摘 要：為實(shí)現(xiàn)肉制品中大鼠和小鼠源性成分的同步檢測，基于實(shí)時(shí)熒光重組酶輔助擴(kuò)增（real-time recombinase-aided amplification，Rt-RAA）技術(shù)，以大鼠COX3基因和小鼠16S rRNA基因序列保守區(qū)域?yàn)榘袠?biāo)，分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的Rt-RAA引物和探針，通過反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化確定最佳雙重Rt-RAA檢測反應(yīng)條件。進(jìn)一步對建立的雙重Rt-RAA檢測方法進(jìn)行特異性、靈敏度及穩(wěn)定性評估，并應(yīng)用該方法對模擬市售肉制品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，所建立的雙重Rt-RAA檢測方法特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，大鼠和小鼠源性成分的檢出限分別為0.5%和0.2%，同步檢測2 種源性成分檢出限為0.5%，同步檢測混合模擬市售樣品檢出限仍低至0.5%，雙重Rt-RAA與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對市售樣品和模擬樣品檢測結(jié)果高度一致。因此，本研究建立的雙重Rt-RAA檢測方法適用于大鼠和小鼠源性成分的檢測，為肉制品摻假檢測提供了一種快捷、高效及準(zhǔn)確的新方法。

關(guān)鍵詞：大鼠；小鼠；肉制品；實(shí)時(shí)熒光重組酶輔助擴(kuò)增技術(shù)；肉制品摻假

Rapid Detection of Mouse-Derived Components in Meat Products by Duplex Real-Time Recombinase-Aided Amplification

LIU Mingming， ZHOU Zhaoxu， YAN Haiyan， TIAN Biying， LI Genrong*

（National Center of Quality Supervision & Inspection Agricultural Processed Products and Condiments，

Chongqing Academy of Metrology and Quality Inspection， Chongqing 400020， China）

Abstract： In this study， real-time recombinase-aided amplification （Rt-RAA） was used for the synchronous detection of rats- and mice-derived components in meat products. Primers and probes targeting the conserved sequences of the COX3 gene in rats and those of the 16S rRNA gene in mice were designed. The reaction parameters were optimized to establish the optimal reaction conditions for duplex Rt-RAA detection. Furthermore， the specificity， sensitivity and stability of the established duplex Rt-RAA method were evaluated， and it was applied to simulated commercial meat products. The results showed that this method had strong specificity and stability. The detection limits for rats- and mice-derived components were 0.5% and 0.2%， respectively. The detection limits for their synchronous detection were both 0.5%， and the detection limits for synchronous detection of rats- and mice-derived components mixed in simulated commercial meat samples were still as low as 0.5%. Using duplex Rt-RAA and real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （real-time PCR）， highly consistent results were obtained for commercially available samples and simulated samples. Therefore， the duplex Rt-RAA method is suitable for the detection of rats- and mice- derived components in meat products， providing a fast， efficient， and accurate new method for the detection of meat product adulteration.

Keywords： rats; mice; meat products; real-time recombinase-aided amplification; meat product adulteration

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240522-122

中圖分類號：TS251.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）09-0015-06

引文格式：

劉明明， 周朝旭， 顏海燕， 等. 利用雙重實(shí)時(shí)熒光重組酶輔助擴(kuò)增技術(shù)快速檢測肉制品中鼠源性成分[J]. 肉類研究， 2024， 38（9）： 15-20. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240522-122. http：//www.rlyj.net.cn

LIU Mingming， ZHOU Zhaoxu， YAN Haiyan， et al. Rapid detection of mouse-derived components in meat products by duplex real-time recombinase-aided amplification[J]. Meat Research， 2024， 38（9）： 15-20. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240522-122. http：//www.rlyj.net.cn食品摻假是指在未注明標(biāo)簽的情況下，添加或減少某些改變食品成分、影響營養(yǎng)價(jià)值甚至不被社會(huì)接受的物質(zhì)[1]。目前，肉制品是提供人體氨基酸和蛋白質(zhì)等必需營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源之一，隨著國內(nèi)外生活水平的不斷提升，其消耗量逐年遞增，一些制造商為追逐更高利潤，用廉價(jià)肉代替或摻入優(yōu)質(zhì)肉類但并未注明標(biāo)簽進(jìn)行銷售，如在牛肉產(chǎn)品中摻加馬肉和豬肉[2]、羊肉產(chǎn)品中摻加鼠肉[3]等。故肉類摻假不僅使消費(fèi)者利益受損，且威脅健康，特別是鼠肉，因鼠類對生存環(huán)境要求較低，常攜帶大量病毒，且可能食用毒鼠藥物中毒[4]。因此，不真實(shí)的肉制品標(biāo)簽可能避開檢驗(yàn)檢疫，使人畜共患的病毒傳入人體，造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)[5]。雖然我國的食品安全監(jiān)管部門對于肉類摻假方面嚴(yán)格篩查，但相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)仍有待完善[6]，尤其是鼠肉這種特殊成分的鑒定。此外，現(xiàn)有的檢測方法難以滿足肉類快速消費(fèi)下大批量產(chǎn)品的檢測需求。因此，亟需建立快速、有效、準(zhǔn)確和高通量的檢測技術(shù)，以防止摻假肉制品的非法銷售。

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）是大多數(shù)生物體的遺傳物質(zhì)，相比于蛋白質(zhì)具有更高的穩(wěn)定性和特異性，因此基于DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)在現(xiàn)有的肉類摻假檢測方法中應(yīng)用最為廣泛[7]，如傳統(tǒng)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，real-time PCR）和數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）等[8-9]。傳統(tǒng)PCR技術(shù)具有操作簡單、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，但其檢測時(shí)間長且不能定量分析。雖然real-time PCR和dPCR實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)定量或定性檢測，但其設(shè)備昂貴，對人員專業(yè)程度要求較高[10-11]。近年來，隨著等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的發(fā)展，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)已被應(yīng)用于加工肉制品中肉的種類鑒定[12]，該技術(shù)在恒溫條件下可擴(kuò)增目標(biāo)DNA，但需4～6 條擴(kuò)增引物，易出現(xiàn)假陽性，且擴(kuò)增時(shí)間長（1 h以上）[13]。

實(shí)時(shí)熒光重組酶輔助擴(kuò)增（real-time recombinase- aided amplification，Rt-RAA）作為近年來新興的擴(kuò)增技術(shù)，克服了傳統(tǒng)PCR等PCR技術(shù)檢測時(shí)間長且需依賴變溫儀器的缺點(diǎn)，在恒溫條件下即可實(shí)時(shí)快速擴(kuò)增目的DNA[14]。此外，相比于LAMP，Rt-RAA僅需1 對引物和1 條中間修飾的探針，避免了因引物二聚體導(dǎo)致的假陽性。因其具有恒溫、快速、準(zhǔn)確及操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，在本研究中基于Rt-RAA檢測技術(shù)建立同步鑒定大鼠、小鼠源性成分的檢測方法，并評估其特異性、靈敏度和穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)這2 種成分在肉制品中的快速檢測，旨在為肉類摻假提供更有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠、小鼠活體購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。鴨肉、牛肉、馬肉、羊肉、豬肉、雞肉、鵝肉購自當(dāng)?shù)兀ㄖ貞c）超市，除馬肉外其他通過外觀確認(rèn)。馬肉與購自京東和淘寶的駱駝肉、馬鹿肉、梅花鹿肉、驢肉的真實(shí)性通過相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定。

RAA熒光核酸擴(kuò)增試劑盒 杭州眾測生物科技有限公司；通用型核酸提取試劑盒 成都TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JXFSTPRP-32組織研磨儀 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；CFX96 Touch熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；Nanodrop ONEc超微量分光光度計(jì) 美國Thermo Scientific公司；ME403千分之一電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；GR85DA高壓滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

羊肉、豬肉、牛肉作為日常食用的肉類，并且為紅肉，與鼠肉相似，故本研究將此3 種鮮肉充分粉碎混合作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)樣本基底肉（以下稱基底肉）。將基底肉與大鼠和小鼠肉按照不同的質(zhì)量比進(jìn)行混合，以確定混合肉制品中大鼠和小鼠源性成分檢出限。

實(shí)際的深加工或熟肉制品（如肉串、火腿腸等）中，通常存在多種肉混合的情況。為了模擬檢測市售深加工或熟肉制品，將新鮮的羊肉、豬肉、牛肉與大鼠和小鼠肉按照不同的質(zhì)量比進(jìn)行混合，并通過高壓滅菌鍋121 ℃、20 min進(jìn)行高壓蒸熟處理。

1.3.2 樣本DNA提取

參考試劑盒使用說明書進(jìn)行提取，取25～100 mg組織樣本置于含鋼珠的離心管中，將裂解液加入其中進(jìn)行充分研磨，隨后加入相應(yīng)的蛋白酶和RNA酶于56 ℃水浴鍋中至樣品組織完全溶解，后續(xù)通過吸附、離心、洗滌和洗脫得到總基因組DNA。采用超微量分光光度計(jì)在260 nm和280 nm波長處測定DNA濃度和純度，將純度（A260 nm/A280 nm）為1.7～1.9的樣本基因組DNA稀釋至約150 ng/mL，并于－20 ℃保存，備用。

1.3.3 雙重Rt-RAA引物、探針設(shè)計(jì)與合成

基于小鼠16S rRNA基因序列（序列號：GU332589.2）和大鼠細(xì)胞色素c氧化酶亞基III（cytochrome c coxidase subunit III，COX3）基因（基因ID：26204），根據(jù)Rt-RAA引物和探針設(shè)計(jì)原則，使用Snap Gene軟件設(shè)計(jì)大鼠、小鼠特異性引物各1 對，從引物區(qū)間擴(kuò)增子序列區(qū)域設(shè)計(jì)RAA探針各1 條（表1）。引物和探針均由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3.4 大鼠和小鼠雙重Rt-RAA檢測條件

首先對雙重Rt-RAA方法的引物和探針濃度、反應(yīng)溫度等檢測條件進(jìn)行測試與優(yōu)化。通過Rt-RAA核酸擴(kuò)增試劑（熒光型）說明書運(yùn)行程序，測試雙重Rt-RAA反應(yīng)體系中不同的引物和探針濃度，最終優(yōu)化得到最佳反應(yīng)體系包括400 nmol/L COX3-F、-R引物，200 nmol/L COX3-P探針，200 nmol/L 16S rRNA-F、-R引物，60 nmol/L

16S rRNA-P探針，25 μL水化緩沖液，2.5 mL MgAc緩沖溶液（280 mmol/L），DNA模板各1 μL，用雙蒸水補(bǔ)齊至50 μL。在此體系下，設(shè)置31～41 ℃的溫度梯度進(jìn)行反應(yīng)，最終確立39 ℃為最佳反應(yīng)溫度。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行。

雙重Rt-RAA檢測條件反應(yīng)程序?yàn)椋?0 s/循環(huán)，40 個(gè)循環(huán)。

1.3.5 雙重Rt-RAA特異性實(shí)驗(yàn)

按照1.3.4節(jié)確立的最終雙重Rt-RAA檢測條件，對建立的方法進(jìn)行特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以提取的鴨肉、牛肉、馬肉、羊肉、豬肉、雞肉、鵝肉、駱駝肉、馬鹿肉、梅花鹿肉及驢肉DNA為特異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的非目標(biāo)擴(kuò)增序列，以大鼠肉和小鼠肉的DNA為陽性對照，并用雙蒸水作為空白對照，以確定所建立方法的特異性。

1.3.6 雙重Rt-RAA靈敏度實(shí)驗(yàn)

將大鼠肉和小鼠肉分別與基底肉混合，制成大鼠肉和小鼠肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)均分別為20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0%的2 組混合模擬樣品，按照1.3.2節(jié)提取DNA，按照1.3.4節(jié)最佳反應(yīng)條件及反應(yīng)程序進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，以確定所建立的方法分別對大鼠肉、小鼠肉的檢測靈敏度和同步檢測大鼠肉、小鼠肉的靈敏度，并與BJS 201904《食品中多種動(dòng)物源性成分檢測實(shí)時(shí)熒光PCR法》中real-time PCR方法檢測靈敏度進(jìn)行對比。

1.3.7 雙重Rt-RAA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

以1.3.6節(jié)確定的大鼠肉、小鼠肉的檢出限進(jìn)行6 次平行實(shí)驗(yàn)，按照1.3.4節(jié)最佳反應(yīng)條件及反應(yīng)程序進(jìn)行雙重Rt-RAA擴(kuò)增，以確定該檢測方法的穩(wěn)定性。

1.3.8 模擬市售樣品實(shí)驗(yàn)

按照1.3.1節(jié)方法制備1.3.6節(jié)質(zhì)量比模擬樣品，制得同時(shí)含有大鼠肉和小鼠肉且各自所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0%的7 種混合模擬市售熟肉制品，按照1.3.2節(jié)提取DNA，按照1.3.4節(jié)最佳反應(yīng)條件及反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，以確定該方法對實(shí)際樣品中大鼠肉、小鼠肉同步檢檢測的可靠性。

1.3.9 市售樣品和模擬樣品實(shí)驗(yàn)

在燒烤店和燒烤擺位購買25 份樣品，按照1.3.1節(jié)方法制作模擬樣品，大鼠、小鼠肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為0.5%。按照1.3.2節(jié)提取DNA，利用本研究建立的雙重Rt-RAA方法和real-time PCR方法進(jìn)行鼠源性成分檢測，對比分析并評價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用PowerPoint軟件作圖。采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重Rt-RAA檢測條件的建立與優(yōu)化

本研究主要對引物和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，最大限度地提高雙重Rt-RAA檢測方法擴(kuò)增效率。如表2所示，在雙重反應(yīng)體系中大鼠和小鼠的引物（400 nnmol/L）和探針（120 nmol/L）濃度相同的條件下，小鼠的熒光擴(kuò)增曲線對大鼠的熒光擴(kuò)增曲線表現(xiàn)出一定的抑制。因此，通過降低小鼠的引物和探針濃度，并增加大鼠的引物和探針濃度，對雙重?cái)U(kuò)增體系進(jìn)行優(yōu)化。最終確定小鼠的引物和探針濃度分別為200 nmol/L和60 nmol/L，大鼠的引物和探針濃度分別為400 nmol/L和200 nmol/L，并得到雙重Rt-RAA最佳檢測循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）值。

為了優(yōu)化雙重Rt-RAA檢測方法反應(yīng)溫度，在31～41 ℃進(jìn)行溫度梯度實(shí)驗(yàn)。如表3所示，在31～39 ℃，隨著溫度的升高，檢測大鼠和小鼠的Ct值逐漸降低。在41 ℃時(shí)，熒光擴(kuò)增曲線則呈現(xiàn)出延遲，其中大鼠延遲幅度最大。因此，為了使雙重Rt-RAA方法實(shí)現(xiàn)快速檢測，將39 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。

2.2 雙重Rt-RAA的檢測特異性

按照優(yōu)化的檢測條件對雙重Rt-RAA方法進(jìn)行特異性驗(yàn)證。如圖1所示，提取的鴨肉、牛肉、馬肉、羊肉、豬肉、雞肉、鵝肉、駱駝肉、馬鹿肉、梅花鹿肉及驢肉等非目標(biāo)DNA和空白對照均未出現(xiàn)擴(kuò)增，只有大鼠和小鼠樣品DNA出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線，表明雙重Rt-RAA檢測方法具有良好的特異性。

2.3 雙重Rt-RAA的檢測靈敏度

如圖2所示，大鼠和小鼠源性成分的檢測靈敏度分別為0.5%和0.2%。

A.檢測大鼠源性成分靈敏度；B.檢測小鼠源性成分靈敏度。

根據(jù)其檢測靈敏度，仍以羊肉、豬肉、牛肉粉碎混合作為基底肉，制備同時(shí)含有大鼠肉和小鼠肉，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)均分別為5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0%的6 種混合樣品，結(jié)果表明，利用雙重Rt-RAA方法同步檢測大鼠和小鼠源性成分的靈敏度仍低至0.5%（圖3A），real-time PCR方法檢測靈敏度則為2%（圖3B）。表明本研究建立的鼠源性雙重Rt-RAA檢測方法靈敏度較傳統(tǒng)的real-time PCR檢測方法得到進(jìn)一步的提升，為檢測更低質(zhì)量比鼠源性成分提供了新的方法。

A.雙重Rt-RAA方法；B. real-time PCR方法。

2.4 雙重Rt-RAA的檢測穩(wěn)定性

為了確定雙重Rt-RAA方法同步檢測大鼠和小鼠源性成分的穩(wěn)定性，本研究對同時(shí)含有大鼠肉與小鼠肉且各自所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為0.5%的模擬樣品進(jìn)行同步檢測。如圖4

所示，對設(shè)置的6 個(gè)平行，均能同步擴(kuò)增出大鼠和小鼠DNA，表明所建立的雙重Rt-RAA方法具有良好的穩(wěn)定性。

2.5 模擬市售樣品測定結(jié)果

如圖5所示，本方法對于大鼠肉和小鼠肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的混合模擬市售熟肉制品仍能檢出大鼠和小鼠源性成分。因此，表明本研究所建立的雙重Rt-RAA方法可用于實(shí)際檢測。

2.6 市售樣品和模擬樣品測定結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證本研究所建立的檢測方法的適用性，用雙重Rt-RAA方法和BJS 201904中real-time PCR方法對25 份市售樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果高度一致，如表4所示。由于檢出陽性樣本數(shù)較少，在實(shí)驗(yàn)中增加了模擬樣品進(jìn)行對比檢測，2 種方法檢測結(jié)果符合率為100%。

3 討論與結(jié)論

在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，肉制品摻假屢禁不絕，不僅給消費(fèi)者帶來經(jīng)濟(jì)損失，且可能會(huì)對身體造成危害和引發(fā)疫病傳染風(fēng)險(xiǎn)[15]。從歐洲的“馬肉風(fēng)波”至近年來被曝光的亞洲“鼠肉丑聞”事件，肉制品的摻假問題已經(jīng)成為社會(huì)公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，其摻假檢測技術(shù)也在不斷趨于完善。DNA作為絕大多數(shù)生物體遺傳物質(zhì)，具有高穩(wěn)定性和保守性的特點(diǎn)，基于此建立的PCR檢測技術(shù)[16]、real-time PCR檢測技術(shù)[17]及等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[18]等逐漸成為動(dòng)物源性成分檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。目前，Ahamad等[19]建立多重PCR以區(qū)分兔肉、大鼠肉和松鼠肉。Suryawan等[20]基于細(xì)胞色素b（Cytb）基因開發(fā)了單重PCR方法，特異性檢出印尼牛肉丸中的大鼠源性成分。王學(xué)政等[21]同樣通過Cytb基因序列，設(shè)計(jì)針對鼠源性成分的熒光PCR法特異性引物。Duan Siqi等[4]建立并驗(yàn)證一種基于物種特異性PCR技術(shù)快速鑒別肉制品中鼠肉真?zhèn)蔚脑噭┖?。陳珍金等[22]分別開發(fā)了大鼠和小鼠源性成分的LAMP檢測技術(shù)，用于羊肉制品中鼠源性成分的檢測。然而，基于雙重Rt-RAA技術(shù)同步檢測大鼠和小鼠源性成分的技術(shù)鮮見報(bào)道。

鼠類是一種嚙齒類哺乳動(dòng)物，繁殖速度快、數(shù)量多，對生存環(huán)境要求低，生命力強(qiáng)。常攜帶流感病毒、冠狀病毒及尼帕病毒等[23]，嚴(yán)重威脅消費(fèi)者健康。鼠肉為紅肉，摻入可食用的肉及肉制品中難以通過外觀判斷。此外，復(fù)雜的樣品基質(zhì)相互干擾，對于檢測的準(zhǔn)確度和特異性同樣產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。隨著人們對于肉制品的需求不斷增加，已報(bào)道的鼠源性成分檢測方法難以滿足大批量的檢測。

Rt-RAA是一種基于重組酶、DNA聚合酶及單鏈DNA結(jié)合蛋白3 種關(guān)鍵因子，在恒溫條件下通過核酸外切酶（exonuclease，exo）探針實(shí)時(shí)監(jiān)測特定DNA擴(kuò)增過程的檢測技術(shù)[24-25]，exo探針含有與四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF）殘基緊密相連的內(nèi)部熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)[26]。當(dāng)exo探針與目標(biāo)序列相結(jié)合時(shí)，連接熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)THF被切斷，進(jìn)而產(chǎn)生熒光，該熒光可以被常規(guī)的熒光定量儀器所檢測，降低了Rt-RAA檢測技術(shù)對儀器的要求。Rt-RAA檢測技術(shù)具有簡單、快速、特異性強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)[27]。相對于實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增（real-time recombinase polymerase amplification，Rt-RPA）檢測技術(shù)，Rt-RAA重組酶從細(xì)菌或真菌中獲得，來源范圍廣、成本低，且是我國自主研發(fā)的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，而Rt-RPA重組酶則來自于T4噬菌體，來源范圍窄、獲取成本高[28-29]。因此，本研究基于大鼠的COX3基因和小鼠的16S rRNA基因序列建立雙重Rt-RAA反應(yīng)檢測體系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的雙重Rt-RAA特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，雙重體系分別檢測大鼠和小鼠源性成分的檢出限分別為0.5%和0.2%，同步檢測2 種源性成分檢出限低至0.5%，并在模擬熟肉制品中同步檢出限仍為0.5%，明顯優(yōu)于real-time PCR方法檢測靈敏度。雙重Rt-RAA方法與real-time PCR方法對市售樣品和模擬樣品檢測結(jié)果具有高度一致性，符合率為100%。

與陳珍金等[22]建立的LAMP檢測方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，Rt-RAA方法可在39 ℃恒溫條件下30 min內(nèi)完成檢測，而LAMP方法則需要63 ℃恒溫條件、45 min才能完成檢測。同時(shí)，Rt-RAA檢出限與LAMP檢測大鼠和小鼠的檢出限基本相當(dāng)。此外，Rt-RPA檢測方法并未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，通過6 次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本研究建立的檢測方法具有很好的穩(wěn)定性。因此，本研究建立的雙重Rt-RAA檢測方法適用于肉制品中大鼠和小鼠源性成分的快速檢測，為現(xiàn)場快速檢測肉制品摻假提供了另一條快捷、實(shí)用的檢測方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] HAJI A， DESALEGN K， HASSEN H. Selected food items adulteration， their impacts on public health， and detection methods： a review[J]. Food Science & Nutrition， 2023， 11（12）： 7534-7545. DOI：10.1002/fsn3.3732.

[2] WALKER M， BURNS M， BURNS D. Horse meat in beef products-species substitution 2013[J]. Journal of the Association of Public Analysts， 2013， 41： 67-106.

[3] AMARAL J S， SANTOS G， OLIVEIRA M B P P， et al. Quantitative detection of pork meat by EvaGreen real-time PCR to assess the authenticity of processed meat products[J]. Food Control， 2017， 72： 53-61. DOI：10.1016/j.foodcont.2016.07.029.

[4] DUAN S Q， AI J X， SUN L Y， et al. Development and validation of a rapid kit for authenticity of murine meat in meat products with a species-specific PCR assay[J]. Food Additives & Contaminants Part A： Chemistry， Analysis， Control， Exposure & Risk Assessment， 2020， 37（4）： 552-560. DOI：10.1080/19440049.2020.1718218.

[5] NAAUM A M， SHEHATA H R， CHEN S， et al. Complementary molecular methods detect undeclared species in sausage products at retail markets in Canada[J]. Food Control， 2018， 84： 339-344. DOI：10.1016/j.foodcont.2017.07.040.

[6] 李欣南. 基于核酸分子檢測的肉類源性成分快速鑒別技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用[D]. 沈陽： 中國醫(yī)科大學(xué)， 2018.

[7] CHEN A L， WEI C B， CHEN G， et al. Duplex PCR approach for the detection and quantification of donkey， horse and mule in raw and heat-processed meat products[J]. International Journal of Food Science &

Technology， 2015， 50（3）： 834-839. DOI：10.1111/ijfs.12720.

[8] 梁子英， 劉芳. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2020， 6（1）： 1-3; 8.

[9] QUAN P L， SAUZADE M， BROUZES E. dPCR： a technology review[J]. Sensors， 2018， 18（4）： 1271. DOI：10.3390/s18041271.

[10] HARSHITHA R， ARUNRAJ D R. Real-time quantitative PCR： a tool for absolute and relative quantification[J]. Biochemistry and Molecular Biology Education， 2021， 49（5）： 800-812. DOI：10.1002/bmb.21552.

[11] BALTRU?IS P， H?GLUND J. Digital PCR： modern solution to parasite diagnostics and population trait genetics[J]. Parasites & Vectors， 2023， 16（1）： 143. DOI：10.1186/s13071-023-05756-7.

[12] CHO A R， DONG H J， CHO S. Meat species identification using loop-mediated isothermal amplification assay targeting species-specific mitochondrial DNA[J]. Korean Journal for Food Science of Animal Resources， 2014， 34（6）： 799-807. DOI：10.5851/kosfa.2014.34.6.799.

[13] KIM S H， LEE S Y， KIM U， et al. Diverse methods of reducing and confirming false-positive results of loop-mediated isothermal amplification assays： a review[J]. Analytica Chimica Acta， 2023， 1280： 341693. DOI：10.1016/j.aca.2023.341693.

[14] CUI H， TU F， ZHANG C， et al. Real-time reverse transcription recombinase-aided amplification assay for rapid amplification of the N gene of SARS-CoV-2[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（23）： 15269. DOI：10.3390/ijms232315269.

[15] MOTALIB HOSSAIN M A， ALI M E， HAMID S B A， et al. Targeting double genes in multiplex PCR for discriminating bovine， buffalo and porcine materials in food chain[J]. Food Control， 2017， 73： 175-184. DOI：10.1016/j.foodcont.2016.08.008.

[16] AI J， SUN L， GAO L， et al. Development of a PCR-based assay for detection of Chinese mink tissue in meat products based on the mitochondrial DNA cytochrome-b gene[J]. Mitochondrial DNA Part B： Resources， 2019， 4（2）： 2748-2750. DOI：10.1080/23802359.2018.1532828.

[17] CHEN X Y， LU L X， XIONG X H， et al. Development of a real-time PCR assay for the identification and quantification of bovine ingredient in processed meat products[J]. Scientific Reports， 2020， 10（1）： 2052. DOI：10.1038/s41598-020-59010-6.

[18] 郭燕華， 陳遂， 王德蓮， 等. 基于重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測生鮮肉中豬源性成分[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)， 2017， 8（6）： 2012-2016.

[19] AHAMAD M N U， ALI M E， MOTALIB HOSSAIN M A， et al. Multiplex PCR assay discriminates rabbit， rat and squirrel meat in food chain[J]. Food Additives & Contaminants Part A： Chemistry， Analysis， Control， Exposure & Risk Assessment， 2017， 34（12）： 2043-2057. DOI：10.1080/19440049.2017.1359752.

[20] SURYAWAN G Y， SUARDANA I W， WANDIA I N. Sensitivity of polymerase chain reaction in the detection of rat meat adulteration of beef meatballs in Indonesia[J]. Veterinary World， 2020， 13（5）： 905-908. DOI：10.14202/vetworld.2020.905-908.

[21] 王學(xué)政， 季福玲， 劉志勝， 等. 一種用于實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測肉制品中鼠源性成分特異性引物的研發(fā)[J]. 中國生物制品學(xué)雜志， 2018， 31（7）： 775-777; 781. DOI：10.13200/j.cnki.cjb.002239.

[22] 陳珍金， 張璜， 石磊， 等. 利用LAMP技術(shù)快速檢測羊肉制品中的鼠源性成分[J]. 食品科學(xué)， 2021， 42（12）： 322-327. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20201016-146.

[23] KINGSLEY D H. Emerging foodborne and agriculture-related viruses[J]. Microbiology Spectrum， 2016， 4（4）. DOI：10.1128/microbiolspec.pfs-0007-2014.

[24] CHEN W X， FAN J D， LI Z Y， et al. Development of recombinase aided amplification combined with disposable nucleic acid test strip for rapid detection of porcine circovirus type 2[J]. Frontiers in Veterinary Science， 2021， 8： 676294. DOI：10.3389/fvets.2021.676294.

[25] WANG Z H， LI P， LIN X， et al. Application of portable real-time recombinase-aided amplification （Rt-RAA） assay in the clinical diagnosis of ASFV and prospective DIVA diagnosis[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2021， 105（8）： 3249-3264. DOI：10.1007/s00253-021-11196-z.

[26] DONG Y C， ZHOU D D， ZHANG B Z， et al. Development of a real-time recombinase-aided amplification assay for rapid and sensitive detection of Edwardsiella piscicida[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology， 2024， 14： 1355056. DOI：10.3389/fcimb.2024.1355056.

[27] FAN X X， LI L， ZHAO Y G， et al. Clinical validation of two recombinase-based isothermal amplification assays （RPA/RAA） for the rapid detection of African swine fever virus[J]. Frontiers in Microbiology， 2020， 11： 1696. DOI：10.3389/fmicb.2020.01696.

[28] 孫曉紅， 后來旺， 李達(dá)容， 等. 重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在分析檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2020， 46（24）： 265-270. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.024735.

[29] WANG R P， XU S， WEI E J， et al. Recombinase-aided amplification coupled with lateral flow dipstick for efficient and accurate detection of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus[J]. Folia Microbiologica， 2024， 69（3）： 667-676. DOI：10.1007/s12223-023-01102-7.