步分析 TaCAO的變異與生物學(xué)功能有關(guān)，有助于理解小麥光合色素代謝的調(diào)控機(jī)制。

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