摘 要：為提高蟠龍菜的貯藏品質(zhì)并對其貯藏特性變化進(jìn)行研究，選取迷迭香提取物、茶多酚、香芹酚、ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）和乳酸鏈球菌素（nisin）作為保鮮劑，采用牛津杯法對蟠龍菜中分離純化的腐敗菌進(jìn)行抑菌圈實(shí)驗(yàn)，篩選出抑菌效果好的保鮮劑應(yīng)用于蟠龍菜中，測定添加不同保鮮劑的蟠龍菜在4 ℃貯藏0、5、10、15、20、25 d后的微生物、感官、理化和風(fēng)味品質(zhì)。結(jié)果表明：ε-PL、Nisin和香芹酚對蟠龍菜中優(yōu)勢腐敗菌抑制效果較好，在貯藏過程中，添加香芹酚和ε-PL組pH值下降幅度較小，分別為0.11和0.06；通過分析總揮發(fā)性鹽基氮含量和硫代巴比妥酸反應(yīng)物值的變化，發(fā)現(xiàn)香芹酚和Nisin可以有效抑制蟠龍菜4 ℃貯藏過程中脂肪氧化和揮發(fā)性鹽基氮的生成；使用偏最小二乘回歸及熵權(quán)法結(jié)合加權(quán)灰色關(guān)聯(lián)度對4 項(xiàng)貯藏指標(biāo)進(jìn)行分析，貯藏25 d時(shí)，加權(quán)灰色關(guān)聯(lián)度最高的是添加Nisin（0.405 9）和香芹酚（0.387 6）組，表明Nisin和香芹酚的添加能有效改善蟠龍菜貯藏過程中的微生物及理化品質(zhì)；Nisin組和ε-PL組微觀結(jié)構(gòu)的孔隙較少且結(jié)構(gòu)更為致密；電子鼻分析得出添加香芹酚的蟠龍菜風(fēng)味相較于對照組差異較大；感官評價(jià)得出添加香芹酚會顯著降低蟠龍菜的風(fēng)味及可接受性評分（P＜0.05）。因此，添加Nisin能在不改變蟠龍菜風(fēng)味的同時(shí)有效抑制冷藏過程中微生物的生長繁殖并減少理化指標(biāo)的變化，提高其貯藏品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：肉制品；蟠龍菜；天然保鮮劑；貯藏特性

Effect of Natural Preservatives on the Storage Characteristics of Panlongcai， a Traditional Steamed Dish in Zhongxiang， Hubei

YUN Zhoumiao1，2， JIAN Qingmei1， HAN Jiayu1， WU Jinlin3， HUANG Yechuan1，2，*

（1. College of Bioengineering， Jingchu University of Technology， Jingmen 448000， China; 2. College of Life Science and Engineering， Southwest University of Science and Technology， Mianyang 621010， China; 3. Hubei Runwu Food Co. Ltd.， Jingmen 431900， China）

Abstract： To improve the storage quality and to study the changes in storage characteristics of Panlongcai， the bacteriostatic effects of rosemary extract， tea polyphenols， carvacrol， ε-poly-L-lysine （ε-PL） and nisin on spoilage bacteria isolated from Panlongcai were tested by the Oxford cup method. Panlongcai added with the preservatives with good bacteriostatic activity were stored at 4 ℃ and evaluated for microbiological， organoleptic， physicochemical and flavor qualities after 0， 5， 10， 15， 20 and 25 days. The results showed that ε-PL， nisin and carvacrol had good inhibitory effects on the dominant spoilage bacteria in Panlongcai. During the storage process， the pH decrease was smaller in the carvacrol and ε-PL addition groups， 0.11 and 0.06， respectively. Carvacrol and nisin effectively inhibited lipid oxidation as assessed by thiobarbituric acid reactive substances （TBARs） value and total volatile basic nitrogen （TVB-N） generation. The total bacterial count （TBC）， pH， TBARs and TVB-N data were analyzed by the combined use of partial least squares regression （PLSR）， entropy weighting method and weighted grey correlation， and it was found that the highest weighted grey correlation occurred upon the addition of nisin （0.405 9） and carvacrol （0.387 6） after 25 days of storage， which indicates that the addition of nisin and carvacrol could effectively improve the microbiological and physicochemical qualities of Panlongcai during the storage process. Both nisin and carvacrol groups exhibited a less porous and denser microstructure. Electronic nose analysis showed a greater difference in the flavor of Panlongcai with the addition of carvacrol compared to the control group. Sensory evaluation showed that the addition of carvacrol significantly reduced the flavor and acceptability of Panlongcai （P < 0.05）. In conclusion， the addition of nisin could effectively inhibit the growth and reproduction of microorganisms and reduce the changes of physicochemical indexes during cold storage without altering the flavor of Panlongcai， and improve its storage quality.

Keywords： meat product; Panlongcai; natural preservative; storage characteristics

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240513-116

中圖分類號：TS251.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）09-0048-09

引文格式：

云周苗， 簡清梅， 韓佳鈺， 等. 天然保鮮劑對蟠龍菜貯藏特性的影響[J]. 肉類研究， 2024， 38（9）： 48-56. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240513-116. http：//www.rlyj.net.cn

YUN Zhoumiao， JIAN Qingmei， HAN Jiayu， et al. Effect of natural preservatives on the storage characteristics of panlongcai， a traditional steamed dish in zhongxiang， Hubei[J]. Meat Research， 2024， 38（9）： 48-56. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240513-116. http：//www.rlyj.net.cn

蟠龍菜，又稱盤龍菜、卷切，俗名剁菜，是湖北鐘祥經(jīng)典名菜之一，主要原料包括豬肉、魚肉、雞蛋、大蔥、生姜等，具有色澤鮮艷、肥而不膩、肉滑油潤等特點(diǎn)，迄今已有約500 年的食用歷史[1-2]。隨著我國肉制品生產(chǎn)和消費(fèi)的不斷發(fā)展，蟠龍菜近年來也進(jìn)入肉品生產(chǎn)領(lǐng)域。隨著生活水平的提高，人們對肉制品的消費(fèi)需求和品質(zhì)要求不斷提升。脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化變質(zhì)、微生物的生長繁殖是導(dǎo)致肉制品品質(zhì)下降的主要原因[3]。影響肉制品貯藏過程中品質(zhì)的因素主要包括貯藏條件、氧氣含量、pH值、包裝材料及組成成分等，產(chǎn)品的腐敗表現(xiàn)為產(chǎn)生黏液、褪色、變味等[4-5]。國內(nèi)外學(xué)者對西式低溫火腿[6]、法蘭克福香腸[7]和腌肉切片[8]等肉制品在貯藏過程中的理化性質(zhì)和微生物指標(biāo)的變化規(guī)律進(jìn)行了研究，這對相關(guān)肉制品貯藏期間的品質(zhì)控制具有一定的指導(dǎo)意義。然而，蟠龍菜因主輔料種類繁多且制作工藝復(fù)雜而區(qū)別于一般肉制品，在生產(chǎn)過程中受到污染和在貯藏過程中氧化的風(fēng)險(xiǎn)較高。

添加保鮮劑是通過抑制食品中腐敗菌生長和控制氧化過程，從而保證產(chǎn)品品質(zhì)的常用方法，但隨著人們對健康飲食的廣泛認(rèn)知和普遍接受，近年來，使用天然保鮮劑代替合成保鮮劑成為研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。因此，天然保鮮劑對肉制品腐敗菌抑制作用的相關(guān)研究也逐步增多[9-11]。ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）復(fù)配抑菌劑應(yīng)用于肉制品的防腐保鮮，有延長保質(zhì)期和提升口感的雙重優(yōu)勢[12]。茶多酚和溶菌酶作為安全性較高的抑菌劑，在抑制肉制品細(xì)菌生長、維持肉制品品質(zhì)等方面具有顯著效果[13]。李德紅[14]研究得出，0.05 g/kg ε-PL、0.2 g/kg乳酸鏈球菌素（nisin）和0.12 g/kg茶多酚復(fù)配能有效抑制氣調(diào)包裝醬鴨食管中的優(yōu)勢腐敗菌。戴增輝等[15]

研究表明，生物保鮮劑處理后的植物基人造肉的貯藏期和品質(zhì)較未處理的試樣均有明顯提升，并且1%殼聚糖和0.20～0.36% ε-PL處理能明顯抑制微生物的生長。迷迭香提取物和香芹酚也能有效延緩肉制品的氧化變質(zhì)進(jìn)程[16-17]。但不同產(chǎn)品的原料組成及最適貯藏條件各不相同，要達(dá)到更好的保鮮效果，需要選擇與之適配的保鮮劑。目前，蟠龍菜貯藏特性及針對性抑菌研究鮮見報(bào)道。本研究探究添加不同保鮮劑對蟠龍菜菌落總數(shù)、理化、感官和風(fēng)味等貯藏指標(biāo)的差異及變化規(guī)律，據(jù)此針對性制訂產(chǎn)品貨架期延長策略及降低產(chǎn)品安全性風(fēng)險(xiǎn)對蟠龍菜產(chǎn)品來說具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、草魚、大蔥、生姜、雞蛋、馬鈴薯淀粉、食鹽、味精 湖北省荊門市東寶區(qū)荊楚理工學(xué)院南門

超市；迷迭香提取物（鼠尾草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥10%，鼠尾草酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥10%）、Nisin（效價(jià)≥900 IU/mg）

深圳市佳禾旭日商貿(mào)有限公司；茶多酚（多酚質(zhì)量分

數(shù)≥98%）、ε-PL（純度≥95%） 山東齊魯生物科技集團(tuán)有限公司；香芹酚（純度99%） 上海麥克林生化科技股份有限公司；PCA培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；

1，1，3，3-四乙氧基丙烷標(biāo)準(zhǔn)品 德國Sigma公司；硫代巴比妥酸、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鉀、氯化鈉、氧化鎂、硼酸、三氯甲烷、鹽酸、95%乙醇、石油醚、硫代硫酸鈉、亞鐵氰化鉀、冰乙酸、碘化鉀、無水硫酸鈉、可溶性淀粉、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所有分離用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ3200DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；PEN3型電子鼻 德國Airsence公司；PHSJ-3F型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；FJ-200S型高速分散均質(zhì)機(jī) 江蘇金壇金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；DW-86L626型立式超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；KDN-103F型自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；ULTRA 55型場發(fā)射掃描電子顯微鏡 德國蔡司儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 天然保鮮劑預(yù)處理

參照李新福[18]的方法，迷迭香提取物、茶多酚、香芹酚、ε-PL醇溶液的質(zhì)量濃度均為0.01 g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)為25%，Nisin的酸溶液質(zhì)量濃度為0.01 g/mL，鹽酸濃度為0.02 mol/L。

1.3.2 受試菌懸液制備

1.3.2.1 超低溫保存菌種的活化與復(fù)壯

取出課題組前期從蟠龍菜中分離鑒定后于－80 ℃凍存的3 種菌種（腸桿菌屬（Enterobacter）、分散泛菌（Pantoea dispersa）、托拉假單胞菌（Pseudomonas juntendi）），將其置于約39 ℃的70%乙醇浴槽中，期間適當(dāng)搖動凍存管至完全液化。在無菌環(huán)境下，以劃線法將其接種至PCA培養(yǎng)基，36 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24～48 h，挑選典型菌落轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基，重復(fù)培養(yǎng)及轉(zhuǎn)接操作2～3 次。

1.3.2.2 菌懸液制備

挑取多個(gè)獨(dú)立單菌落于5 支裝有5 mL生理鹽水的試管中制成不同濃度菌懸液，以生理鹽水為空白對照并在600 nm處測定其吸光度，通過倒平板計(jì)算各濃度菌液單位體積活菌數(shù)，以吸光度為橫坐標(biāo)，單位體積活菌數(shù)為縱坐標(biāo)，構(gòu)建菌濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，在600 nm下調(diào)整吸光度，調(diào)整至菌液濃度為

7～8（lg（CFU/mL））備用，每種菌均制作單獨(dú)的菌懸液。

1.3.3 天然保鮮劑的篩選

在超凈臺中吸取50 μL準(zhǔn)備好的菌懸液，將其滴入PCA培養(yǎng)基平板，均勻涂布，每種菌都制作單獨(dú)的PCA平板，然后在每個(gè)平板中放入3 個(gè)分布均勻的牛津杯（外徑7.80 mm）。向不同菌種平板上的牛津杯內(nèi)滴加0.2 mL預(yù)處理的1 種天然保鮮劑溶液，對每種天然保鮮劑溶液均進(jìn)行同樣操作。在牛津杯中添加等量的生理鹽水作為空白對照，將處理后的平板平穩(wěn)放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，期間避免移動平板。采用十字交叉法用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑，重復(fù)3 次取平均值。

1.3.4 蟠龍菜制備工藝

蟠龍菜配料表：主料：豬瘦肉、肥肉、草魚肉質(zhì)量比4∶3∶3；輔料：馬鈴薯淀粉12%、水2%、蛋清15%、大蔥末0.17%、生姜末0.17%；調(diào)味料：味精0.2%、鹽1.5%；品質(zhì)改良劑：大豆分離蛋白3.7%、卡拉膠1.2%、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶0.5%。其中，輔料、調(diào)味料和品質(zhì)改良劑添加量以原料肉質(zhì)量為基礎(chǔ)進(jìn)行計(jì)算。

工藝流程及操作要點(diǎn)：蟠龍菜制作工藝流程參考王虹[1]的方法并做修改（圖1）。將瘦肉、魚肉按比例一同絞成肉糜狀，肥肉絞至最大塊體積不超過1.5 cm3，加入雞蛋清、肥肉粒、馬鈴薯淀粉、蔥、姜、鹽、味精、水，逆時(shí)針手動攪拌5 min；將混合均勻的肉糜置于潔凈的保鮮膜上，將其裹成長約10 cm、直徑約6 cm的類圓柱體；將成型后的坯置于蒸籠上蒸制20 min，表面刷蛋黃液，繼續(xù)蒸制5 min；隨后將冷卻后的蟠龍菜裝袋并在0.1 MPa的真空度下進(jìn)行抽真空操作并封口，105 ℃滅菌20 min，成品置于4 ℃條件下貯藏。

1.3.5 天然保鮮劑的應(yīng)用

以添加篩選后的3 種天然保鮮劑的蟠龍菜為實(shí)驗(yàn)組，以不添加保鮮劑的蟠龍菜為對照組。Nisin和香芹酚添加量為0.25 g/kg、ε-PL添加量為0.2 g/kg，與輔料混合后一同加入。蟠龍菜制作完成后，于4 ℃貯藏，在0、5、10、15、20、25 d分別測定其菌落總數(shù)、pH值、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、過氧化值和硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值，為探究3 種天然保鮮劑對蟠龍菜風(fēng)味和微觀結(jié)構(gòu)的影響，貯藏15 d時(shí)進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察、感官評價(jià)和電子鼻測定。

1.3.6 菌落總數(shù)測定

參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》進(jìn)行測定。

1.3.7 pH值測定

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》進(jìn)行測定。

1.3.8 TVB-N含量測定

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》，采用自動凱氏定氮儀法測定。

1.3.9 TBARS值測定

采用GB 5009.181—2016《食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中丙二醛的測定》的分光光度法進(jìn)行測定。

1.3.10 蟠龍菜貯藏指標(biāo)評價(jià)方法

采用熵權(quán)法計(jì)算菌落總數(shù)、pH值、TBARS值、TVB-N含量的熵值和熵權(quán)，結(jié)合灰色系統(tǒng)理論，將蟠龍菜的菌落總數(shù)、pH值、TBARS值、TVB-N含量4 項(xiàng)指標(biāo)視為1 個(gè)灰色系統(tǒng)，各指標(biāo)為系統(tǒng)的1 個(gè)因素。取各指標(biāo)最優(yōu)值構(gòu)建1 個(gè)理想的系統(tǒng)，然后對各指標(biāo)進(jìn)行無量綱化處理，綜合計(jì)算不同貯藏期及添加不同保鮮劑的蟠龍菜貯藏品質(zhì)的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)。

1.3.10.1 貯藏指標(biāo)權(quán)重計(jì)算

假設(shè)有m 個(gè)樣本數(shù)據(jù)點(diǎn)，每個(gè)樣本涵蓋n 項(xiàng)特征指標(biāo)，按式（1）、（2）分別對數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化處理：

式中：xij為第i個(gè)樣本的第j個(gè)指標(biāo)的測定值（1≤i≤m，1≤j≤n）；fij為規(guī)范化處理后的值；Zij為標(biāo)準(zhǔn)化處理后的值。

對于第j個(gè)指標(biāo)的熵值Hj，按式（3）進(jìn)行計(jì)算：

式中：，0≤Hj≤1，當(dāng)Zij＝0時(shí)，ZijlnZij＝0。

依照式（4）計(jì)算某一指標(biāo)權(quán)重wj：

式中：0≤wj≤1且Σnj＝1wj＝1。

1.3.10.2 加權(quán)灰色關(guān)聯(lián)度計(jì)算

依照式（5）構(gòu)建原始評價(jià)矩陣及參考序列：

令X0為理想方案，設(shè)定比較數(shù)列X0＝

（x01， x02…x0j…x0n）。

將評價(jià)矩陣按式（6）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及轉(zhuǎn)化：

將理想方案X0進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后得出理想數(shù)列矩陣Z0＝（z01， z02…z0j…z0n）。

按式（7）進(jìn)行轉(zhuǎn)化，i（j）為無量綱化后樣本i的j指標(biāo)值與理想方案中對應(yīng)指標(biāo)值的差值：

灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)及加權(quán)灰色關(guān)聯(lián)度分別按

式（8）、（9）計(jì)算：

式中：ξi（j）為灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)；ε為灰色分辨系數(shù)，取0.5；φi為樣本i的加權(quán)灰色關(guān)聯(lián)度。

1.3.11 掃描電子顯微鏡觀察

參考余永名等[19]的方法并作適當(dāng)修改，將貯藏0 d的蟠龍菜樣品切為3 mm×3 mm×3 mm小塊，2.5%戊二醛固定12 h，然后用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）漂洗3 次，5 min/次，使用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇（30%、50%、70%、90%、95%、100%）進(jìn)行梯度脫水（15 min/梯度），后將樣品真空冷凍干燥。掃描前離子濺射噴金，用掃描電子顯微鏡放大1 000 倍觀察微觀結(jié)構(gòu)并記錄。

1.3.12 感官評價(jià)

取蟠龍菜切為長5 cm、寬3 cm、厚3 mm的薄片，蒸煮5 min，標(biāo)號后由4男4女共8 名受過培訓(xùn)的食品感官評價(jià)員根據(jù)感官評分標(biāo)準(zhǔn)（表1）對其外觀、色澤、組織狀態(tài)、風(fēng)味和可接受性進(jìn)行感官評價(jià)，在品嘗樣品時(shí)，先聞香后品嘗，品嘗完成后用純凈水漱口，并休息1 min，口中無余味后開始品嘗下一樣品，結(jié)果去掉最大值和最小值后取平均值。

1.3.13 電子鼻測定

將蟠龍菜樣品破碎至均勻狀態(tài)，稱取1.0 g樣品于15 mL頂空瓶中，用墊片封口后放置至室溫，然后進(jìn)行樣品檢測，重復(fù)測定3 次。

電子鼻參數(shù)：測定時(shí)間間隔1 s，傳感器清洗時(shí)間60 s，歸零時(shí)間10 s，氣體采樣時(shí)間100 s，進(jìn)樣流量400 mL/min。根據(jù)傳感器數(shù)據(jù)曲線，選擇60～62 s的數(shù)據(jù)，對其進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。電子鼻傳感器組成及功能如表2所示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測得的數(shù)據(jù)使用Excel 2019軟件進(jìn)行簡單計(jì)算處理，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著；采用Origin 2019b軟件繪圖；電子鼻數(shù)據(jù)采用PEN3.0自帶的Win-muster軟件進(jìn)行PCA；偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析采用Unscrambler 9.7軟件的PLS2程序，數(shù)據(jù)在分析前均進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。PLSR分析以貯藏時(shí)間（0、5、10、15、20、25 d）和不同保鮮劑處理（不添加、香芹酚、ε-PL、Nisin）為X變量，4 個(gè)品質(zhì)指標(biāo)（菌落總數(shù)、TBARS值、TVB-N含量、pH值）為Y變量。每個(gè)理化指標(biāo)測定均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 天然保鮮劑的篩選結(jié)果

對抑菌圈數(shù)據(jù)進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，得出添加不同保鮮劑時(shí)Enterobacter組卡方值為16.76，自由度為5，P（0.005）＜0.01，數(shù)據(jù)間存在極顯著差異；P. dispersa組與P. juntendi組卡方值均為16.826，自由度均為5，P（0.005）＜0.01，數(shù)據(jù)間差異極顯著。由表3

可知，迷迭香提取物和茶多酚的醇溶液抑菌圈直徑均等于牛津杯的外徑（7.8 mm），這說明該濃度下的迷迭香提取物和茶多酚對從蟠龍菜中分離純化出的細(xì)菌生長繁殖沒有抑制作用。迷迭香提取物具有較高的抗氧化活性[20-21]，但在抑菌活性方面，相關(guān)研究表明，迷迭香提取物對細(xì)菌最低抑菌濃度為6.25 mg/mL[22]，因而在本研究中未表現(xiàn)出抑菌活性。茶多酚具有優(yōu)異的抗氧化能力[23-24]，但其抑菌性能相較于ε-PL、Nisin等抑菌劑來說稍差[25]。對Enterobacter來說，香芹酚、ε-PL和Nisin的抑菌圈直徑分別為32.27、16.50、11.20 mm，說明它們都有抑制其生長繁殖的能力，并且香芹酚抑菌效果最好，ε-PL次之，最后是Nisin。對于P. dispersa和P. juntendi而言，只有香芹酚（22.53、10.50 mm）和Nisin（11.30、13.03 mm）具有抑菌效果。綜合評價(jià)得出，香芹酚、ε-PL和Nisin的添加均抑制了微生物的生長，且香芹酚相比于ε-PL和Nisin擁有更好的抑菌效果。因此，選擇香芹酚、ε-PL和Nisin 3 種天然保鮮劑應(yīng)用于蟠龍菜生產(chǎn)中。

2.2 蟠龍菜貯藏期間菌落總數(shù)變化

由表4可知，在貯藏的前5 d，各組均未檢測出菌落，說明在此期間微生物數(shù)量級較小且活躍度低，傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)菌株未發(fā)展成菌落。由于大部分微生物在生產(chǎn)過程中的熱處理中被殺死，蟠龍菜中殘存細(xì)菌及芽孢的活力受損嚴(yán)重，菌群數(shù)量短時(shí)間內(nèi)不能有效恢復(fù)。低溫也會抑制某些微生物的生長，因此微生物絕對數(shù)量較少。在貯藏第10天，香芹酚組未檢測出菌落，且在接下來的貯藏過程中，該組的菌落總數(shù)均顯著低于其他組

（P＜0.05），可以得出香芹酚具有較好的抑菌效果，與抑菌圈實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果一致。Karam等[26]的研究同樣表明香芹酚能有效抑制鹵雞產(chǎn)品中的微生物群。在不同貯藏時(shí)間點(diǎn)，香芹酚組和Nisin組菌落總數(shù)均低于對照組，表現(xiàn)出了一定的抑菌效果，這與劉欣等[27]的研究結(jié)果一致。ε-PL組在貯藏初期表現(xiàn)出了較好的抑菌效果，但在貯藏10 d后，與對照組之間的差異不顯著（P＞0.05），不能有效抑制微生物的生長。

2.3 蟠龍菜貯藏期間pH值和TVB-N含量變化

如表5所示，蟠龍菜貯藏25 d時(shí)pH值均低于0 d時(shí)的pH值，這是因?yàn)橘A藏過程中微生物的生長繁殖活動利用有機(jī)物后，將其分解為乳酸、醋酸等有機(jī)酸。在貯藏的15 d以內(nèi)，樣品組和處理組的pH值變化不明顯，推測可能與微生物數(shù)量較少有關(guān)，少量微生物分解糖類等營養(yǎng)物質(zhì)能力較弱。貯藏中后期蟠龍菜中微生物加速利用蟠龍菜中的多種有機(jī)物生成各種有機(jī)酸，因此pH值下降速度加快，并且對照組pH值相較于實(shí)驗(yàn)組下降更快。

在貯藏初期，空白對照組蟠龍菜中TVB-N含量變化不明顯；貯藏10～20 d時(shí)，TVB-N含量小幅增加，貯藏后期迅速升高，25 d時(shí)達(dá)到13.16 mg/100 g。對照組TVB-N含量呈現(xiàn)這樣的變化是由于貯藏初期樣品中微生物數(shù)量較少，分解蛋白質(zhì)的能力有限，此后微生物逐漸適應(yīng)外界環(huán)境，生長繁殖活動加快。香芹酚、ε-PL和Nisin的添加抑制了蟠龍菜樣品中微生物的生理活動，因此TVB-N的生成量也相對較少，其中添加香芹酚的組別TVB-N含量變化最小，從貯藏初期的11.20 mg/100 g到后期的11.81 mg/100 g，僅增加0.61 mg/100 g，說明香芹酚能有效減緩蛋白質(zhì)降解速率，維持產(chǎn)品品質(zhì)。在貯藏25 d時(shí)，Nisin組TVB-N含量（11.06 mg/100 g）最低，表明Nisin能有效延緩TVB-N的生成。

2.4 蟠龍菜貯藏期間TBARS值變化

如表6所示，在低溫貯藏過程中，蟠龍菜的TBARS值雖總體處于較低水平，但隨貯藏時(shí)間的延長均呈現(xiàn)上升趨勢，即脂肪氧化的程度逐漸加深。在貯藏結(jié)束時(shí)，對照組TBARS值為0.48 mg/kg，與其他組相比變化最大。貯藏25 d時(shí)，香芹酚組TBARS值最低，Nisin組次之，說明香芹酚的添加能抑制蟠龍菜的脂肪氧化，Nisin的添加也能在一定程度上減緩蟠龍菜的脂肪氧化過程，提高其貯藏過程中的品質(zhì)。

2.5 PLSR分析

在進(jìn)行多變量回歸分析時(shí)，采用PLSR進(jìn)行分析可避免存在變量的共線性問題，減少分析的誤差，保持回歸分析的穩(wěn)定。因而，使用PLSR分析各主要因素對蟠龍菜樣品品質(zhì)指標(biāo)變化的影響。由圖2可知，PC1和PC2共解釋了Y變量的77%，Y變量均落于內(nèi)外2 個(gè)橢圓之間，表明這些變量能合理地被該P(yáng)LSR模型解釋。貯藏時(shí)間（0、5、10 d）和蟠龍菜的pH值均位于PC1軸的負(fù)半軸，說明在貯藏初期蟠龍菜pH值并未出現(xiàn)明顯變化。貯藏時(shí)間（15、20、25 d）和蟠龍菜的TVB-N含量、TBARS值和細(xì)菌菌落總數(shù)均位于載荷圖的右側(cè)，說明貯藏時(shí)間和反映蟠龍菜品質(zhì)下降的指標(biāo)（TVB-N含量、TBARS值和菌落總數(shù)）呈正相關(guān)，與pH值呈負(fù)相關(guān)，貯藏初期和貯藏后期的蟠龍菜品質(zhì)指標(biāo)具有明顯區(qū)別。ε-PL組、對照組位于PC1軸的正半軸，與TVB-N含量、TBARS值和菌落總數(shù)呈正相關(guān)，與pH值呈負(fù)相關(guān)，說明添加ε-PL與不添加保鮮劑的蟠龍菜在貯藏過程中品質(zhì)指標(biāo)無明顯差異，均不能有效維持蟠龍菜的品質(zhì)穩(wěn)定性。香芹酚組和Nisin組均位于載荷圖左下側(cè)，遠(yuǎn)離反映蟠龍菜品質(zhì)下降的3 項(xiàng)指標(biāo)，說明香芹酚處理和Nisin處理能很好地避免或延緩蟠龍菜在貯藏過程中產(chǎn)生品質(zhì)劣變。

2.6 蟠龍菜貯藏期間微生物理化指標(biāo)權(quán)重及加權(quán)灰色關(guān)聯(lián)度分析

2.6.1 貯藏指標(biāo)權(quán)重確定

對蟠龍菜菌落總數(shù)、pH值、TBARS值、TVB-N含量4 項(xiàng)貯藏指標(biāo)進(jìn)行熵值計(jì)算（表7），并進(jìn)一步得出熵權(quán)。經(jīng)求解，菌落總數(shù)、pH值、TBARS值、TVB-N含量的權(quán)重分別為0.137 9、0.549 5、0.113 9、0.198 7。

將各項(xiàng)指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化處理后構(gòu)建評價(jià)矩陣，根據(jù)式（8）得出蟠龍菜樣品相應(yīng)指標(biāo)的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)，然后將計(jì)算出的熵權(quán)代入式（9）中，得出各樣品的加權(quán)灰色關(guān)聯(lián)度。加權(quán)灰色關(guān)聯(lián)度數(shù)值越大，表明該樣本與理想樣品相似度越高，由表9可知，在貯藏25 d時(shí)，Nisin組樣品加權(quán)灰色關(guān)聯(lián)度為0.405 9，排名相較于其他組最靠前，因而推測添加Nisin能夠有效提高蟠龍菜的貯藏品質(zhì)。其次是香芹酚組，表明香芹酚的添加同樣能在一定程度上延緩蟠龍菜貯藏期間品質(zhì)指標(biāo)的下降速度，有利于延長蟠龍菜產(chǎn)品的貨架期。

2.7 蟠龍菜掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

如圖3所示，對照組蟠龍菜表面微觀結(jié)構(gòu)孔隙較大且數(shù)量較多，較為粗糙。香芹酚組與對照組微觀結(jié)構(gòu)圖之間不存在明顯差異。ε-PL組與其他組相比表面更為光滑且孔隙較小，可能是因?yàn)棣?PL是由25～30 個(gè)賴氨酸殘基組成的高分子聚合物，主要二級結(jié)構(gòu)單元為α-螺旋結(jié)構(gòu)，且存在部分無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)[28]，ε-PL的添加增加了蟠龍菜中蛋白質(zhì)的交聯(lián)和相互作用，有助于致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，從而改變了蟠龍菜表面的微觀結(jié)構(gòu)。Nisin組微觀結(jié)構(gòu)相較于對照組而言孔隙較少，且表面撕裂狀結(jié)構(gòu)較少，可能由于Nisin含34 種氨基酸殘基，且分子質(zhì)量（3 510 Da）較大[29]，與蟠龍菜中蛋白質(zhì)產(chǎn)生相互作用或交聯(lián)，形成更為致密的結(jié)構(gòu)。

2.8 蟠龍菜感官評價(jià)

由表10可知，各組的外觀、色澤和組織狀態(tài)評分并未顯示出顯著變化（P＜0.05），可推知香芹酚、ε-PL和Nisin的添加不會在消費(fèi)者能感知的范圍內(nèi)影響蟠龍菜的外觀、色澤及組織狀態(tài)。從風(fēng)味角度來看，香芹酚組風(fēng)味評分（16.25）顯著低于對照組和其他處理組（P＜0.05），這可能是因?yàn)橄闱鄯颖旧砭哂械奶厥鈿馕陡淖兞梭待埐说墓逃酗L(fēng)味，并且部分人群對香芹酚風(fēng)味的接受度較低。在實(shí)際生產(chǎn)中，可通過與其他保鮮劑復(fù)配減少香芹酚的用量，從而減少特殊香味對產(chǎn)品風(fēng)味的影響。從可接受性角度來看，香芹酚組的評分同樣較其他組低。從總體評分來看，ε-PL組、Nisin組與對照組之間的感官評分并未出現(xiàn)顯著差異（P＞0.05），由此可知添加ε-PL和Nisin不會對蟠龍菜的感官特性產(chǎn)生負(fù)面影響。

2.9 蟠龍菜電子鼻分析

電子鼻系統(tǒng)中的多個(gè)氣敏傳感器可將不同特征的風(fēng)味物質(zhì)轉(zhuǎn)化為電信號[30]，從而識別風(fēng)味物質(zhì)，再根據(jù)PCA和判別分析等方法對識別的不同風(fēng)味進(jìn)行分析。不同傳感器對特定類別的物質(zhì)敏感，因而根據(jù)傳感器信號強(qiáng)度可直觀地判斷特征氣味物質(zhì)。由圖4可知，傳感器W5S、W1S、W1W、W2S、W2W的響應(yīng)值有明顯變化，這些傳感器對添加不同保鮮劑蟠龍菜的風(fēng)味區(qū)分做出了較大的貢獻(xiàn)。蟠龍菜風(fēng)味物質(zhì)與產(chǎn)生強(qiáng)信號的傳感器所對應(yīng)的風(fēng)味物質(zhì)類別一致，有短鏈烷烴、碳?xì)浠衔?、芳香烴化合物、萜類、有機(jī)硫化物、醇、醚、醛、酮、硫類和氯類化合物。同時(shí)，傳感器W5S和W1W的響應(yīng)值變化最為明顯，據(jù)此可知蟠龍菜風(fēng)味物質(zhì)中碳?xì)浠衔铩⒎枷銦N化合物、萜類和有機(jī)硫化物含量較高。添加不同保鮮劑的樣品在雷達(dá)圖中呈現(xiàn)出相似的連接形狀，表明不同組別之間的風(fēng)味物質(zhì)存在一定的相似性。Nisin組圖形與對照組之間更為接近，說明Nisin的添加未對蟠龍菜風(fēng)味產(chǎn)生明顯改變。

圖5中的橢圓代表同組蟠龍菜風(fēng)味數(shù)據(jù)集，PC1方差貢獻(xiàn)率為98.46%，表明樣品間的差異集中在PC1上，前2 個(gè)PC貢獻(xiàn)率總和達(dá)到99.58%，說明PC1和PC2幾乎能解釋全部原始變量的信息。對照組與Nisin組圖形有一定的重疊，說明添加Nisin對蟠龍菜樣品的風(fēng)味無明顯影響；從PC1軸來說，香芹酚組與對照組的橢圓幾乎不存在重合，表明添加香芹酚的蟠龍菜風(fēng)味相較于對照組差異較大。對照組與ε-PL組圖形彼此獨(dú)立，但在PC1軸上存在一定的重合。結(jié)合雷達(dá)圖和PCA圖，香芹酚組具有獨(dú)特氣味，Nisin組的氣味與對照組更為接近，與感官評價(jià)結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

ε-PL、Nisin和香芹酚對蟠龍菜中優(yōu)勢腐敗菌抑制效果較好。添加香芹酚能有效減緩pH值下降、脂肪氧化和揮發(fā)性鹽基氮的生成，從而延緩蟠龍菜的腐敗，但會顯著降低蟠龍菜的風(fēng)味及可接受性（P＜0.05）。添加Nisin或ε-PL的蟠龍菜微觀結(jié)構(gòu)中孔隙較少且結(jié)構(gòu)更為致密。相較于其他天然保鮮劑，添加Nisin的蟠龍菜風(fēng)味與對照組更為接近，且感官評分最高。使用PLSR及熵權(quán)法結(jié)合加權(quán)灰色關(guān)聯(lián)度對4 項(xiàng)貯藏指標(biāo)進(jìn)行分析，貯藏25 d時(shí)，加權(quán)灰色關(guān)聯(lián)度較高的是Nisin（0.405 9）和香芹酚（0.387 6），表明Nisin和香芹酚的添加能有效改善蟠龍菜貯藏過程中的微生物及理化品質(zhì)。綜合分析得出，Nisin能在不改變蟠龍菜風(fēng)味的同時(shí)有效抑制冷藏過程中微生物的生長繁殖及蛋白質(zhì)和脂肪氧化，提高其貯藏品質(zhì)。本研究為蟠龍菜工業(yè)化生產(chǎn)中的天然保鮮劑選擇及蟠龍菜產(chǎn)品貯藏過程安全性風(fēng)險(xiǎn)的控制提供了一定的理論支持。

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