摘要 為探究黑漆實(shí)蠅線粒體基因組基因結(jié)構(gòu)，基于測(cè)定的黑漆實(shí)蠅的線粒體全基因組，采用DNAMAN V6 軟件測(cè)算線粒體全基因組13個(gè)蛋白編碼基因（PCGs），22個(gè)trnA基因AT skew =（A-T）/（A+T）、GC skew=（G-C）/（G+C）的值，分析黑漆實(shí)蠅核苷酸的偏移率；使用Win32 CodonW軟件分析蛋白質(zhì)基因密碼子的使用個(gè)數(shù)以及同義相對(duì)密碼子RSCU值的使用頻率；利用MITOS WebServer和tRNAscan-SE 2.0軟件對(duì)trnA的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為物種診斷、系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化生物學(xué)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 黑漆實(shí)蠅；線粒體全基因組；相對(duì)密碼子使用頻率；trnA基因二級(jí)結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào) S433 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）19-0077-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.19.017

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Mitochondrial Gene Structure Analysis of Bactrocera （Zeugodacus） scutellaris

HUANG Zhen¹，GUO Qiong-xia²

（1.Changle Airport Customs of Fuzhou，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350209;2.Fuzhou Customs Technology Center，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350001）

Abstract In order to explore the mitochondrial genome gene structure of Bactrocera（Zeugodacus）scutellaris，based on the measured mitochondrial whole genome of B.（Z.）scutellaris，the values of ATskew =（A-T）/（A+T）and GC skew =（G-C）/（G + C）of 13 protein-coding genes（PCGs）and 22 trnA genes in the whole mitochondrial genome were measured by DNAMAN V6 software.Win32 CodonW software was used to analyze the number of protein gene codons and the frequency of synonymous relative codon RSCU values.MITOS WebServer and trnAscan-SE 2.0 software were used to analyze the secondary structure of trnA，providing evidence for species diagnosis，phylogeny and evolutionary biology.

Key words Bactrocera （Zeugodacus） scutellaris;Mitochondrial whole genome;Relative codon usage frequency;Secondary structure of trnA gene

基金項(xiàng)目 福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011J01066，2012JO1061）;福州海關(guān)科研項(xiàng)目（FK2022-09）。

作者簡(jiǎn)介 黃振（1985—），男，福建莆田人，高級(jí)農(nóng)藝師，從事植物檢疫研究。*通信作者，研究員，從事植物檢疫研究。

收稿日期 2023-10-25

黑漆實(shí)蠅［Bactrocera（Z.）scutellaris Bezzi］屬雙翅目（Diptera）實(shí)蠅科（Tephritidae）果實(shí)蠅屬（Bactrocera）。果實(shí)蠅屬主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，主要危害果蔬，是危險(xiǎn)性極高并可對(duì)果蔬生產(chǎn)與貿(mào)易造成巨大影響的有害生物之一，在果實(shí)蠅的自然分布或流行區(qū)，寄主作物果實(shí)被害率可達(dá) 10％～80％^［1］，是世界各個(gè)國(guó)家或地區(qū)農(nóng)業(yè)檢疫部門重點(diǎn)關(guān)注和阻截的危險(xiǎn)性害蟲^［2］。近年來，果實(shí)蠅屬害蟲在口岸進(jìn)境果蔬物品檢疫中經(jīng)常被截獲，由于危害性大，形態(tài)相似，鑒定困難，是具有重要經(jīng)濟(jì)意義的危險(xiǎn)性害蟲，因此果實(shí)蠅屬現(xiàn)已成為國(guó)際上許多國(guó)家的研究重點(diǎn)^［3-4］。線粒體基因組作大多數(shù)為環(huán)狀閉合雙鏈DNA，昆蟲線粒體基因組的組成包含從基本的分子序列到全部的基因組結(jié)構(gòu)，具有排列相對(duì)保守，基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，進(jìn)化速率快，高拷貝以及物種內(nèi)基因幾乎不發(fā)生重組的母系遺傳特點(diǎn)。線粒體具有自己的線粒體基因組^［5］，為完整的細(xì)胞器，基因組具有比核基因組更高的突變率，具有強(qiáng)大的遺傳功能^［6］。隨著DNA測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，線粒體基因組成為研究動(dòng)物起源進(jìn)化及群體遺傳分化的理想對(duì)象及一種重要的分子標(biāo)記技術(shù)手段^［7］，被用于不同分類水平的物種鑒定、生物遺傳進(jìn)化、分子標(biāo)記和系統(tǒng)發(fā)育研究，也是區(qū)別形態(tài)相似的近緣種的有用工具，目前被廣泛用于物種，尤其是同屬近緣種的分類鑒定、種間的分子進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系等研究^［8-9］。越來越多昆蟲種類的線粒體全基因組被測(cè)序^［10］。筆者基于線粒體全基因組測(cè)序技術(shù)，對(duì)具有重要經(jīng)濟(jì)意義的重要種類B.（Z.）scutellaris的線粒體全基因組進(jìn)行了測(cè)定與基因基本結(jié)構(gòu)、核苷酸含量、蛋白質(zhì)密碼子的使用頻率及trnA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析^［11-13］，以期為黑漆實(shí)蠅的物種鑒定、生物遺傳進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育和分子鑒定提供更有價(jià)值的信息和依據(jù)。

1 樣品與方法

1.1 供試的樣品

供試樣品為B.（Z.）scutellaris的線粒體序列，來自云南口岸，成蟲采用形態(tài)分類的方法進(jìn)行鑒定，樣品放置于-20 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 偏移率的測(cè)算。

利用已測(cè)定的黑漆實(shí)蠅全基因組序列，基于DNAMAN V6測(cè)算AT skew=（A- T）/（A+T）、GC skew=（G-C）/（G+C）的值，分析黑漆實(shí)蠅全基因組、蛋白質(zhì)、trnA基因核苷酸及其J和N編碼鏈核苷酸AT skew、GCskew的偏移。

1.2.2 蛋白質(zhì)密碼子的使用頻率。

使用Win32 CodonW對(duì)黑漆實(shí)蠅全基因組序列的13個(gè)蛋白質(zhì)基因密碼子的使用個(gè)數(shù)以及同義相對(duì)密碼子RSCU值的使用頻率進(jìn)行分析。

1.2.3 trnA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

采用MITOS WebServer和tRNAscan-SE 2.0對(duì)黑漆實(shí)蠅全基因組序列的22個(gè)trnA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組序列核苷酸的偏移率

黑漆實(shí)蠅線粒體基因組總序列為15 919 bp（GenBank登錄號(hào)為：MW 892725），核苷酸A、C、G、T的含量分別為39.1%、16.2%、9.9%、34.3%，表現(xiàn)為A>T>C>G，線粒體基因組序列核苷酸A+T含量為73.4%，其中蛋白質(zhì)編碼基因PCGs、trnA基因、rRNA基因、非編碼控制區(qū)A+T的含量分別為71.8%、74.4%、78.0%和78.4%，存在A、T堿基偏向性^［14］。通過對(duì)黑漆實(shí)蠅全基因組核苷酸偏移率：AT skew =（A-T）/（A+T）、GC skew=（G-C）/（G+C）測(cè)算，黑漆實(shí)蠅線粒體基因組全序列的AT skew偏斜為正值（0.065），GC skew偏斜為負(fù)值（-0.241），表明基因組序列中A堿基和C堿基的百分比含量分別高于T堿基和G堿基，這種現(xiàn)象與大部分昆蟲的線粒體基因組 AT／GC偏斜一致^［15］；PCGs的 AT偏移率 J鏈為 -0.066，高于N鏈-0.277；GC Skew N鏈為0.344，高于J鏈 -0.195；trnA基因AT Skew J 鏈為 0.008，高于N鏈 -0.045，GC Skew N鏈為0.306，高于J鏈-0.008。因此，PCGs和trnA基因均存在AT向J鏈偏移，GC向N鏈偏移，與J鏈和N鏈堿基組成偏向性結(jié)果一致，這2條鏈之間存在核苷酸組成與AT偏斜、GC 偏斜，符合大多數(shù)昆蟲線粒體基因組基本的堿基規(guī)律。核苷酸組成不對(duì)稱性的現(xiàn)象表現(xiàn)了后生動(dòng)物線粒體全基因組的顯著特征^［16］。黑漆實(shí)蠅線粒體全基因組核苷酸組成見表1。

2.2 蛋白質(zhì)編碼基因

黑漆實(shí)蠅線粒體全基因組13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因序列總長(zhǎng)11 301 bp，A+T總含量為71.8%，J編碼鏈為6 897 bp，N編碼鏈核苷酸為4 404 bp；13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因包含 3 754個(gè)密碼子，J鏈含有2 290個(gè)，N鏈含有1 464個(gè)，使用頻率最高的密碼子為：第 2位點(diǎn)為 U和第 3位點(diǎn)為U或A；相對(duì)同義密碼子RSCU值的使用頻率大于1的有28個(gè)，其中第 3位點(diǎn)均為U或 A；在所有22種氨基酸的密碼子中，UUA（L）的使用頻率 N及相對(duì)密碼子RSCU使用頻率均最高，分別為368和3.68，其次為AUU（I），N、RSCU分別為278、1.66，UUU（F），N、RSCU分別為239、1.44；密碼子組成前 4位的氨基酸占總量的39.00%，4種氨基酸含量分別為：亮氨酸（Leu）600個(gè)（15.98%）>異亮氨酸（Ile）335個(gè)（8.92%）>苯丙氨酸（Phe）333個(gè)（8.87%） >絲氨酸（Ser）226個(gè)（5.23%）；20種氨基酸中半胱氨酸（Cys）47個(gè)（2%），含量為最低。每種氨基酸使用頻繁的密碼子為NNA和NNU，反映核苷酸組成AT偏好性^［17］。黑漆實(shí)蠅線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因密碼子使用統(tǒng)計(jì)見表2。

2.3 trnA基因

黑漆實(shí)蠅線粒體全基因組共22個(gè)trnA基因，序列長(zhǎng)度在63～72 bp，總長(zhǎng)度1 471 bp，通過對(duì)黑漆實(shí)蠅線粒體全基因組trnA基因二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，trnA基因二級(jí)結(jié)構(gòu)中，除精氨酸（R）和苯丙氨酸（F）缺少假尿嘧啶（T）環(huán)以及絲氨酸（S1）缺少二氫尿嘧啶（DHU）環(huán)外，其余 19個(gè)trnA基因均能折疊形成典型三葉草二級(jí)結(jié)構(gòu)圖。線粒體基因組 22個(gè) trnA基因中，共存在20處堿基對(duì)錯(cuò)配，錯(cuò)配均為G-U，其中8處錯(cuò)配分別位于trnA、trnC、trnE、trnF、trnP、trnS1的氨基酸接受臂，2處位于trnN、trnT的假尿嘧啶臂，10處位于trnD、trnQ、trnG、trnH、trnF、trnP、trnS1、trnY的二氫尿嘧啶臂^［18-19］。黑漆實(shí)蠅線粒體22個(gè)trnA的三葉草結(jié)構(gòu)見圖1。

3 小結(jié)與討論

黑漆實(shí)蠅線粒體全基因A+T含量為73.4%，PCGs 為71.8%，A、T堿基偏向性，AT偏斜為正值，GC偏斜多為負(fù)值。其中蛋白質(zhì)編碼基因PCGs、rRNA基因、trnA基因、非編碼控制區(qū)A+T的含量分別為71.8%、74.4%、78.0%和78.4%，黑漆實(shí)蠅均存在堿基AT 含量明顯高于GC，存在AT的偏向性，符合大多數(shù)線粒體基因組基本的堿基規(guī)律，這一特征與后生動(dòng)物典型的線粒體基因組AT偏移相一致；通過偏移率計(jì)算，黑漆實(shí)蠅的線粒體基因組AT 為0.065，為正值，GC為-0.241，這一特征和其他實(shí)蠅線粒體基因組的序列具有相似性^［20］。

黑漆實(shí)蠅線粒體全基因包含13個(gè)蛋白質(zhì)基因，其蛋白質(zhì)基因共包含3 754個(gè)密碼子，J鏈含有2 290個(gè)，N鏈含有1 464個(gè)，從密碼子使用的個(gè)數(shù)和相對(duì)同義密碼子的使用頻率統(tǒng)計(jì)分析，每種氨基酸對(duì)應(yīng)有1～6 種不同的同義密碼子。盡管密碼子具有簡(jiǎn)并性，但每種氨基酸密碼子第3位點(diǎn)的堿基組成較高的為A和T，相對(duì)同義密碼子的使用頻率RSCU大于 1的密碼子，其第3位點(diǎn)也均為 A或 T。這種偏好與A+T 較高和偏移相適應(yīng)，其可能是由于線粒體基因組A+T含量相對(duì)較高所造成的偏移的突變壓所引起，即在核苷酸水平上GC至AT的正向突變大于回復(fù)突變^［21］。

黑漆實(shí)蠅線粒體全基因組22個(gè)trnA中，trnA基因二級(jí)結(jié)構(gòu)中，除精氨酸（R）和苯丙氨酸（F）缺少假尿嘧啶（T）環(huán)以及絲氨酸（S1）缺少二氫尿嘧啶DHU環(huán)外，其余 19個(gè)trnA基因均能折疊形成典型三葉草二級(jí)結(jié)構(gòu)圖。線粒體基因組 22個(gè) trnA基因中，共存在20處堿基對(duì)錯(cuò)配，錯(cuò)配均為G-U，這表明 G-U配對(duì)在線粒體基因組中很可能是一種正常的配對(duì)形式^［22］。

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