摘要 以自然病變的羊角辣椒為原料，采用組織培養(yǎng)法及回接法從中分離篩選優(yōu)勢病原菌。通過形態(tài)學(xué)觀察和ITS全序列分析對(duì)優(yōu)勢病原菌進(jìn)行鑒定，并研究了一株拮抗細(xì)菌Bacillus subtilis對(duì)優(yōu)勢病原菌的抑制作用。結(jié)果表明：導(dǎo)致辣椒在貯藏過程中發(fā)生病變的優(yōu)勢病原菌為1株真菌，經(jīng)鑒定為Botrytis cinerea。研究發(fā)現(xiàn)，生防菌Bacillus subtilis對(duì)病原菌Botrytis cinerea具有良好的抑制效果，抑菌率可達(dá)87.8%。

關(guān)鍵詞 辣椒；病原菌；分離鑒定；生防菌；拮抗作用

中圖分類號(hào) Q934.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）19-0168-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.19.036

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Isolation and Identification of Pathogenic Bacteria of Storage Venereal Diseases in Capsicum and Study on Their Inhibition by Antagonistic Bacteria

HU Xiu-hong¹， ZHANG Ting-hui²， OU Ming-yun¹ et al

（1. School of Life and Health Science， Kaili University， Kaili， Guizhou 556011;2. Qiandongnan Food and Drug Inspection and Testing Center， Kaili， Guizhou 556011）

Abstract The dominant pathogenic bacteria were isolated and screened by tissue culture method and tieback method from natural pathological changes of capsicum chinensis. The dominant pathogenic bacteria were identified by morphological observation and ITS sequence analysis. The inhibitory effect of an antagonistic bacterium—Bacillus subtilis on the dominant pathogenic bacteria was studied. The results showed that the dominant pathogenic bacteria that caused the pathological changes of capsicum during storage was a fungus strain， which was identified as Botrytis cinerea. It was found that Bacillus subtilis had good inhibitory effect on Botrytis cinerea with inhibition rate of 87.8%.

Key words Pepper;Pathogenic bacteria;Isolation and identification;Biocontrol bacteria;Antagonism

基金項(xiàng)目 2022年國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（20221066-9044）；2022年省級(jí)“金課”（一流課程）建設(shè)項(xiàng)目（SJJK202221）；2022年度黔東南州基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（黔東南科合基礎(chǔ)〔2022〕05號(hào)）；凱里學(xué)院2023年校級(jí)專項(xiàng)課題（2023XJZX0304）。

作者簡介 胡秀虹（1986—），女，江西景德鎮(zhèn)人，教授，碩士，從事微生物技術(shù)與藥用植物藥效研究。

收稿日期 2024-01-17；修回日期 2024-04-30

辣椒屬茄科（Solanaceae Juss.）茄亞族（Solanaceae subfamily）辣椒屬（Capsicum L.），多數(shù)品種為一年生，部分品種為多年生^［1-2］。辣椒上市時(shí)間較集中，含水量較高，采摘后仍然進(jìn)行著旺盛的代謝活動(dòng)，在貯藏過程中易因溫度或物理破壞導(dǎo)致腐爛^［3-5］。研究表明，常見果蔬貯藏性病害主要有果腐?。‵usarium sp.）、疫?。≒hytophthor acapsici）、炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）、軟腐病（Erwinia carotovora）、黑斑?。ˋlternaria alternata）、灰霉病（Botrytis cinerea）等^［6-7］。目前，辣椒采后防腐的方法包括物理防治、化學(xué)防治、生物防治以及多種方法聯(lián)合處理等^{［4-5，7-9］}。物理防治主要是貯藏時(shí)的溫度控制^［4-5］；化學(xué)防治主要是使用各種保鮮劑，成本較低^［9-10］；生物防治主要包括植物源殺菌劑和微生物源殺菌劑，因其成本低、專一性強(qiáng)、對(duì)農(nóng)產(chǎn)品無污染、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)而備受研究者關(guān)注^［11］。對(duì)植物病原菌具有防治作用的這類微生物，又稱為拮抗菌或生防菌^［12］。相關(guān)研究表明，辣椒病害生防細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬以及海洋細(xì)菌等，其中以芽孢桿菌屬為主^{［11，13-16］}。

貴州地處云貴高原、少數(shù)民族眾多，糟辣椒是當(dāng)?shù)氐奶厣?，而辣椒作為其主要原材料之一，是貴州省重點(diǎn)發(fā)展的十二大產(chǎn)業(yè)之一。辣椒在采摘、貯藏、運(yùn)輸、加工、銷售等環(huán)節(jié)極易受到機(jī)械損傷、微生物侵染等而腐爛變質(zhì)，這給辣椒產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的損失。筆者以辣椒采后貯藏性病害病原菌為研究切入點(diǎn)，以采后腐爛的辣椒為研究對(duì)象，探究其優(yōu)勢致病菌及生防菌對(duì)病原菌的抑制作用，以期為后期分離研究生物防腐劑提供菌種資源，也為辣椒乃至其他果蔬采后保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與原料。瓊脂粉、次氯酸鈉，成都市科龍化工試劑廠；PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乳酸棉染液，珠海貝索生物技術(shù)有限公司；蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室自制；無菌水，蒸餾水于121 ℃高壓滅菌20 min。羊角辣椒，采購于貴州凱里農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 菌種。拮抗菌：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），分離于貴州中藥材多花黃精根莖中。

1.1.3 儀器與設(shè)備。FA2004型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺(tái)，上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；ZWY-CZ11D型恒溫?fù)u床培養(yǎng)振蕩器，上海智誠分析儀器有限公司；BGZ-246型電熱鼓風(fēng)干燥箱、SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX-50kbs型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化及分類鑒定。采用組織分離法對(duì)辣椒病變組織進(jìn)行病原菌的分離，即切取病組織小塊（邊長3～4 mm）數(shù)塊，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%次氯酸鈉溶液中浸泡1～2 min，然后放于體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇中浸泡20 s，再用無菌水漂洗3次，最后將漂洗好的病組織吸干水分，呈“品”字形置于PDA固體培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)4～6 d。挑取病組織周圍單菌落進(jìn)行多次純化培養(yǎng)直至獲得純菌種為止。同時(shí)觀察菌落形態(tài)、顏色及生長速率，并挑取菌絲置于乳酸苯酚液中，加蓋片于顯微鏡下觀察病原菌孢子大小與菌絲形態(tài)。

按SK8259試劑盒操作提取真菌基因組DNA，采用通用引物ITS1/ITS4 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增：ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。擴(kuò)增體系為 25 μL 反應(yīng)體系，其中 10×PCR Buffer 5.0 μL，50 mmol/L MgSO 5.0 μL，10 mmol/L dNTP 2.0 μL，5 U/μL Taq DNA酶0.5 μL，正反向引物（10 μmol/L ITS1和ITS4）各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddHO 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性 95 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s；復(fù)性57 ℃，30 s；延伸72 ℃，90 s；30個(gè)循環(huán)，后延伸 72 ℃，10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果采用GenBank中的BLAST進(jìn)行比對(duì)，通過MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時(shí)結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察對(duì)致病菌進(jìn)行分類鑒定。

1.2.2 病原菌回接。將純化的病原真菌接種于PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5～7 d，將用無菌水洗下的孢子液配制成濃度約為 10⁶ CFU/mL的孢子懸液。采用無菌注射法將病原菌回接到辣椒內(nèi)，以接種無菌水為對(duì)照組。依據(jù)科赫法則，待辣椒果實(shí)產(chǎn)生病變后，再通過組織分離法對(duì)病變組織進(jìn)行分離純化，并將分離到的病原菌進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.2.3

拮抗菌對(duì)病原菌的抑制作用。首先采用液體培養(yǎng)對(duì)峙法考察拮抗菌Bacillus subtilis對(duì)病原菌的抑制作用。取上述病原真菌孢子懸液1 mL，放入裝有50 mL PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，同時(shí)接種1環(huán)拮抗菌為試驗(yàn)組；以接種病原真菌孢子懸液但不接種拮抗菌為對(duì)照組，于180 r/min、28 ℃下?lián)u床培養(yǎng)5～7 d。

進(jìn)一步通過平板對(duì)峙法考察拮抗菌Bacillus subtilis對(duì)病原菌的抑制作用。具體操作如下：取1環(huán)活化的拮抗細(xì)菌放入100 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，無菌水稀釋制成濃度為 10⁵～10⁶ CFU/mL的菌懸液。取0.5 mL菌懸液采用平板涂布法進(jìn)行平板涂布，涂布均勻后再在平板正中央接種一塊直徑為 4 mm的病原真菌菌餅。以不涂布拮抗菌只接種病原真菌的培養(yǎng)皿為對(duì)照組，并設(shè)置3個(gè)平行組。然后將各組培養(yǎng)皿放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對(duì)照組菌落長至約70 mm，取出各組平板進(jìn)行菌落直徑的測量，并計(jì)算抑菌率。

抑菌率=對(duì)照組菌落直徑-試驗(yàn)組菌落直徑對(duì)照組菌落直徑×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離純化和病原鑒定

通過組織培養(yǎng)法從貯藏性病害的辣椒中分離純化出1株形態(tài)穩(wěn)定、長勢良好的真菌，編號(hào)為LJ-2（圖1）。研究發(fā)現(xiàn)，LJ-2菌株在PDA平板上生長的菌絲表面呈灰白色絮狀，背面呈淺褐色，質(zhì)地質(zhì)密，匍匐生長，其生長速率為6～10 mm/d。顯微鏡下，LJ-2菌絲彎曲有隔膜，可見小分生孢子。

經(jīng)測序，致病性真菌LJ-2的基因序列大小約為538 bp。將各菌株序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2。由圖2可知，菌株LJ-2與Botrytis cinerea isolate strain親緣關(guān)系最近，與Trichoderma harzianum isolate strain親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，可初步判斷LJ-2可能為Botrytis cinerea。

2.2 病原菌回接

根據(jù)柯赫氏法則，將配制好的孢子懸浮液經(jīng)注射法接種于辣椒果肉上。7 d后，辣椒開始霉變長出霉菌，LJ-2致病組的辣椒局部接種處長出灰棕色霉菌且整體潰爛腐敗，這與初始辣椒病狀基本一致。采用組織分離法分離病變組織上的病原菌并進(jìn)行顯微鑒定，結(jié)果表明再次分離的菌株與接種的病原菌菌株相同，由此可以證明Botrytis cinerea LJ-2為辣椒貯藏性病害（腐爛）的主要致病菌。

2.3 拮抗菌對(duì)病原菌的抑制作用

通過液體培養(yǎng)法考察Bacillus subtilis對(duì)Botrytis cinerea LJ-2的抑制作用，結(jié)果見圖3。病原真菌經(jīng)液體搖床培養(yǎng)一段時(shí)間后會(huì)長出大量呈球狀的菌絲塊，拮抗菌若能抑制病原真菌的生長，則病原真菌難以形成菌絲塊。如圖3所示，對(duì)照組產(chǎn)生了大量呈球狀的菌

絲塊，而試驗(yàn)組則無菌絲塊生產(chǎn)且液體培養(yǎng)基呈渾濁狀，這說明Bacillus subtilis大量繁殖，抑制了Botrytis cinerea LJ-2病原菌的生長。平板對(duì)峙試驗(yàn)（圖4）進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Bacillus subtilis能較好地抑制致病菌LJ-2的生長。在沒有接種拮抗菌的平板上，LJ-2生長良好，培養(yǎng)至第8天，菌落直徑約為63 mm；而接種有拮抗菌的平板上，LJ-2幾乎不生長，拮抗菌對(duì)致病菌LJ-2的平板抑菌率可達(dá)87.8%。

3 結(jié)論與討論

該研究從貯藏過程中發(fā)生病害的辣椒上分離獲得1株致病真菌，經(jīng)致病性測試，發(fā)現(xiàn)該真菌是導(dǎo)致辣椒貯藏過程中發(fā)生病害的主要病原菌。進(jìn)一步進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，初步確定該致病性真菌主要為Botrytis cinerea（灰葡萄孢菌或灰霉病菌）。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，可以推斷Botrytis cinerea是主要致病菌^［17］。拮抗菌對(duì)峙試驗(yàn)表明，Bacillus subtilis對(duì)Botrytis cinerea的抑菌效果明顯，抑菌率可達(dá)87.8%。

如何用生物防治方法減少辣椒在貯藏過程中的損耗，是近年來研究的一個(gè)重點(diǎn)。該研究從腐爛辣椒中分離出1株致病性真菌，命名為Botrytis cinerea LJ-2，其中枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis對(duì)Botrytis cinerea有抑制作用，今后應(yīng)繼續(xù)深入研究其發(fā)酵液有效成分對(duì)該株致病菌的抑制作用，以期為辣椒采后貯藏保鮮提供參考。

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