摘要 ［目的］獲得嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，AH）Hcp蛋白的多克隆抗體（Polyclonal Antibody）及基本生物學(xué)特性。［方法］利用RT-PCR方法擴(kuò)增Hcp基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG（異丙基硫代半乳糖苷，Isopropyl β-D-Thiogalactoside）誘導(dǎo)表達(dá)獲得Hcp重組蛋白，純化后免疫家兔，制備針對(duì)該蛋白的多克隆抗體，進(jìn)行抗體的效價(jià)測(cè)定、Western blotting鑒定，利用生物信息學(xué)在線工具對(duì)其基本理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)、二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。［結(jié)果］該蛋白在IPTG 終濃度為 0.6 mmol/L、37 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)6 h可獲得最高表達(dá)量，蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在；Western blotting結(jié)果顯示，AH的培養(yǎng)物上清與沉淀均能夠與制備的兔抗發(fā)生特異性結(jié)合，具有良好的反應(yīng)原性，制備的多克隆抗體效價(jià)達(dá)1.024×106。生物信息學(xué)分析表明，嗜水氣單胞菌Hcp蛋白的分子式為C846H1304N224O259S8，共編碼172個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為19 013.49 u，等電點(diǎn)（PL）為5.24，屬于穩(wěn)定蛋白；二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲占比為 51.74%，延伸鏈占比為25.00%，α-螺旋占比為19.19%，β-轉(zhuǎn)角占比為4.07%。［結(jié)論］成功制備了Hcp蛋白的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究AH的VI 型分泌系統(tǒng)（Type VI secretion system，T6SS）提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 嗜水氣單胞菌；Hcp基因；原核表達(dá)；多克隆抗體制備；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào) S 94 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）23-0079-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.018

Prokaryotic Expression of Hcp Protein of Aeromonas hydrophila，Preparation of Polyclonal Antibody and Bioinformatics Analysis

XU Yi-lan1，XU Jia-le2，LU Bing-xia1 et al

（1.Guangxi Veterinary Research Institute/Key Laboratory of Veterinary Biotechnology of Guangxi，Nanning，Guangxi 530002;2.Animal Science and Technology College，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530005）

Abstract ［Objective］In order to obtain a polyclonal antibody to the Hcp protein of Aeromonas hydrophila （AH） and its basic biological properties.［Method］The present study utilized RT-PCR to amplify the Hcp gene，constructed a recombinant expression plasmid and then transformed the BL21 receptor cells，which were induced to express the Hcp recombinant protein through IPTG （Isopropyl β-D-Thiogalactoside），purified and immunized fc1dca0e9a683cd4688b2a6868e22dd7rabbits，and then prepared a polyclonal antibody against the protein.Hcp recombinant protein was obtained by IPTG （Isopropyl β-D-Thiogalactoside） induced expression，purified and immunized rabbits，and polyclonal antibody against the protein was prepared，and the potency of the antibody was determined，identified by Western blotting，and its basic physicochemical properties，conserved structural domains，and phosphorylation sites were investigated using bioinformatics online tools，secondary and tertiary structure prediction.［Result］The results showed that the highest expression of the protein was obtained at the final concentration of IPTG of 0.6 mmol/L at 37 ℃ for 6 h，and the protein mainly existed in the form of soluble protein; the results of Western blotting showed that the supernatant and precipitate of the culture of AH were able to specifically bind to the prepared rabbit antibody with good reactivity，and the potency of the prepared polyclonal antibody reached 1.024×106.Bioinformatics analysis showed that the molecular formula of Aeromonas hydrophila Hcp protein was C846H1304N224O259S8，encoding a total of 172 amino acids，with a relative molecular mass of 19 013.49 u，an isoelectric point （pl） of 5.24，which is a stabilized protein; the secondary structure of the protein was 51.74% of the irregularly coiled，25.00% of the elongated chain，and 25.00% of the alpha-chain.25.00%，α-helix accounted for 19.19%，and β-turns accounted for 4.07%.［Conclusion］In this study，a polyclonal antibody to Hcp protein was successfully prepared，which can provide technical support for the further study of Type VI secretion system （T6SS） of AH.

Key words Aeromonas hydrophila;Hcp gene;Prokaryotic expression;Preparation of polyclonal antibody;Bioinformatics

基金項(xiàng)目 廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科AB21076008，桂科AB20297059）；玉林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（玉市科20220519）。

作者簡(jiǎn)介 許藝蘭（1996—），女，廣西北流人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，從事動(dòng)物病原學(xué)研究。*通信作者：陳忠偉，正高級(jí)獸醫(yī)師，從事動(dòng)物病毒學(xué)研究；何穎，正高級(jí)獸醫(yī)師，博士，從事獸醫(yī)藥理學(xué)和動(dòng)物傳染病學(xué)研究。

收稿日期 2024-01-15

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，AH）是革蘭氏陰性菌、弧菌科氣單胞菌屬，是一種普遍存在于各種水體、土壤中的條件性病原菌［1］，是構(gòu)成養(yǎng)殖水環(huán)境中正常菌群種類之一，能夠引起魚類、動(dòng)物和人的多種疾?。?］，如可誘發(fā)魚類感染敗血癥［3］，為國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失［4-5］。目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中主要依靠抗生素抑制AH感染［6］，抗生素的濫用不僅會(huì)導(dǎo)致AH產(chǎn)生耐藥性，還對(duì)生態(tài)環(huán)境與食品安全質(zhì)量產(chǎn)生影響［7］，引起食品質(zhì)量安全問(wèn)題和生態(tài)安全問(wèn)題［8］。水產(chǎn)養(yǎng)殖中水生生物易受到AH的侵襲而產(chǎn)生疾病。蝦的個(gè)體較小，逐一進(jìn)行治療不現(xiàn)實(shí)，而蝦群在水體中也難以治療。因此，控制該細(xì)菌在人群和水產(chǎn)養(yǎng)殖中的不斷暴發(fā)具有重要意義［9］。

AH的致病機(jī)制十分復(fù)雜，使宿主的疾病發(fā)生通常依靠分泌系統(tǒng)與毒力因子之間的相互作用。IV型分泌系統(tǒng)（type VI secretion system，T6SS）是AH的分泌系統(tǒng)之一［10］，由13個(gè)蛋白組成，負(fù)責(zé)將部分效應(yīng)蛋白運(yùn)傳遞到細(xì)胞外。溶血素共調(diào)節(jié)蛋白（hemolysin co-regulated protein，Hcp）是T6SS的蛋白質(zhì)成分之一， Hcp蛋白可以形成一個(gè)類似管狀的六聚體，協(xié)助T6SS分泌毒力相關(guān)蛋白［11-12］。Hcp蛋白在T6SS系統(tǒng)中起著重要作用，既是其結(jié)構(gòu)蛋白幫助形成注射裝置分泌蛋白，又是其效應(yīng)蛋白可以分泌到胞外增強(qiáng)毒力［13］。筆者制備兔抗Hcp多克隆抗體，為深入開展Hcp的相關(guān)研究提供研究工具，還通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析其基本理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)等，為后續(xù)致病機(jī)制探究提供理論信息。

1 材料與方法

1.1 菌株及載體 AH-SC-3株、pET-32a（+）載體由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。DH5α、BL21（DE3） 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海昂羽生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xho I、T4 DNA Ligase購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、山羊抗兔IgG（H+L）HRP抗體購(gòu)自康為生物技術(shù)有限公司；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自GenStar公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Hcp基因序列設(shè)計(jì)Hcp基因特異性引物，限制性酶切位點(diǎn)分別為EcoRI和Xho I。Hcp-F：5′—3′：CCGGAATTCATGCCAACTCCATGTTATAT； Hcp-R：5′—3′： CGGCTCGAGTTACGCCTCGATCGGAGCAC。

1.4 Hcp基因的擴(kuò)增

以AH-SC-3的DNA為模板， Hcp-F/R為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按照膠回收試劑盒操作說(shuō)明對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。

1.5 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Hcp的構(gòu)建

對(duì)目的基因Hcp的膠回收產(chǎn)物和pET-32a（+）載體進(jìn)行雙酶切，再次膠回收，按照T4連接酶說(shuō)明書對(duì)2個(gè)片段進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物按照DH5α感受態(tài)細(xì)胞使用說(shuō)明轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。次日將單菌落擴(kuò)繁后按照質(zhì)粒抽提試劑盒操作說(shuō)明提取質(zhì)粒。對(duì)獲得的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定并測(cè)序，命名為pET-32a-Hcp。

1.6 重組Hcp蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化

按照說(shuō)明書將pET-32a-Hcp轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞涂布于含氨芐抗性的LA平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。挑取單菌落于37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)6 h，取部分菌液進(jìn)行PCR鑒定，對(duì)鑒定正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)行增菌培養(yǎng)。達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后通過(guò)加入不同劑量的IPTG和改變誘導(dǎo)時(shí)間來(lái)確定最佳誘導(dǎo)條件。收集菌液8 000 r/min 3 min棄上清，加入40 μL PBS重懸沉淀，并與10 μL×loading buffer混合，沸水浴10 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.7 重組Hcp蛋白表達(dá)形式的鑒定及純化

將表達(dá)的菌液進(jìn)行超聲裂解，裂解產(chǎn)物4 000 r/min 10 min分離上清和沉淀，將沉淀溶解于Inclusion Body Elutio Buffer。將40 μL的上清與沉淀溶解液與10 μL×loading buffer混合，沸水浴10 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。確定表達(dá)形式后進(jìn)行大量誘導(dǎo)。根據(jù)純化試劑盒中的方法純化蛋白。

1.8 重組Hcp蛋白多克隆抗體的制備

按照表1所示的免疫程序，對(duì)家兔皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射。免疫結(jié)束后第7天進(jìn)行心臟采血，收集血清（免疫前從兔耳緣靜脈采血，分離血清作為陰性對(duì)照）。

1.9 兔抗Hcp蛋白多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定 測(cè)定方法參考文獻(xiàn)［14］。

1.10 兔抗Hcp蛋白多克隆抗體反應(yīng)性的測(cè)定

收集27 ℃、150 r/min過(guò)夜培養(yǎng)的嗜水氣單胞培養(yǎng)物，分別以培養(yǎng)物上清與沉淀作為抗原，以1∶4 000稀釋的兔陽(yáng)性血清和陰性血清為一抗，以1∶10 000稀釋的HRP山羊抗兔IgG（H+L）為二抗進(jìn)行Western blotting，以判斷該抗體的反應(yīng)性。

1.11 Hcp蛋白的生物信息學(xué)分析

使用在線生物信息學(xué)網(wǎng)站對(duì)Hcp蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)，具體為使用 ExPASy 數(shù)據(jù)庫(kù)的 ProtParam 和 ProtScale工具分析基本理化性質(zhì)和親疏水性，使用 SignalP 5.0、TMHMIM 2.0 分別對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行信號(hào)肽分析、跨膜結(jié)構(gòu)域分析。使用NetPhos 3.1和 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的 CD-search 工具尋找蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)和保守結(jié)構(gòu)域。使用 SPOMA和SWISS-MODEL分別預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hcp基因的擴(kuò)增及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增結(jié)果得到519 bp目的片段（圖1A）。凝膠電泳結(jié)果顯示，對(duì)pET-32a-Hcp進(jìn)行雙酶切，得到519 bp片段和5 900 bp片段，與預(yù)期相符（圖1B）。測(cè)序結(jié)果與參考序列的同源性為100%。

2.2 重組蛋白Hcp表達(dá)的條件優(yōu)化

結(jié)果顯示，表達(dá)的目的蛋白大小為37 ku，與預(yù)期大小一致（圖2A、圖2B）。當(dāng)誘導(dǎo)終濃度提高時(shí)，蛋白表達(dá)量提高（圖2A），而誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)蛋白表達(dá)量無(wú)明顯提升（圖2B）。

2.3 重組蛋白Hcp表達(dá)形式的鑒定及純化

SDS凝膠電泳結(jié)果表明，重組蛋白Hcp在上清和沉淀中都存在（圖3），如圖3所示在上清中的表達(dá)量更高，純化后蛋白大小與預(yù)期結(jié)果一致。

2.4 兔抗AH-Hcp蛋白多克隆抗體反應(yīng)性

Western-blot驗(yàn)證結(jié)果顯示，AH的培養(yǎng)物上清及沉淀與陽(yáng)性一抗、二抗發(fā)生結(jié)合，顯色后條帶大小約為19 ku，與預(yù)期結(jié)果一致（圖4A），與陰性一抗反應(yīng)未出現(xiàn)預(yù)期條帶（圖4B）。

2.5 多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定

經(jīng)間接ELISA檢測(cè)結(jié)果計(jì)算，該研究制備的兔抗Hcp蛋白多克隆抗體血清平均效價(jià)為1.024×106（圖5）。

2.6 Hcp蛋白基本理化性質(zhì) Hcp 蛋白由172 個(gè)氨基酸組成，數(shù)量最多的氨基酸為纈氨酸（Val）、蘇氨酸（Thr），均占 8.7%。蛋白分子式為C846H1304N224O259S8，相對(duì)分子質(zhì)量為19 013.49，理論等電點(diǎn)為 5.24。該蛋白攜帶的正電荷殘基總數(shù)為 138，負(fù)電荷殘基總數(shù)為 20。蛋白總平均親水性（GRAVY）為-0.273，屬于親水性蛋白，第117號(hào)氨基酸的疏水性最強(qiáng)，值為1.433，第55號(hào)氨基酸的親水性最強(qiáng)，值為-1.911。蛋白質(zhì)脂肪系數(shù)為73.66，不穩(wěn)定系數(shù)為 32.03，為穩(wěn)定蛋白。使用 ProtScale 分析 Hcp蛋白的親疏水性，氨基酸分值<0 表明具有親水性，分值>0 表明具有疏水性。分析顯示，Hcp蛋白的大部分氨基酸位于親水性區(qū)域，是親水性蛋白，與蛋白質(zhì)理化分析結(jié)果一致（圖6）。

2.7 Hcp蛋白的信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

SignalP 5.0分析（圖7）顯示，Hcp蛋白沒有信號(hào)裂解位點(diǎn)，推測(cè)Hcp蛋白不含信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。由TMHMM 2.0 預(yù)測(cè)（圖8）顯示，該蛋白在跨膜區(qū)（transmembrane）和膜內(nèi)區(qū)（inside）的概率極低，在膜外區(qū)（outside）的概率接近于1，說(shuō)明Hcp 蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，且整體位于膜外區(qū)。

2.8 Hcp蛋白的磷酸化位點(diǎn)和保守結(jié)構(gòu)域

使用 NetPhos 3.1預(yù)測(cè) Hcp 蛋白的磷酸化位點(diǎn)，當(dāng)域值為 0.5 時(shí)，預(yù)測(cè)該蛋白共有 30個(gè)磷酸化位點(diǎn)（圖9），包括11個(gè)絲氨酸（Serine），15個(gè)蘇氨酸（Threonine）和4個(gè)酪氨酸（Tyrosine）。使用NCBI的CD-search 工具預(yù)測(cè) Hcp 蛋白含有1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（圖 10），屬于T6SS分泌系統(tǒng)中Hcp1家族，為外膜通道蛋白家族。

2.9 Hcp蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)

使用SPOMA軟件對(duì)Hcp 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，該蛋白的構(gòu)成主要是無(wú)規(guī)則卷曲（random coil） ，占51.74%，延伸鏈（extended strand）占25.00%，α-螺旋（alpha helix）占19.19%，β-轉(zhuǎn)角（beta turn）占4.07% （圖 11）。利用 SWISS-MODEL預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型（圖12），預(yù)測(cè)得到全局模型質(zhì)量估計(jì)（global model quality estimation，GMQE）值為0.95，GMQE 值可以簡(jiǎn)單評(píng)估預(yù)測(cè)模型的質(zhì)量，其值越接近1，表明建模質(zhì)量越好，表明預(yù)測(cè)結(jié)果可靠。

3 結(jié)論與討論

T6SS的內(nèi)管由數(shù)百至數(shù)千個(gè)Hcp蛋白亞基組成六聚體［15］，形成一個(gè)管狀結(jié)構(gòu)。該研究中Hcp 蛋白生物信息學(xué)分析表明，其由172 個(gè)氨基酸組成，蛋白分子式為C846H1304N224O259S8，相對(duì)分子質(zhì)量為19 013.49 u，理論等電點(diǎn)為 5.24，屬于親水性蛋白，蛋白質(zhì)脂肪系數(shù)為73.66，不穩(wěn)定系數(shù)為 32.03，為穩(wěn)定蛋白。Hcp蛋白沒有信號(hào)裂解位點(diǎn)，屬于非分泌蛋白，預(yù)測(cè)該蛋白共有 30個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括11個(gè)絲氨酸，15個(gè)蘇氨酸和4個(gè)酪氨酸，含有1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。

對(duì)Hcp 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，該蛋白的構(gòu)成主要是無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角。Hcp作為效應(yīng)蛋白的輸出載體和伴侶，可以通過(guò)這些成分的共價(jià)延伸或通過(guò)非共價(jià)相互作用附著。因此，Hcp 蛋白也可以作為T6SS功能正常產(chǎn)生作用的標(biāo)志。Wang等［16-17］用Hcp蛋白免疫了鯉魚，與未接種的相比免疫了Hcp蛋白的鯉魚存活率增加7.14%。因此，該研究制備了Hcp蛋白多克隆抗體，以期待可以研究出針對(duì)AH的疫苗來(lái)對(duì)該細(xì)菌進(jìn)行防控。

該研究使用pET-32a（+）系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白［18］，這是目前應(yīng)用最廣、最成熟的表達(dá)系統(tǒng)之一［19］。該質(zhì)粒含有多個(gè)常用的酶切位點(diǎn)，便于不同基因克隆。此前有王楠楠等［17］ 根據(jù)嗜水氣單胞NJ-35株，利用pET-28a（+）表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，表達(dá)重組pET-28a-Hcp蛋白，該蛋白大小為24 ku，免疫家兔后效價(jià)達(dá)1.28×104。該研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)室保存的AH基因組擴(kuò)增了Hcp基因的完整序列，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Hcp。使用IPTG誘導(dǎo)Hcp基因在宿主菌E.coli BL21（DE3）中能夠大量穩(wěn)定地表達(dá)。結(jié)果表明，重組蛋白Hcp同時(shí)在上清與沉淀中表達(dá)。由于可溶性表達(dá)的重組蛋白的生物學(xué)活性較高［20］，且上清中的表達(dá)量更高，故純化上清中重組Hcp蛋白作為免疫原對(duì)家兔進(jìn)行了免疫。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，抗體效價(jià)達(dá)到1.024×106，說(shuō)明表達(dá)的Hcp蛋白具有良好的免疫原性。經(jīng)Western blot方法測(cè)定，該多抗具有較好的反應(yīng)性，為深入開展Hcp的相關(guān)研究提供研究工具。

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