摘要 ［目的］以煙葉為原料，進(jìn)行煙葉多肽的提取及其抗氧化活性研究。［方法］采用酶法輔助水提醇沉法提取煙葉多肽，應(yīng)用單因素試驗(yàn)考察加酶量、酶解pH、酶解時(shí)間、浸提溫度、底物濃度5個(gè)單因素對(duì)煙葉多肽提取量的影響，采用響應(yīng)面法確定煙葉多肽的最佳提取工藝，并分析煙葉多肽對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除作用，研究煙葉多肽的抗氧化活性。［結(jié)果］以處理樣品質(zhì)量1 g為基準(zhǔn)，煙葉多肽的最佳提取工藝為加酶量4 200 U、酶解pH 8.2、酶解時(shí)間2.5 h、浸提溫度49 ℃、底物濃度4.2%，煙葉多肽提取量為88.23 mg/g。按照該條件所提取的煙葉多肽對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除率分別為83.09%和73.84%，表明煙葉多肽具有一定的抗氧化能力。［結(jié)論］該研究為煙葉的藥用價(jià)值和煙葉多肽的藥物開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 煙葉；多肽；酶解；提取工藝優(yōu)化；響應(yīng)面法；抗氧化活性

中圖分類(lèi)號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）19-0158-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.19.034

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on the Optimization of Extraction Process of Tobacco Polypeptide and Its Antioxidant Activity

CHEN Yue-xing^1，2，SHI Ye-lin¹，DU Xue-ting¹ et al

（1.School of Biomedical and Food Engineering，Shangluo University，Shangluo，Shaanxi 726000;2.Shaanxi Qinling Characteristic Biological Resources Industry Technology Research Institute，Shangluo，Shaanxi 726000）

Abstract ［Objective］Taking tobacco as experiment material，extraction process of tobacco polypeptide and its antioxidant activity was studied in this research.［Method］Tobacco polypeptide was extracted by enzyme-assisted water extraction and alcohol precipitation.Single factor test was used to investigate the effects of enzyme addition，enzymolysis pH，enzymolysis time，extraction temperature and substrate concentration on the extraction rate of tobacco polypeptide.The optimal extraction process of tobacco polypeptide was determined by response surface method.The scavenging activity of tobacco polypeptide on DPPH and hydroxyl radicals was detected.［Result］The optimal extraction process for tobacco polypeptide was as follows （based on 1 g tobacco sample）：enzyme addition 4 200 U，enzymolysis pH 8.2，enzymolysis time 2.5 h，extraction temperature 49 ℃ and the substrate concentration 4.2%.Under the optimized extraction process，the extraction rate of tobacco polypeptide was 88.23 mg/g.The scavenging rates of DPPH and hydroxyl radicals of the tobacco polypeptide were 83.09% and 73.84%，respectively.Tobacco polypeptide was of a certain antioxidant capacity.［Conclusion］This study provides a certain theoretical basis and technical guidance for the medicinal value of tobacco leaves and the drug development of tobacco peptides.

Key words Tobacco;Polypeptide;Enzymolysis;Extraction process optimization;Response surface method;Antioxidant activity

基金項(xiàng)目 陜西省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202411396005）；陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目（2024JC-YBMS-187）。

作者簡(jiǎn)介 陳月星（1984—），女，河北衡水人，講師，博士，從事農(nóng)林生物專(zhuān)業(yè)相關(guān)教學(xué)與科研工作。

收稿日期 2024-03-21

煙草（Nicotiana tabacum L.）為一年生或有限多年生草本^［1］。煙葉中含有多種化學(xué)成分，包括糖類(lèi)物質(zhì)、有機(jī)酸和脂質(zhì)等^［2］。煙葉的含氮化合物主要有蛋白質(zhì)和生物堿等，其中蛋白質(zhì)經(jīng)酶分解轉(zhuǎn)化為多肽，具有一定生物活性的化合物分子，穩(wěn)定性較高，具有易消化吸收、促進(jìn)免疫、降血脂等多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，除此以外，煙葉多肽還具有較好的抗氧化活性^{［3 -7］}，為煙葉的深加工利用和多肽類(lèi)藥物研發(fā)帶來(lái)更多可能性^［8］，各種多肽疫苗、抗腫瘤多肽、診斷多肽等多肽類(lèi)藥品和保健品相繼被開(kāi)發(fā)^［9］。煙葉中蛋白質(zhì)含量較高，煙葉多肽的提取和開(kāi)發(fā)為多肽研究提供了一種新型的研究資源，有利于煙葉資源的深度開(kāi)發(fā)和利用。

近年來(lái)多肽合成發(fā)展迅速，主要使用生物合成法和化學(xué)合成法。生物合成法分別有天然提取法、酶解法、發(fā)酵法等^［10-11］。酶法制備多肽時(shí)，酶的種類(lèi)、用量和酶解條件對(duì)制備的多肽質(zhì)量和純度均具有顯著的影響^［12-13］。江連洲等^［14］采用多種蛋白質(zhì)水解酶對(duì)大豆蛋白進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)經(jīng)堿性蛋白酶水解后的大豆蛋白溶解率較酶解之前的蛋白質(zhì)溶解率高，且蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)也可得到一定程度的改善；王章存等^［15］采用風(fēng)味蛋白酶對(duì)大豆蛋白酶解，酶解后不但降低了大豆蛋白的抗原性，同時(shí)也提高了原有大豆蛋白的乳化性和起泡性，改善了大豆蛋白的加工性能。

基于此，筆者采用酶法輔助水提醇沉法提取煙葉多肽，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化煙葉多肽的提取工藝，并進(jìn)一步研究所提取煙葉多肽的抗氧化活性，為煙葉的藥用價(jià)值和煙葉多肽的藥物開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試材。煙葉，由陜西省商洛市煙草公司提供。

1.1.2 試劑。堿性蛋白酶（河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司）；牛血清蛋白（天津佰瑪科技有限公司）；石油醚（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；考馬斯亮藍(lán)G-250（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；抗壞血酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硫酸亞鐵（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；水楊酸（天津市百世化工有限公司）；過(guò)氧化氫（西安天茂化工有限公司）；DPPH（合肥巴斯夫生物科技有限公司）；試驗(yàn)用水為超純蒸餾水。

1.1.3 儀器。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9240A，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（FW-100，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩（60目，孔徑0.28 mm，浙江省上虞市道墟大亨橋化驗(yàn)儀器廠）；電子天平（TP-313，北京丹佛儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（XY-SYG系列，上海昕?jī)x儀器儀表有限公司）；高速離心機(jī)（TDL-40B，上海安亭科學(xué)儀器廠）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-721，上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理。

選取優(yōu)質(zhì)的煙葉，將其在40 ℃的干燥箱中干燥至恒重，粉碎后過(guò)60目網(wǎng)篩，所得煙葉粉加入石油醚進(jìn)行脫脂處理，離心后收集濾渣，將濾渣在40 ℃條件下再次烘干獲得脫脂粉。將干燥后的煙葉脫脂粉置于錐形瓶中備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。

將牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品精確稱(chēng)量10 mg，然后加水定容至100 mL，在4 ℃貯存。將考馬斯亮藍(lán)G-250精確稱(chēng)量100 mg，加入無(wú)水乙醇50 mL，完全溶解，加HPO溶液100 mL，再用水定容至1 000 mL，搖勻待用。按照表1配制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制完成后，再分別往試管中加入考馬斯亮藍(lán)溶液5 mL，振蕩搖勻，混合后靜置，5 min后測(cè)量波長(zhǎng)595 nm處的吸光度^［16］，以牛血清蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.3 煙葉多肽的提取。

將預(yù)處理的煙葉粉末稱(chēng)取1.0 g于錐形瓶中，根據(jù)設(shè)定的不同底物濃度向其中添加適量的蒸餾水，再加入適量的堿性蛋白酶，振蕩搖勻，調(diào)節(jié)pH，將錐形瓶放在設(shè)定好溫度的水浴鍋中進(jìn)行酶解，浸提結(jié)束后在高溫條件下滅酶10 min，冷卻后過(guò)濾，取其上清液。上清液中加入無(wú)水乙醇，靜置24 h，最后離心（4 000 r/min，30 min）取上清液備用。

1.2.4 煙葉多肽提取量的測(cè)定。

取1 mL煙葉多肽提取液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制方法顯色后，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)量樣品溶液的吸光度。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程求得樣品溶液中的多肽濃度，進(jìn)而可求得樣品中多肽提取量。多肽提取量的計(jì)算公式如下：

多肽提取量（mg/g）=CV/m

式中：C為計(jì)算所得樣品質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為提取液的體積（mL）；m為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.5 單因素試驗(yàn)。

采用酶法輔助水提醇沉法提取煙葉多肽，考察加酶量、酶解pH、酶解時(shí)間、浸提溫度、底物濃度5個(gè)因素對(duì)煙葉多肽提取量的影響，因素和水平見(jiàn)表2。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以煙葉多肽提取量為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，優(yōu)化煙葉多肽的提取工藝。

1.2.7 煙葉多肽抗氧化活性研究。

1.2.7.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定。

用無(wú)水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。將1 mL測(cè)試樣品溶液加至1 mL DPPH溶液中，混勻，室溫下避光靜置30 min后在517 nm處測(cè)定其吸光度（A），同時(shí)測(cè)定1 mL DPPH溶液與1 mL無(wú)水乙醇混合后的吸光度（A），以及1 mL測(cè)試樣品溶液與1 mL無(wú)水乙醇混合后的吸光度（A）。以V（抗壞血酸）作陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)以下公式計(jì)算清除率^［12］：

清除率=［1-（A-A）/A］×100%

1.2.7.2 羥基自由基清除能力的測(cè)定。

取1 mL樣品溶液加入2 mmol/L硫酸亞鐵溶液、6 mmol/L水楊酸溶液、6 mmol/L過(guò)氧化氫溶液各1 mL，混勻，于510 nm處測(cè)定吸光度（A），用蒸餾水代替樣品溶液測(cè)定吸光度（A），用蒸餾水代替不加顯色劑的過(guò)氧化氫溶液測(cè)定吸光度（A）。以V（抗壞血酸）作陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)以下公式計(jì)算清除率^［7］：

清除率=［1-（A-A）/A］×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，在595 nm波長(zhǎng)處，牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，所得一元標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=0.009 1x-0.001 7（R²=0.997 7）。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 加酶量對(duì)煙葉多肽提取量的影響。從堿性蛋白酶添加量對(duì)煙葉多肽提取量的影響（圖2）可以看出，當(dāng)堿性蛋白酶添加量為2 000 U的情況下，煙葉多肽的提取量最低，隨著加酶量的增加，其提取量逐漸增高；當(dāng)堿性蛋白酶添加量為4 000 U時(shí)多肽提取量最高，為82.29 mg/g；隨著堿性蛋白酶添加量繼續(xù)增加，多肽提取量開(kāi)始逐漸下降。這是因?yàn)榈孜锱c酶活性中心達(dá)到了飽和狀態(tài)，繼續(xù)增加酶的用量，對(duì)酶與底物的結(jié)合以及產(chǎn)物的釋放形成空間位阻^［17］。綜上所述，4 000 U的加酶量最佳，選擇加酶量3 000、4 000、5 000 U這3個(gè)水平進(jìn)入響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.2 酶解pH對(duì)煙葉多肽提取量的影響。

從圖3可以看出，在酶解pH為6.0的條件下，煙葉多肽提取量最低，隨著酶解pH的增加，其提取量不斷增大；當(dāng)酶解pH為8.0時(shí)多肽提取量最高，為85.19 mg/g；隨著酶解pH繼續(xù)增加，多肽提取量開(kāi)始下降。這是因?yàn)樵诿附夥磻?yīng)中，每種酶促反應(yīng)均會(huì)有最適酶解pH，過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境均會(huì)使酶的活性下降，影響反應(yīng)速率^［18］。綜上所述，最適酶解pH為8.0，選擇7.0、8.0、9.0這3個(gè)水平的酶解pH進(jìn)入響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)煙葉多肽提取量的影響。

從圖4可以看出，酶解液經(jīng)過(guò)1.0 h浸提后所得煙葉多肽提取量最低，隨著酶解時(shí)間的增加，其提取量不斷增大；當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到2.5 h時(shí)多肽提取量最高，為84.13 mg/g；繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，多肽提取量開(kāi)始下降。這是由于隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解反應(yīng)中蛋白底物被水解得比較徹底，之后酶解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)而多肽提取量并未增加，甚至?xí)r間過(guò)長(zhǎng)影響酶解效果^［19］。綜上所述，酶解時(shí)間控制在2.5 h最好，將酶解時(shí)間固定不進(jìn)入響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.4 浸提溫度對(duì)煙葉多肽提取量的影響。

從圖5可以看出，在浸提溫度為40 ℃時(shí)煙葉多肽提取量最低，隨著浸提溫度升高，其提取量不斷增大；當(dāng)浸提溫度為50 ℃時(shí)多肽提取量最高，為83.74 mg/g；隨著浸提溫度繼續(xù)升高，多肽提取量開(kāi)始下降。這是因?yàn)殡S著溫度的升高，酶活性慢慢增大，酶解的多肽產(chǎn)物增多，但是當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，酶活性會(huì)大大降低，因此酶解的多肽產(chǎn)物減少，多肽提取量下降^［20］。綜上所述，浸提溫度為50 ℃最佳，選擇浸提溫度45、50、55 ℃這3個(gè)水平進(jìn)入響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.5 底物濃度對(duì)煙葉多肽提取量的影響。從圖6可以看出，在底物濃度為1%的條件下，煙葉多肽提取量最低，隨著底物濃度的增加，煙葉多肽提取量不斷增大；當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)多肽提取量最高，為85.48 mg/g；隨著底物濃度繼續(xù)增加，多肽提取量開(kāi)始下降。這是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜餄舛仍黾訒r(shí)，會(huì)增大蛋白酶與底物蛋白的碰撞概率，促進(jìn)蛋白液水解；而當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)大時(shí)，會(huì)極大降低體系中水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，阻礙蛋白酶和底物的擴(kuò)散與運(yùn)動(dòng)，從而對(duì)水解產(chǎn)生一定程度的抑制^［21］。綜上所述，底物濃度為4%最合適，選取底物濃度3%、4%、5%這3個(gè)水平進(jìn)入響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，從5個(gè)因素中選其中的加酶量（因素A）、酶解pH（因素B）、浸提溫度（因素C）、底物濃度（因素D）4個(gè)因素為自變量，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，以煙葉多肽提取量為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定酶法輔助水提醇沉法提取煙葉多肽的最佳工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平如表3所示。

利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行煙葉多肽最佳提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，并依據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)理論，得到的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

2.3.2 方差分析。

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型Y=87.10+3.92A+2.71B-2.59C+2.17D-0.38AB-2.26AC-1.78AD+1.73BC+0.92BD+1.82CD-11.17A²-8.51B²-7.51C²-4.52D²。比較該模型的一次項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值，可以得到4個(gè)因素對(duì)煙葉多肽提取量的影響從大到小依次為A（加酶量）＞B（酶解pH）＞C（浸提溫度）＞D（底物濃度）。從表5可以看出，模型的F=61.87，P＜0.000 1，表明模型極顯著，模型有意義；失擬項(xiàng)F=1.46，P=0.380 3，表明失擬項(xiàng)在該回歸模型中無(wú)顯著性。

2.3.3 交互作用分析。由圖7～10可知，加酶量和浸提溫度、酶解pH和浸提溫度、加酶量和底物濃度、浸提溫度和底物濃度之間的交互作用對(duì)煙葉多肽提取量存在顯著的影響。當(dāng)某一因素確定時(shí)，在另一因素的影響下，煙葉多肽提取量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，可應(yīng)用Design Expert軟件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝。

通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件分析，應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化后系統(tǒng)給出煙葉多肽的最佳提取工藝為加酶量4 174.35 U、酶解pH 8.15、浸提溫度49.20 ℃、底物濃度4.19%、酶解時(shí)間2.5 h，在該提取條件下煙葉多肽提取量理論值為88.05 mg/g。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為便于試驗(yàn)操作，將響應(yīng)面試驗(yàn)分析得出的最佳提取工藝條件調(diào)整成加酶量為4 200 U、酶解pH為8.2、酶解時(shí)間為2.5 h、浸提溫度為49 ℃、底物濃度為4.2%，此為試驗(yàn)工藝條件1。以加酶量為4 000 U、酶解pH為8、酶解時(shí)間為2.5 h、浸提溫度為50 ℃、底物濃度為4%為試驗(yàn)工藝條件2。將2個(gè)提取工藝條件分別重復(fù)試驗(yàn)3次，取煙葉多肽提取量平均值，試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

從驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（表6）可以看出，組合1響應(yīng)面優(yōu)化的最佳提取工藝所得煙葉多肽提取量為88.23 mg/g，與理論值（88.05 mg/g）相比較為接近，充分表明采用響應(yīng)面方法優(yōu)選出的多肽提取工藝參數(shù)是切實(shí)可行的。組合2響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)重復(fù)組所得煙葉多肽提取量平均值為87.09 mg/g，系統(tǒng)所得提取工藝明顯優(yōu)于此工藝條件，由此說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化得到的煙葉提取工藝是有效的。

2.5 煙葉多肽的抗氧化活性研究

2.5.1 煙葉多肽對(duì)DPPH自由基的清除作用。

從圖11可以看出，隨著樣品濃度的增加，抗壞血酸、煙葉多肽對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸增加，當(dāng)煙葉多肽提取液濃度達(dá)到20%時(shí)，煙葉多肽對(duì)DPPH自由基的清除率為83.09%，說(shuō)明煙葉多肽對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力。

2.5.2 煙葉多肽對(duì)羥基自由基的清除作用。

從圖12可以看出，隨著樣品濃度的增加，抗壞血酸、煙葉多肽對(duì)羥基自由基的清除率逐漸增加，當(dāng)煙葉多肽提取液濃度達(dá)到20%時(shí)，煙葉多肽對(duì)羥基自由基的清除率為73.84%，說(shuō)明煙葉多肽對(duì)羥基自由基具有一定的清除能力。

3 結(jié)論與討論

該研究以煙葉為原料，采用酶法輔助水提醇沉法提取煙葉多肽，應(yīng)用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)煙葉多肽的最佳提取工藝進(jìn)行研究。最終得到煙葉多肽的最佳提取工藝是加酶量4 200 U、酶解pH 8.2、酶解時(shí)間2.5 h、浸提溫度49 ℃、底物濃度4.2%，在該條件下，所得煙葉多肽提取量為88.23 mg/g，該提取液對(duì)DPPH自由基、羥基自由基的清除率分別可達(dá)到83.09%、73.84%，由此說(shuō)明最佳工藝所得煙葉多肽具有良好的抗氧化活性。

該研究應(yīng)用酶法輔助水溶醇沉法提取煙葉多肽，與黃越^［22］所研究的食用菌多肽相比較為簡(jiǎn)單，關(guān)于煙葉多肽更系統(tǒng)、更深入的研究還沒(méi)有展現(xiàn)，以后對(duì)煙葉多肽的提取需要更進(jìn)一步、更深層次的研究，而且該研究使用堿性蛋白酶提取煙葉多肽與尹佳等^［23］其他有關(guān)酶法提取植物多肽的相關(guān)資料相比使用的酶種類(lèi)單一，為煙葉多肽提取的研究提供了一定的理論依據(jù)。

目前煙葉多肽提取的研究還處于最基礎(chǔ)的階段，后面還需要對(duì)煙草多肽的制備、分離、純化工藝、多肽的改性等方面進(jìn)行深入研究，并對(duì)其生理功能、構(gòu)效關(guān)系、作用機(jī)理進(jìn)行深入探討，研究制備優(yōu)質(zhì)的煙葉多肽功能性食品及藥品等。未來(lái)更需要不斷優(yōu)化煙葉多肽的提取工藝，使其可以大規(guī)模的生產(chǎn)，創(chuàng)新研發(fā)煙葉多肽類(lèi)產(chǎn)品，提高煙草資源利用率，創(chuàng)造更多的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

該研究采用堿性蛋白酶提取煙葉多肽，堿性蛋白酶其本身具有較強(qiáng)的分解蛋白質(zhì)的能力，在最佳的反應(yīng)條件下可以

更快速、更高效地提高煙葉多肽的提取，利用響應(yīng)面法所優(yōu)

化的提取工藝，與許春平等^［24］對(duì)煙葉蛋白的水解相比較所提取煙葉多肽具有更強(qiáng)的抗氧化性，與夏吉安等^［25］所研究的提取工藝時(shí)間較短、更加節(jié)省試驗(yàn)成本，可以為開(kāi)發(fā)抗氧化活性肽、多肽類(lèi)藥物和抗氧化食品等提供技術(shù)指導(dǎo)，也為提高煙草利用率、促進(jìn)煙草多肽的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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