摘要 在對1例犬右肺囊腫伴肝淤血和胃腸臌氣診治的基礎上，分離鑒定出1株尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），同時合成和探究雞蛋源納米硫化鐵對尖孢鐮刀菌引起的犬囊腫的治療效果。通過病原學診斷、病史調(diào)查、臨床表現(xiàn)、血液學生理生化指標檢查、X線檢查等方法診斷該病為尖孢鐮刀菌引起的多器官囊腫。通過正交試驗合成了抗真菌的雞蛋源納米硫化亞鐵，并將其應用于抑制尖孢鐮刀菌生長。結(jié)果表明：根據(jù)診斷結(jié)果采用對因治療（雞蛋源納米硫化亞鐵抗尖孢鐮刀菌）和對癥治療（高壓氧艙吸氧、肝肺和胃腸穿刺），達到了抗尖孢鐮刀菌引起的囊腫的治療效果。

關(guān)鍵詞 雞蛋源納米硫化亞鐵；囊腫；尖孢鐮刀菌

中圖分類號 S 859.79 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）23-0075-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.017

Synthesis of Egg White-derived Nano-ferrous Sulfide and Its Therapeutic Effect on Cysts Caused by Fusarium oxysporum

LENG Chang-you1， CHEN Le2， WU Hao-dong2 et al

（1.Chongqing Rongchang District Vocational Education Center，Chongqing 402460;2. Animal Medical College of Southwest University， Chongqing 402460 ）

Abstract Based on the diagnosis and treatment of a canine right lung cyst with liver congestion and gastrointestinal gas， a strain of Fusarium oxysporum was isolated and identified. At the same time， the therapeutic effect of egg white-derived nano-iron sulfide on canine cysts caused by Fusarium oxysporum was synthesized and explored. The disease was diagnosed as multiple organ cysts caused by Fusarium oxysporum by etiological diagnosis， medical history investigation， clinical manifestations， hematological physiological and biochemical index examination， X-ray examination and other methods. Antifungal egg white-derived nano-iron sulfide was synthesized by orthogonal test and applied to inhibit the growth of Fusarium oxysporum. The results showed that according to the diagnosis results， the therapeutic effect of anti-F.oxysporum cysts was achieved by treatment （egg white source nano-ferrous sulfide anti-F.oxysporum） and symptomatic treatment （hyperbaric oxygen chamber oxygen inhalation， liver and lung and gastrointestinal puncture）.

Key words Nano-iron sulfide from egg;Cyst;Fusarium oxysporum

基金項目 重慶市教委重大基金資助項目（KJZD-M202200202）；中國農(nóng)村專業(yè)技術(shù)協(xié)會重慶榮昌肉兔科技小院項目。

作者簡介 冷長友（1972—），男，重慶人，高級講師，從事臨床獸醫(yī)學研究。

收稿日期 2024-01-03

尖孢鐮刀菌是常見的腐生霉菌［1］，特別是在炎熱的夏季，尖孢鐮刀菌易大量滋生，動物吸入了空氣中的尖孢鐮刀菌孢子出現(xiàn)呼吸道感染［2］。尖孢鐮刀菌會導致食物迅速腐敗、發(fā)酵。動物采食了被污染的食物或者霉爛變質(zhì)食物引起胃腸道異常發(fā)酵，產(chǎn)生大量氣體而不能及時排出，而在腹部大量集聚，動物出現(xiàn)食欲下降、腹部脹大、腹部皮膚繃緊如鼓的癥狀［3］，并壓迫附近的肝臟等器官導致淤血，治療不及時容易出現(xiàn)死亡等預后不良的表現(xiàn)。

環(huán)境中的病原微生物（如尖孢鐮刀菌等）易導致肺炎，而且肺炎是臨床上動物常見的多發(fā)病、常見病，肺炎的臨床表現(xiàn)主要有濕性或者干性咳嗽、流濃鼻涕、呼吸困難和肺氣腫等癥狀［4］。肺炎如果沒有得到及時治療，會伴發(fā)或繼發(fā)其他病癥（如缺氧、胃擴張、肺泡及肺間質(zhì)氣腫，對機體導致嚴重損傷［5］等）而造成病情加重［6］，該病往往發(fā)病急，如不及時救治會導致動物死亡。因此在對癥治療時，往往要求迅速、準確地診斷出危害動物健康的因素，采取穿刺放氣、吸氧等方法搶救動物生命，降低氣體、血液等不利因素對心、肺、肝等重要器官的損傷。

該病的病原菌為侵襲性尖孢鐮刀菌，采用常用抗生素（如酮康唑、伊曲康唑等）方法防治真菌感染。但目前大多數(shù)有效的抗侵襲性尖孢鐮刀菌的藥物只能在人醫(yī)上使用，而且國家批準的動物用抗真菌藥物很少。因此，開發(fā)新的動物用抗真菌劑是十分必要的。疾病的治療原則包括對因治療和對癥治療。隨著機械工業(yè)化的發(fā)展，大量蛋類產(chǎn)品被生產(chǎn)出來供給人類的各種需要，但在生產(chǎn)、運輸過程中雞蛋容易受損，出現(xiàn)殘次雞蛋。雞蛋是一種極好的天然蛋白質(zhì)來源，也是一種被忽視的天然生物材料。此外，納米硫化物還具有低細胞毒性和生物相容性等顯著優(yōu)勢，將有機硫化合物轉(zhuǎn)化為納米級無機硫化物可以通過熱溶劑法實現(xiàn)。有研究表明，納米級金屬硫化物表現(xiàn)出很高的抗菌活性［7-8］。

筆者對炎熱夏季尖孢鐮刀菌大量繁殖導致的動物右肺囊腫伴肝淤血和胃腸臌氣的疾病模型進行診治，并通過形態(tài)學和分子生物學方法鑒定和鑒別了侵襲性致病真菌為尖孢鐮刀菌。同時，通過正交試驗優(yōu)化了合成方法，合成了一種新型抗真菌劑（雞蛋源納米硫化亞鐵）。在體外抗真菌試驗中，確定了雞蛋源納米硫化亞鐵抑制侵襲性尖孢鐮刀菌的抑菌作用。通過動物回歸試驗，驗證了雞蛋源納米硫化亞鐵對鐮刀霉菌引起的肺囊腫的治療作用，發(fā)現(xiàn)使用殘次等級的雞蛋可以生產(chǎn)出高價值的抗真菌藥物雞蛋源納米硫化亞鐵，這為工業(yè)化次等級蛋產(chǎn)品的利用拓展了一條新的途徑，為開發(fā)動物用新型納米抗真菌劑提供了科學依據(jù)，也希望能對臨床上該類真菌疾病的診斷和治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株的來源

4月齡大的拉布拉多犬和主人居住在低樓層，經(jīng)常吃剩菜。疾病剛開始時病犬經(jīng)?？人粤鞅翘椋蝼粐乐?，鼻塞，偶爾會嘔吐。考慮到該犬在發(fā)病初期和晚期都不想進食，且該犬的精神狀態(tài)較正常，該犬主人予以阿莫西林進行治療。飼喂阿莫西林后病情無好轉(zhuǎn)。7 d后病犬出現(xiàn)心臟突然跳動，呼吸系統(tǒng)纖維支氣管鏡有明顯濕啰音（氣泡破裂），全身不適，食欲不振等臨床癥狀，就診檢查發(fā)現(xiàn)，犬體溫39.8 ℃，心跳89次/min，最大攝氧量96次/min。該犬的皮膚和黏膜顏色較淺。尿液顏色正常。因此，送醫(yī)并采集胃內(nèi)容物培養(yǎng)，并進行形態(tài)學和分子生物學鑒定。

1.2 雞蛋源納米硫化亞鐵的合成

通過正交試驗篩選雞蛋源納米硫化亞鐵的最佳合成方法，正交試驗采用3因素3水平方法（表1）。通過熱溶劑法合成雞蛋源納米硫化亞鐵，取乙酸鈉、無機硫（硫酸亞鐵）后，按表1設計正交試驗。反應結(jié)束后，12 000 r/min，離心5 min后取上清。

1.3 主要試劑

DNA基因組提取試劑盒、DNase I、qPCR試劑盒、Trizol試劑盒購于TaKaRa 公司；引物、2×Taq PCR Master Mix和DL 2 000 DNA Marker購于北京擎科生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；噻唑藍購于Sigma公司。

1.4 主要儀器

微量核酸檢測儀（NanoDrop 2 000）；熒光倒置顯微鏡（Leica）；熒光定量PCR儀（QuantStudio6）；酶標儀（Thermo）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原學檢查

2.1.1 病原菌的形態(tài)學鑒定。

將胃內(nèi)容物接種到沙氏培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。菌絲長出后，將菌絲體接種到新的沙氏培養(yǎng)基上，直至培養(yǎng)基上長出純培養(yǎng)物。能夠觀察到培養(yǎng)基正面的菌落呈粉紅色或紅色，培養(yǎng)基背面皺紋發(fā)黃，菌落邊緣呈圓形，菌絲呈絮狀密集生長。顯微鏡下可見帶側(cè)枝的氣生菌絲；形成的分生孢子呈鐮刀狀，末端尖細，略彎曲，分生孢子大小為（10～16）μm×（4～2）μm。培養(yǎng)后期出現(xiàn)厚垣孢子，菌絲部位膨起，光學顯微鏡下發(fā)現(xiàn)帶側(cè)枝的氣生菌絲，分生孢子呈鐮刀狀，如圖1所示。根據(jù)該病原菌的形態(tài)特征，可初步判斷為尖孢鐮刀菌。

2.1.2 致病菌確定。

用真菌DNA提取試劑盒提取DNA后，使用ITS1和ITS4引物進行擴增，引物序列為（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3′）。配制25 μL的PCR反應體系：1.0 μL DNA模板；上、下游引物各1.0 μL；12.5 μL 2×PCR mix；9.5 μL ddH2O。擴增程序：預變性，94 ℃反應5 min；變性，94 ℃反應30 s；退火，55 ℃反應30 s；延伸，72 ℃反應1 min，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存產(chǎn)物。選擇2%瓊脂糖凝膠進行電泳，得到長度約560 bp的片段，如圖2所示。將所得數(shù)據(jù)在NCBI庫進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)OBfKYhJTOb1e2ddYUNkRKw==該菌與尖孢鐮刀菌ITS序列的同源性達到99%～100%。

2.2 侵襲性尖孢鐮刀菌對血液生理指標的影響

血常規(guī)檢查見白細胞數(shù)總數(shù)為31.8×109個/L（正常參考范圍6.0～17.0×109個/L），淋巴細胞數(shù)為7.4×109個/L（正常參考范圍0.8×109～5.1×109個/L），單核細胞數(shù)為1.9×109個/L（正常參考范圍0～1.8×109 /L），紅細胞數(shù)為3.77×1012個/L（正常參考范圍5.50～8.50×109個/L），血紅蛋白濃度為83 g/L（正常參考范圍110～190 g/L），紅細胞壓積為25.5％（正常參考范圍39.0%～56.0%），其他未見異常，提示機體存在嚴重感染與嚴重貧血現(xiàn)象。

2.3 侵襲性尖孢鐮刀菌對血液生化指標的影響

血液中C-反應蛋白濃度為58.8 μg/L（正常參考范圍0～10 μg/L），提示機體存在嚴重炎性反應；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶濃度為97 U/L（正常參考范圍17～78 U/L），提示肝臟損傷，肝細胞中有肝臟酶露出現(xiàn)象。

2.4 氣性囊腫對內(nèi)臟器官（胃、腸、肝、肺）形態(tài)的影響

治療前，X射線檢查見胸腔內(nèi)右背側(cè)中后緣處有一規(guī)則的圓形低密度陰影，形成占位性的含氣結(jié)構(gòu)影像（圖3A、圖3B的a箭頭部位），穿刺和抗菌治療7 d胸腔右背側(cè)的圓形低密度陰影體積縮?。▓D3C的a箭頭部位），在治療第14天（圖3D的a箭頭部位）時胸腔右背側(cè)的圓形低密度陰影體積進一步縮小，直至第21天檢查時痊愈（圖3E）。治療前，肝臟體積增大，在腹腔右側(cè)形成橢圓形低密度陰影（圖3A、圖3B的b處箭頭部位），穿刺和抗菌治療7 d明顯縮?。▓D3C的b箭頭處），進而在治療的第14天痊愈（圖3D的b箭頭處）。治療前，胃及腸道內(nèi)充滿大量氣體（圖3A、圖3B的c箭頭部位），在腹腔形成胃腸擴張的影像，治療7 d后胃腸體積縮?。▓D3C和圖3D的c箭頭部位）。

綜上，根據(jù)動物臨床表現(xiàn)、病原學的形態(tài)學和分子生物學診斷、血液生理指標、血液生化指標和X線檢查等結(jié)果進行綜合分析，最終診斷該病為尖孢鐮刀菌引起的右肺囊腫伴肝臟淤血和胃腸臌氣。

2.5 肺臟和胃腸緊急穿刺放氣治療

穿刺之前X光發(fā)現(xiàn)動物呼吸困難，肺臟有氣腫（圖4中a箭頭）、肝臟淤血（圖4中b箭頭）和胃腸臌氣（圖4中c箭頭），遂對右肺氣性囊腫和胃腸臌氣分別進行細針穿刺抽吸氣體，發(fā)現(xiàn)右肺穿刺手術(shù)結(jié)束后動物呼吸窘迫現(xiàn)象得到明顯緩解，肺臟的氣腫泡明顯縮?。▓D4B的a箭頭）。呼吸次數(shù)從99次/min恢復到63次/min，接近正常呼吸頻率范圍。胃穿刺放氣手術(shù)結(jié)束后腹圍擴大現(xiàn)象降低，胃腸擴張程度明顯降低（圖4C），右肺的圓形低密度陰影范圍明顯降低，肝臟的淤血癥狀得到了緩解（圖4A和4B的b箭頭）。

2.6 采用吸氧方法緩解氣體囊腫壓迫淤血導致的缺氧

穿刺治療后將動物每天放進高壓氧艙2 h，其中吸氧時間為1 h，使動物處于高濃度（80%）的氧氣環(huán)境，以提高動物的血氧含量直到呼吸異常癥狀恢復，吸氧治療7 d后動物動脈血氧飽和度（SaO2）恢復正常，動物的動脈血氧飽和度平均達到94％。

2.7 雞蛋源納米硫化亞鐵的合成和對侵襲性尖孢鐮刀菌IC50的測定

通過正交試驗篩選雞蛋源納米硫化亞鐵的最佳合成方法。通過熱溶劑法合成雞蛋源納米硫化亞鐵，取乙酸鈉、無機硫（硫酸亞鐵）后，按表1所示正交試驗設計進行不同反應條件下的合成。反應結(jié)束后，12 000 r/min離心5 min后取上清，用噻唑藍染色法測定尖孢鐮刀菌在雞蛋源納米硫化亞鐵處理4 h后的死亡率，以篩選合成雞蛋源納米硫化亞鐵的最佳條件。即在噻唑藍染色后，使用酶標儀讀取OD570 nm，以DMSO作為對照，繪制擬合曲線并計算IC50。

正交試驗結(jié)果顯示，使用以下配方（硫酸亞鐵、乙酸鈉、雞蛋2.5 g加蒸餾水定容至20 mL）在100 ℃反應釜中反應48 h合成的雞蛋源納米硫化亞鐵表現(xiàn)出最好的抑菌效果。尖孢鐮刀菌在被雞蛋源納米硫化亞鐵處理4 h后，使用噻唑藍染色后發(fā)現(xiàn)，雞蛋源納米硫化亞鐵質(zhì)量濃度越高，尖孢鐮刀菌的死亡率越高。尖孢鐮刀菌死亡率和雞蛋源納米硫化亞鐵濃度的相關(guān)性擬合曲線如圖5所示，其對數(shù)函數(shù)為Y=13.643+18.138lnX（R2=0.985 4），IC50為0.886 g/L（95%置信區(qū)間0.847 8～0.924 4 g/L）。

2.8 雞蛋源納米硫化亞鐵對侵襲性尖孢鐮刀菌的抑制作用

針對侵襲性真菌尖孢鐮刀菌，使用上述自主合成的新型抗真菌藥物雞蛋源納米硫化亞鐵進行治療。使用0.886 g/L口服20 mL，每日1次，口服治療后第7天動物精神狀態(tài)、食欲、呼吸等外觀體征基本恢復正常；再次進行X線檢查，見右肺氣性囊腫體積明顯縮小，胃與腸道位置恢復正常（圖4C），肺臟體積明顯變?。▓D3E）。另外，采集胃內(nèi)容物進行培養(yǎng)后，采用形態(tài)學和分子生物學方法鑒定，均證明尖孢鐮刀菌陰性。

3 結(jié)論與討論

在疾病治療時，緊急癥狀容易危及動物生命，因此在治療時需要針對緊急癥狀進行緊急治療。由于發(fā)生了肺葉氣性囊腫、胃擴張及其導致的急性肝淤血3種緊急病癥，易因呼吸困難和缺氧而致動物死亡，因此首先需要對動物的胃及肺囊腫進行細針穿刺抽吸手術(shù)，穿JgQqPH9xYRGCgCRFuvcE+g==刺抽吸手術(shù)極大地緩解了缺氧的癥狀，為后續(xù)的診斷和治療爭取了寶貴的時間。但是在穿刺抽吸手術(shù)時，應根據(jù)動物的大小掌握穿刺的位置以及進針的角度與深度，另外穿刺較小的動物時要選擇較細的穿刺針，盡量減少對肺組織和胃腸組織的過度損傷。在肺部穿刺時，確認穿刺針進入肺部而不是胸腔，防止氣體進入胸膜腔而失去負壓造成醫(yī)源性氣胸［9］。

氣性囊腫（又稱肺葉氣性囊腫）的特征為肺葉上出現(xiàn)圓形低密度陰影，是由于肺炎或吼叫等不良因素引起臨近肺泡及肺間質(zhì)破損后形成的氣性囊腔結(jié)構(gòu)［10］。X線檢查對肺氣囊腫的診斷比較確切，在X線片中病變區(qū)域一般呈規(guī)則的低密度陰影影像，X線機設備價格不高，普通的動物醫(yī)院均可配備，因此臨床中對肺葉氣性囊腫的診斷可以借助X線機檢查來實現(xiàn)。

吸氧不僅可以改善機體內(nèi)組織的血氧含量，對于有肺泡及肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)損傷的肺部疾病，吸氧還可以減少肺能量的消化，進而促進肺組織的結(jié)構(gòu)修復［11］。在肺葉氣性囊腫穿刺前動物表現(xiàn)呼吸急促，穿刺后將其放入氧艙裝置內(nèi)進行吸氧治療，治療2 d后對其進行X線檢查，發(fā)現(xiàn)肺葉氣性囊腫大小恢復到與穿刺前一樣，且動物并未再表現(xiàn)出呼吸急促的癥狀，該現(xiàn)象表明，肺葉氣性囊腫能否引起呼吸異常主要取決于機體內(nèi)組織的血氧含量。

急性肝淤血（又稱為被動性肝充血）時，X線檢查顯示肝臟明顯增大，這可能是由于胸腔和腹腔內(nèi)氣體蓄積過多導致肝靜脈血管狹窄，肝臟中的血液回流不暢［12］，以致肝小葉內(nèi)中央靜脈和肝血竇被動性充血，從而出現(xiàn)動物肝淤血，表現(xiàn)為動物肝臟體積增大，肝靜脈內(nèi)壓力過度升高而疼痛的癥狀。因此，對于急性肝淤血的緊急癥狀，隨著細針穿刺抽吸手術(shù)的實施，肝血管的通暢性得以改善，血液循環(huán)障礙消失，肝臟體積逐漸恢復正常。

該研究提供了一種動物用的抗真菌劑，硫酸亞鐵、乙酸鈉、雞蛋2.5 g加蒸餾水定容至20 mL在100 ℃反應釜中反應48 h合成的雞蛋源納米硫化亞鐵表現(xiàn)出最好的抗尖孢鐮刀菌效果。尖孢鐮刀菌是廣泛存在于溫暖潮濕地區(qū)的腐生型致病真菌，伴隨黃曲霉菌及其他致病菌導致多種動物發(fā)病。動物通過吸入空氣中的霉菌孢子出現(xiàn)呼吸道感染，或者動物采食了被尖孢鐮刀菌污染的食物引起動物胃腸道異常發(fā)酵出現(xiàn)胃腸臌氣的現(xiàn)象，而使用該抗菌劑聯(lián)合對癥治療可以有效治療侵襲性真菌引起的氣性囊腫。

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