摘要 ［目的］建立畜類肉串產(chǎn)品中常見(jiàn)的黃牛、綿羊和豬源性成分的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)肉串制品中動(dòng)物源性成分的快速鑒別。［方法］比較磁珠法和柱膜法對(duì)肉糜組織中DNA的提取效果，優(yōu)化實(shí)時(shí)熒光PCR多重檢測(cè)方法，比較58、60 ℃ 2個(gè)退火溫度下黃牛、綿羊、豬源性成分?jǐn)U增效果。［結(jié)果］試驗(yàn)采用的2種DNA提取方法效果相似，DNA溶液的A260/A280值均能滿足PCR檢測(cè)要求;58 ℃為最優(yōu)退火溫度，此時(shí)黃牛、綿羊、豬源性成分均能有效擴(kuò)增，且最低檢出的DNA濃度均為10-3 ng/μL。方法中用到的引物和探針特異性較好，均未產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。［結(jié)論］試驗(yàn)建立的黃牛、綿羊和豬源性成分的多重PCR檢測(cè)方法能為肉制品中動(dòng)物源性成分的快速定性分析提供方法參考。

關(guān)鍵詞 黃牛;綿羊;豬;源性成分;實(shí)時(shí)熒光多重PCR

中圖分類號(hào) TS251.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2024）18-0184-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.18.039

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Detection Method for Pig，Cow and Sheep Derived Components by Multiple Fluorescence PCR in Meat Skewer Products

YAO Yan-ling，ZHOU Yu-dong，WANG Wen-yu et al

（Jiaxing Testing Institute for Food，Drug and Product Quality Control，Jiaxing，Zhejiang 314050）

Abstract ［Objective］To establish a multiple fluorescence PCR detection method for common cattle，sheep and pig derived components in animal meat skewer products，and to achieve rapid identification of animal derived components in meat skewer products.［Method］Compared the extraction effect of DNA from meat mince tissue using magnetic bead method and column membrane method，optimized the real-time fluorescence PCR multiple detection method，and compared the amplification effect of cattle，sheep，and pig derived components at two annealing temperatures of 58 and 60 ℃.［Result］The two DNA extraction methods used in the experiment had similar effects，and the A260/A280 values of the DNA solution could meet the requirements of PCR detection.58 ℃ was the optimal annealing temperature，at which point the cattle，sheep and pig derived DNA could be effectively amplified，and the lowest detected DNA concentration was 10-3 ng/μL.The primers and probes used in the method had good specificity and had not produced non-specific amplification.［Conclusion］The multiplex PCR detection method established by the application scope experiment for cattle，sheep and pig origin can provide a method reference for rapid qualitative analysis of animal origin components in meat products.

Key words Cattle;Sheep;Pig;Derived component;Real-time fluorescence multiplex PCR

基金項(xiàng)目 浙江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局雛鷹計(jì)劃培育項(xiàng)目（CY2023322）。

作者簡(jiǎn)介 姚艷玲（1980—），女，浙江嘉興人，高級(jí)工程師，碩士，從事食品微生物及分子生物檢測(cè)研究。

收稿日期 2023-10-28

燒烤食品近年來(lái)備受年輕人喜愛(ài)，尤其以豬、牛、羊等畜肉類肉串最為常見(jiàn)，因其含有多種維生素、氨基酸，且燒烤口味鮮美，深受年輕人青睞，也豐富了人們的餐桌文化。隨著市場(chǎng)上豬肉、牛肉和羊肉價(jià)格差距的拉大，某些商販在肉制品加工過(guò)程中摻假售假，通過(guò)牛羊油浸泡，或者牛羊類香精香料及調(diào)味料添加等方式處理后，冒充牛、羊肉進(jìn)行銷售，損害了消費(fèi)者利益，也給食品安全帶來(lái)了風(fēng)險(xiǎn)。目前，食品中動(dòng)物源性成分的鑒定主要是通過(guò)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、紅外光譜技術(shù)等［1-3］，隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)的快速發(fā)展，動(dòng)物源性的鑒別檢驗(yàn)也有了相關(guān)研究。在動(dòng)物源性定量檢測(cè)方面，有研究者通過(guò)PCR技術(shù)、定量PCR技術(shù)或者數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)肉制品和其他食品中的豬、牛、羊、兔等動(dòng)物源性成分進(jìn)行定量檢測(cè)分析［4-12］;在定性檢測(cè)方面，采用探針?lè)≒CR技術(shù)、SYBR實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)、PCR可視化檢測(cè)技術(shù)等對(duì)肉制品的動(dòng)物源性成分進(jìn)行多重檢測(cè)研究［13-21］。

上述研究在肉源性鑒別方面有了較大的進(jìn)展，但由于大多研究立足于生鮮肉制品，而針對(duì)市場(chǎng)上常見(jiàn)的經(jīng)過(guò)調(diào)味料腌制的肉串制品的摻假研究較少，且部分調(diào)味料對(duì)DNA模版提取及PCR檢測(cè)過(guò)程中存在一定的干擾，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，筆者以豬、牛、羊源性肉串制品為研究對(duì)象，建立多重實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)方法，為日常肉串產(chǎn)品的快速篩查提供方法參考，滿足肉制品監(jiān)管需求。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑。

DNA Extraction Kit Ver.5.0［寶生物工程（大連）有限公司］，Prepito DNA Tissue 10 Kit［鉑金埃爾默醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品（上海）有限公司］。實(shí)時(shí)熒光PCR試劑為Premix Ex TaqTM PCR預(yù)混試劑［寶生物工程（大連）有限公司］。試驗(yàn)用水為一級(jí)純化水。

1.1.2 引物探針。

該研究采用的黃牛、綿羊和豬的引物、探針見(jiàn)表1，參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 38164—2019，根據(jù)儀器檢測(cè)通道，設(shè)計(jì)探針，引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 儀器設(shè)備。

Roche LightCycler 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR，羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司;全自動(dòng)核酸提取儀，鉑金埃爾默醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品（上海）有限公司;Nanodrop one超微量分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司;MK 10干式恒溫器，杭州奧盛儀器有限公司;Legend Micro 21R離心機(jī)，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA模板提取。由于該試驗(yàn)針對(duì)的樣品為經(jīng)過(guò)腌制的肉串制品，因此從市場(chǎng)上采購(gòu)了經(jīng)調(diào)味料腌制的黃牛肉串。該肉串樣品處理分為2組，一組樣品在DNA提取前，先用70%乙醇進(jìn)行浸泡，然后用純化水進(jìn)行多次漂洗，除去大部分調(diào)味料，還原肉組織的原色，再進(jìn)行DNA提取;另一組不做任何處理，直接提取DNA。同時(shí)把已知黃牛肌肉組織作為對(duì)照組，比較3組樣品的DNA提取效果。

該試驗(yàn)比較了磁珠法和柱膜法對(duì)動(dòng)物組織DNA的提取效果。磁珠法采用的是全自動(dòng)核酸提取儀進(jìn)行DNA提取，分別稱取上述3組樣品各10 mg，加入裂解液和蛋白酶K后，經(jīng)56 ℃裂解，直到組織完全溶解，把裂解液加入深孔板中，用全自動(dòng)核酸提取儀進(jìn)行DNA提取。柱膜法則使用商品化的試劑盒進(jìn)行手工提取，分別稱取上述3組樣品各20 mg于1.5 mL離心管中，加裂解液、蛋白酶K和RNase A，經(jīng)56 ℃溫育3 h后，吸上清液于新的1.5 mL離心管中，加200 μL緩沖液和200 μL無(wú)水乙醇，充分混勻，然后將液體全部加入吸附小柱內(nèi)，將吸附小柱裝入配套收集管中，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行DNA提取。用超微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)DNA溶液的濃度和純度。

1.2.2 多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法的建立。

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，把3種動(dòng)物源性的上、下游引物（10 μmol/L）分別按等體積混合，制成上、下游混合引物，同時(shí)把3種動(dòng)物源性的探針（10 μmol/L）也按等體積混合，制成混合探針。反應(yīng)體系配制：Premix Ex TaqTM PCR預(yù)混試劑10.0 μL，上、下游混合引物各0.4 μL，混合探針0.8 μL，模板DNA為2.0 μL，反應(yīng)體系共20 μL，剩余體積用無(wú)菌去離子水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性 5 s，退火溫度58 ℃，延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.3 靈敏度試驗(yàn)。

取黃牛、綿羊和豬3種肌肉組織中提取的DNA溶液，

以10倍系列稀釋的方法，用純化水分別稀釋至10、100、10-1、10-2、10-3、10-4 ng/μL，用制成的DNA溶液進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)。

1.2.4 特異性試驗(yàn)。

選取黃牛、牦牛、山羊、綿羊和豬5種常見(jiàn)畜類動(dòng)物的肉糜，按質(zhì)量等比例混合后，提取混合DNA模板，配制反應(yīng)體系、設(shè)置PCR反應(yīng)條件，對(duì)3種目標(biāo)動(dòng)物源性成分的引物和探TxDgUgYTeTTroSr9f1+Sfg==針進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

按照“1.2.1”方法提取DNA，比較2種方法對(duì)肌肉組織中DNA的提取效果，每種方法做6個(gè)平行試驗(yàn)，計(jì)算樣品中DNA濃度、A260/A280的平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，2種方法提取的DNA效果較為接近。但是未經(jīng)預(yù)處理的肉制品組織中提取DNA溶液的A260/A280值不能滿足PCR檢測(cè)需要，說(shuō)明肉串中的各種調(diào)味料對(duì)DNA提取或檢測(cè)存在一定干擾。因此，經(jīng)調(diào)味料腌制過(guò)的樣本在提取DNA之前需經(jīng)過(guò)預(yù)處理，其提取效果才能滿足PCR檢測(cè)需求。該試驗(yàn)后續(xù)檢測(cè)用DNA模板均采用柱膜法提取。

2.2 多重?zé)晒釶CR檢測(cè)分析

為了能同時(shí)對(duì)黃牛、綿羊和豬3種動(dòng)物源性成分進(jìn)行多重檢測(cè)，在設(shè)計(jì)探針時(shí)選取FAM、CY5和VIC這3個(gè)通道，并優(yōu)化檢測(cè)方法。根據(jù)“1.2.2”配制反應(yīng)體系，把3對(duì)引物和3個(gè)探針等比例混合，配制成混合引物和混合探針，并比較了58、60 ℃ 2種常用退火溫度下的擴(kuò)增效果。結(jié)果顯示，在退火溫度60 ℃時(shí)，黃牛和豬源性成分均能有效擴(kuò)增，但綿羊源性成分?jǐn)U增效果不佳；在退火溫度為58 ℃時(shí)，3種目標(biāo)物源性成分均能有效擴(kuò)增。綿羊源性成分在2種退火溫度下的擴(kuò)增結(jié)果圖1。因此，在混合體系下，退火溫度設(shè)置為58 ℃，黃牛、綿羊和豬3種動(dòng)物源性成分均能有效擴(kuò)增。

2.3 靈敏度試驗(yàn)

試驗(yàn)將黃牛、綿羊和豬的DNA溶液均稀釋至10 ng/μL，然后按照10倍稀釋梯度進(jìn)行稀釋，制成100、10-1、10-2、10-3、10-4 ng/μL的DNA混合梯度稀釋液，在混合體系下，退火溫度設(shè)置為58 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)濃度擴(kuò)增時(shí)做3個(gè)平行試驗(yàn)，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。

擴(kuò)增后Ct值的平均值結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，當(dāng)DNA濃度從100 ng/μL逐漸降低至10-3 ng/μL時(shí)，黃牛、綿羊和豬源性成分在多重檢測(cè)體系中均擴(kuò)增良好；當(dāng)DNA濃度為10-4 ng/μL 時(shí)，3種目標(biāo)物源性成分的Ct值均超過(guò)35.00。因此，試驗(yàn)建立的多重檢測(cè)方法中黃牛、綿羊和豬源性成分的方法檢出限均為10-3 ng/μL。

2.4 特異性試驗(yàn)

選取黃牛、牦牛、山羊、綿羊和豬5種畜類動(dòng)物的肉糜，按質(zhì)量等比例混合后，提取DNA溶液，在黃牛、綿羊和豬的混合檢測(cè)體系中進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3～5。

由圖3～5可知，通過(guò)該研究建立的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法能在常見(jiàn)的動(dòng)物源性肉制品混合DNA溶液中檢出目標(biāo)黃牛、綿羊和豬源性成分，而其余非目標(biāo)源性成分均未檢出。可見(jiàn)，該方法建立的多重檢測(cè)體系采用的引物和探針特異性

較好，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，能實(shí)現(xiàn)多重快速檢測(cè)。

2.5 肉串樣本檢測(cè)

以市場(chǎng)上采購(gòu)的12批牛肉串和12批羊肉串為樣本，按試驗(yàn)建立的方法進(jìn)行源性成分鑒定分析，同時(shí)按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 38164—2019分別進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，12批次牛肉串樣品中均檢出牛源性成分，其中有2批樣本也同時(shí)檢出了豬源性成分;12批次羊肉串中都檢出了羊源性成分，其中有5批同時(shí)檢出了豬源性成分。采用國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果與該試驗(yàn)建立的方法一致。

3 討論

該試驗(yàn)以市場(chǎng)上常見(jiàn)的經(jīng)調(diào)味或腌制的牛肉、羊肉和豬肉串為研究對(duì)象，對(duì)肉串制品進(jìn)行預(yù)處理后，采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)，建立了黃牛、綿羊和豬的多重?zé)晒釶CR的定性檢測(cè)方法，方法的檢出限達(dá)到10-3 ng/μL。該法的引物、探針特異性較好，建立的多重檢測(cè)體系能有效地對(duì)混合肉制品樣本中的黃牛、綿羊和豬源性成分進(jìn)行定性鑒別，為動(dòng)物源性成分的多重鑒定分析提供方法參考。

采用該研究建立的多重檢測(cè)方法對(duì)市場(chǎng)上的烤肉串進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示部分肉串制品中檢出多種源性成分，推測(cè)原因主要有：市場(chǎng)上采購(gòu)的畜禽肉產(chǎn)品及其加工制品，在生產(chǎn)加工過(guò)程中加入牛風(fēng)味、羊風(fēng)味等香精香料滾揉進(jìn)了肌肉組織內(nèi);有些肉串為多種源性肉組織混合加工;或者有些產(chǎn)品在加工過(guò)程中使用的工器具未按產(chǎn)品類別分開(kāi)使用，存在

交叉污染，使得通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)源性成分時(shí)，存在多種動(dòng)物源性都被檢出的情況，一定程度上影響了真實(shí)源性成分的

判斷。因此，在動(dòng)物源性成分鑒別分析時(shí)，除了定性檢測(cè)以

外，還應(yīng)該引入定量分析方法，只有2種方法結(jié)合應(yīng)用，才能更準(zhǔn)確地反映肉制品的真實(shí)來(lái)源。

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