摘要 通過天然4倍體（4n=100）和2倍體（2n=50）泥鰍雜交創(chuàng)制不同子代雜交組合（4n♀×2n♂、2n♀×4n♂）。以傳代20次的雜交3倍體泥鰍鰭細胞系為材料，采用常規(guī)冷滴片法制備染色體標本，通過吉姆薩染色確定數(shù)目及核型；通過銀染法及CMA3/DA/DAPI三重?zé)晒馊旧夹g(shù)對其進行帶型分析。結(jié)果顯示：正反交3倍體鰭細胞系的染色體分裂相數(shù)目為3n=75，核型公式15m + 6sm + 54t，NF=96；正反交3倍體泥鰍鰭細胞系的染色體分裂相中顯示有3個銀染點，均位于第1組中部著絲粒染色體（M1）短臂的端部區(qū)域；正反交3倍體泥鰍鰭細胞的染色體中期分裂相中顯示有3個CMA3熒光信號點，均位于M1區(qū)域。研究表明：雜交3倍體泥鰍鰭細胞經(jīng)細胞培養(yǎng)傳代20次后的染色體組成未發(fā)生改變，其染色體數(shù)目、核型和帶型與3倍體泥鰍其他體細胞結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞 雜交3倍體泥鰍;鰭細胞系;核型分析;銀染;CMA3/DA/DAPI

中圖分類號 S966.4 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）18-0067-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.18.015

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Study on Chromosome Composition of Hybrid Triploid Loach （Misgurnus anguillicaudatus） Fin Cell Line

GUO Wen-xuan，ZHOU Zi-yu，MA Ke-xin et al

（College of Aquatic and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023）

Abstract In this study，a natural tetraploid loach （4n=100） was crossed with a diploid loach （2n=50） thus creating the different offspring hybrid combinations （4n♀×2n♂，2n♀×4n♂）.Chromosome samples of hybrid triploid loach fin cell passed for 20 times were prepared via conventional cold drop method.The chromosome number and karyotype were determined via Giemsa staining; Banding analysis were conducted via Ag-NORs and CMA3/DA/DAPI staining.The results showed that the metaphase chromosome number of the fin cells of the hybrid triploid loach was 3n=75，and the karyotype formula was 15m+6sm+54t，NF=96;three silver staining signal points were observed in the chromosome metaphase of hybrid triploid loach fin cells，located at the end region of the first pair of central centromeric chromosomes （M1）;there were three CMA3 signal points in the chromosome metaphase of hybrid triploid loach fin cells，which were located at the region of chromosomes （M1）.The study showed that the chromosome composition of hybrid triploid loach fin cells remained unchanged after 20 times of cell culture passage，and the chromosome number，karyotype and band type were consistent with other somatic chromosomes of triploid loach.The results laid the foundation for the cytogenetics of hybrid triploid loach and provided a theoretical basis for cytogenetics of triploid loaches.

Key words Hybrid triploid loach;Fin cell line;Karyotype analysis;Ag-NORs;CMA3/DA/DAPI

基金項目 國家自然科學(xué)基金項目（31272650）。

作者簡介 郭文軒（1999—），女，遼寧葫蘆島人，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)遺傳育種與繁殖。*通信作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事水產(chǎn)動物繁殖育種研究。

收稿日期 2023-10-24

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鰍科（Cobitidae）泥鰍屬（Misgurnus），是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的潛力產(chǎn)品［1］。據(jù)報道，泥鰍存在自然多倍化現(xiàn)象，在我國的天然水域中已發(fā)現(xiàn)5種不同倍性的泥鰍種類，包括2倍體（2n=50）、3倍體（3n=75）、4倍體（4n=100）、5倍體（5n=125）和6倍體（6n=150）［2-4］。多倍體泥鰍普遍具有個體大、生長快及適應(yīng)性強等優(yōu)良的經(jīng)濟性狀，具有很大的育種潛力［5］。通過化學(xué)或物理等誘導(dǎo)方法培育3倍體存在價格較貴，成功率較低等問題，而4倍體與2倍體泥鰍雜交的方式可以穩(wěn)定高效地獲得3倍體［6-8］。Li等［9-10］研究發(fā)現(xiàn)，天然4倍體泥鰍是遺傳4倍體，可產(chǎn)生正常的卵子（2n）和精子（2n），并通過天然2倍體和4倍體泥鰍成功創(chuàng)制雜交3倍體子代。

魚類細胞培養(yǎng)作為重要的試驗技術(shù)，為遺傳學(xué)、病毒學(xué)和生理學(xué)等研究提供了試驗基礎(chǔ)。據(jù)報道，該技術(shù)始于20世紀60年代［11］，隨后眾多魚類組織細胞系相繼成功建立。其組織種類多樣，如腎臟、鰭、鰾、性腺和肝臟等［12］。鰭細胞相較于其他類型體細胞的優(yōu)勢在于鰭是可再生器官，既能保護試驗材料，又可以重復(fù)利用，更有利于物種細胞遺傳學(xué)的相關(guān)研究。近年來，有研究已將傳代培養(yǎng)的鰭細胞作為材料成功應(yīng)用在2倍體和4倍體泥鰍的染色體研究中［13-14］。為探究正反交3倍體泥鰍鰭細胞經(jīng)細胞培養(yǎng)傳代后的染色體組構(gòu)成，筆者以不同3倍體雜交組合（4n♀×2n♂，2n♀×4n♂）為研究對象，通過鰭細胞體外培養(yǎng)法獲得正反交后代鰭組織傳代20代細胞后，分別采用傳統(tǒng)吉姆薩染色法、銀染法和CMA3/DA/DAPI三重?zé)晒馊旧▽ζ溥M行核型及帶型分析，旨在為泥鰍的細胞遺傳學(xué)研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

親本4倍體泥鰍采自湖北省武漢市，2倍體泥鰍采自遼寧省大連市。選取發(fā)育良好的親本進行人工催產(chǎn)及雜交，獲得4n♀×2n♂，2n♀×4n♂ 2種雜交組合，孵育溫度（25±1） ℃，暫養(yǎng)于大連海洋大學(xué)養(yǎng)殖樓水族箱中。正反交后代各選取5尾，體長及體重見表1。

1.2 鰭細胞培養(yǎng)及染色體標本制備

2種雜交組合（4n♀×2n♂，2n♀×4n♂）各選取5尾泥鰍的部分鰭組織進行培養(yǎng)，原代及傳代培養(yǎng)方法均參照張博等［12］的方法進行。采用常規(guī)染色體標本制備方法［15］，將得到的20代鰭細胞放入秋水仙素溶液（0.1 mg/mL）25 ℃下恒溫培養(yǎng)3 h，用C6H5Na3O7溶液（0.8%）低滲40 min，卡諾固定液（CH3OH∶CH3COOH=3∶1，現(xiàn)用現(xiàn)配）固定15 min，重復(fù)3次后放入-20 ℃冰箱中。冷滴片法制備染色體標本后，用10% Giemsa染液作用45 min，蒸餾水沖洗后自然風(fēng)干，置于普通光學(xué)顯微鏡（Leica DM 2 000）下鏡檢拍照。

1.3 染色體數(shù)目統(tǒng)計及核型

4倍體與2倍體泥鰍正反交后代均選取50個分散均勻的中期分裂相（10個分裂相/每尾魚）進行數(shù)目統(tǒng)計。根據(jù)Levan等［16］方法，對分散均勻的分裂相進行核型分析，得出核型公式。

1.4 銀染

參照Howell快速銀染法［17］，并根據(jù)實際情況稍作改進。向65 ℃恒溫箱預(yù)熱2 h的玻片上按照體積比2∶1滴加50% AgNO3溶液與2%明膠溶液，蓋上蓋玻片，65 ℃黑暗條件下處理1～2 min，每隔30 s觀察染色程度，當(dāng)染成茶褐色時取出，自來水沖洗后自然風(fēng)干。置于普通光學(xué)顯微鏡（Leica DM 2 000）下鏡檢拍照。

1.5 CMA3/DA/DAPI三重?zé)晒馊旧?/p>

根據(jù)Schweizer等［18-19］方法，并根據(jù)實際情況略微改進。將染色體標本置于65 ℃恒溫箱預(yù)熱2 h后滴加0.5 mg/mL CMA3，黑暗條件下作用60 min；依次放入0.1 mg/mL DA和DAPI染缸染色15 min。MI緩沖液洗缸中漂洗。洗耳球吹干，滴加封片劑（丙三醇∶緩沖液=1∶1），4 ℃冰箱保存，置于熒光顯微鏡（Leica DM 2 000）下鏡檢拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目及核型分析

從4倍體與2倍體泥鰍正反交后代4n♀×2n♂，2n♀×4n♂傳代20次的鰭細胞中期分裂相中選取形態(tài)清晰且分散良好的50個中期分裂相進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示：正反交每尾個體的10個分裂相眾數(shù)均為75條，個體間不存在差異；4n♀×2n♂后代的染色體數(shù)目為70 ～ 79條，眾數(shù)為75條，占比70%；2n♀×4n♂后代的染色體數(shù)目為72 ～ 79條，眾數(shù)為75條，占比66%（表2）。正反交后代鰭組織培養(yǎng)20代的細胞染色體數(shù)目均為3n=75（圖1a、圖1c），核型公式為3n=15m+6sm+54t，NF = 96（圖1b、圖1d）。

2.2 Ag-NORs分析

4倍體與2倍體泥鰍正反交后代（4n♀×2n♂，2n♀×4n♂）傳代20次的鰭細胞中期分裂相均顯示3個Ag-NORs（圖2a、圖2c）；根據(jù)核型分析可知，正反交后代染色體的NORs均位于第1組中部著絲粒染色體（M1）短臂的末端位置（圖2b、圖2d）。

2.3 CMA3/DA/DAPI分析

4倍體與3倍體泥鰍正反交后代（4n♀×2n♂，2n♀×4n♂）傳代20次的鰭細胞染色體標本經(jīng)CMA3/DA/DAPI三重?zé)晒馊旧幚砗螅x擇分散良好的中期分裂相鏡下觀察。結(jié)果顯示：用藍光（λ=360～400 nm）激發(fā)，在正反交后代的中期分裂相中可觀察到3條DA/DAPI熒光帶（圖3a、圖3d）；用藍光（λ=440～480 nm）激發(fā)，正反交后代的中期分裂相中均表現(xiàn)出3個CMA3陽性部位（圖3b、圖3e）；由核型分析可知，CMA3陽性位點位于第1組中部著絲粒染色體（M1）短臂的末端部位（見圖3c、圖3f）。

3 討論

3.1 鰭細胞系染色體核型及帶型

既往研究表明，物種在進化過程中通常伴隨著遺傳物質(zhì)的變化［20］。染色體作為生物重要的遺傳物質(zhì)，目前對其研究主要集中在核型及帶型分析方面。核型分析作為細胞遺傳學(xué)的基礎(chǔ)，是研究生物染色體變化的簡單、直觀的方法，包括對染色體數(shù)目、著絲點位置、臂比及配對方式進行分析［21］。染色體顯帶技術(shù)作為帶型分析的主要方法，其原理是將處理后的染色體用特定的染料染色后，使其呈現(xiàn)出亮暗分明的橫紋。常用的帶型分析方法主要包括C帶（Centromere）技術(shù)、N帶（N-banding）技術(shù)和DNA雜交顯帶技術(shù)等［22］。銀染法和CMA3/DA/DAPI三重?zé)晒馊旧鳛轸~類較為成熟的N帶技術(shù)，已經(jīng)在鱸魚（Lateolabrax japonicus）、納木錯裸鯉（Gymnocypris namensis）和斑石鯛（Oplegnathuspunctatus）等魚類中廣泛應(yīng)用［23-25］。2種技術(shù)都是與染色體的核仁組織區(qū)（NORs）特異性結(jié)合。不同物種之間NORs具有多態(tài)性，NORs的數(shù)量變化、分布規(guī)律是研究生物間親緣關(guān)系、物種進化和遺傳變異的重要參考指標。銀染法主要作用于NORs的酸性蛋白部分，而CMA3熒光染料主要識別NORs處的rDNA位置。2種方法結(jié)合使用可以更準確地鑒別NORs的位置和數(shù)目。

該研究選取第20代的泥鰍鰭細胞系作為試驗材料進行染色體標本制備，采用吉姆薩染色法，銀染法和CMA3/DA/DAPI三重?zé)晒馊旧▽ζ溥M行核型及帶型分析。結(jié)果顯示，傳代培養(yǎng)20次的鰭細胞染色體出現(xiàn)了非整倍體的現(xiàn)象，但正反交后代染色體數(shù)目為75條的比例分別達到70%和66%。雜交3倍體泥鰍核型公式為15m+6sm+54t，NF=96。該結(jié)果與3倍體泥鰍鰓和腎細胞染色體數(shù)目及核型一致［26］；銀染法和CMA3/DA/DAPI3重?zé)晒馊旧ň捎^察到3個

NORs點，這與雜交3倍體泥鰍胚胎染色體的帶型分析結(jié)果一致［27］。李雅娟等［14］對4倍體和2倍體泥鰍鰭細胞的染色

體帶型研究發(fā)現(xiàn)，NORs點均位于第1組中部著絲粒染色體（M1）短臂的端部區(qū)域。梁雨婷等［28］對雜交3倍體泥鰍×2倍體泥鰍（2n♀×3n♂、3n♀×2n♂）雜交后代的染色體帶型研究發(fā)現(xiàn)，2種組合的熒光原位雜交信號同樣位于染色體（M1）短臂的端部區(qū)域。該研究發(fā)現(xiàn)，正反交3倍體后代的NORs點與2倍體、3倍體及4倍體泥鰍其他體細胞染色體的NORs點位置一致。該結(jié)果表明，雜交3倍體泥鰍是具有3套染色體組的3倍體。

3.2 鰭細胞系穩(wěn)定性分析

魚類細胞系相較于傳統(tǒng)試驗材料具有成本低、重復(fù)性好等活魚不具備的很多優(yōu)勢。在魚類細胞的傳代培養(yǎng)過程中，隨著傳代次數(shù)的無限次增加可能導(dǎo)致染色體形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生變異［29］。染色體數(shù)目及核型是鑒別細胞系種屬及體外培養(yǎng)條件下細胞遺傳特性是否發(fā)生改變的重要依據(jù)［30-31］。大多數(shù)魚類細胞系，在前幾十次傳代培養(yǎng)過程中，染色體數(shù)目與形態(tài)均不會發(fā)生改變。據(jù)報道，大瀧六線魚和斑石鯛腎臟組織系可穩(wěn)定傳代至35代和24代，染色體核型和數(shù)目均未發(fā)生改變［32-33］。但由于傳代次數(shù)的增加，少數(shù)細胞系可能會出現(xiàn)染色體變異現(xiàn)象。王旭波等［34］對牙鲆鰓細胞系傳代57次后，發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目不變但形態(tài)發(fā)生改變；傳代296次后，發(fā)現(xiàn)很多小型染色體且染色體個數(shù)約為正常染色體數(shù)目的2倍；張雪萍等［35］對青魚鰭細胞組織系傳代41次后，發(fā)現(xiàn)其染色體數(shù)目發(fā)生改變。造成這種結(jié)果的原因可能是由于傳代培養(yǎng)過程中的細胞處于不斷分裂的狀態(tài)，傳代次數(shù)的增加可能導(dǎo)致染色體端粒逐漸縮短，端粒的缺失會使細胞染色體出現(xiàn)多次的加倍、易位和斷裂等情況，最終引起染色體出現(xiàn)數(shù)目和形態(tài)的變異。該研究通過對鰭細胞系染色體組構(gòu)成的研究發(fā)現(xiàn)，雜交3倍體泥鰍的鰭組織細胞在體外培養(yǎng)的情況下可穩(wěn)定傳代至20代，染色體未發(fā)生數(shù)目及核型變異，可用于細胞遺傳學(xué)相關(guān)研究。至于雜交3倍體泥鰍鰭細胞系傳代20次后的染色體數(shù)目和核型是否發(fā)生變化仍需進一步研究。

綜上所述，該研究確認了天然4倍體泥鰍與2倍體正反交后代鰭細胞傳代培養(yǎng)20次的染色體核型公式為3n=15m+6sm+54t，NF=96；通過銀染法和CMA3/DA/DAPI三重?zé)晒馊旧夹g(shù)對其進行帶型分析，確定了雜交3倍體泥鰍的NORs點為3個，位于第1組中部著絲粒染色體（M1）短臂末端。這與其他體細胞的染色體組構(gòu)成結(jié)果一致，表明雜交3倍體泥鰍的鰭細胞系可穩(wěn)定傳代至20代。該結(jié)果不僅為泥鰍的細胞遺傳學(xué)奠定基礎(chǔ)，也為后續(xù)泥鰍遺傳學(xué)、病毒學(xué)和免疫學(xué)等研究提供參考依據(jù)。

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