摘要 ［目的］對安徽某土雞場送檢的疑似腫瘤病的病料進行鑒定。［方法］采集病死雞的肝臟，提取病毒DNA，根據(jù)Genbank已登錄的基因序列設計引物，通過PCR檢測，對擴增出的ALV env與MDV meq基因序列進行測序和序列分析。［結(jié)果］檢測到禽白血病和馬立克目的條帶，序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，禽白血病病毒為J亞群，馬立克為野毒強毒株。［結(jié)論］研究結(jié)果為了解該地區(qū)禽白血病和馬立克混合感染情況提供了參考數(shù)據(jù)。

關鍵詞 禽白血病；馬立克；PCR；序列分析

中圖分類號 S852.65 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）18-0058-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.18.013

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Diagnosis and Analysis of a Case of Mixed Infection ALV and MDV from Home-kept Chicken

HU Xiao-miao，YIN Dong-dong，SHEN Xue-huai et al

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine ， Anhui Academy of Agricultural Sciences/Livestock and Poultry Epidemic Diseases Research Center of Anhui Province/Anhui Province Key Laboratory of Livestock and Poultry Product Safety Engineering， Hefei， Anhui 230031）

Abstract ［Objective］To identify samples of suspected tumor disease from a local chicken farm in Anhui Province.［Method］The chicken liver was collected and the virus DNA was extracted.The primers were designed according to the sequence of ALV and MDV that GenBank had registered.The ALV env and MDV meq gene were detected by PCR.The amplified sequence was sequenced and analyzed by evolutionary tree and nucleotide homology.［Result］Detected bands of ALV and MD， and sequence alignment results showed that ALV belongs to subgroup J， while MD is a strong wild virus strain.［Conclusion］This study provided reference data for understanding the mixed infection situation of ALV and MDV in the area.

Key words Avian leukosis（AL）;Marek’s disease（MD）;PCR;Sequence analysis

基金項目 安徽省重點研究與開發(fā)計劃項目（202204c06020039）；安徽省家禽產(chǎn)業(yè)技術體系（AHCYJSTX-06）;安徽農(nóng)科院平臺項目（2023YL013）；國家蛋雞產(chǎn)業(yè)技術體系合肥綜合試驗站（CARS-40-S10）。

作者簡介 胡曉苗（1971—），男，安徽望江人，助理研究員，博士，從事家禽傳染病研究。*通信作者，副研究員，碩士，從事畜禽傳染病防治研究。

收稿日期 2023-11-09

目前，引起家禽傳染性腫瘤病主要有2種，即禽白血病毒引起禽白血?。╝vian leukosis，AL）和皰疹病毒引起的馬立克氏病（Marek’s disease，MD）［1-2］。禽白血病病原為反轉(zhuǎn)錄病毒禽白血病病毒，它能引起禽免疫抑制，發(fā)生多種腫瘤，是國家明確提出雞場必須凈化的疫病之一［3-6］。馬立克氏病是由馬立克氏病病毒引起的一種淋巴組織增生性疾病，近年來出現(xiàn)接種了疫苗但仍有MD發(fā)病的現(xiàn)象，臨床上發(fā)病病理變化不典型［7］。這2種疫病都可使蛋雞的產(chǎn)能降低，會造成雞群不可逆性病變和死亡，是影響雞場經(jīng)濟效益的重要疾病。

2023年9月，安徽某土雞場雞群從90日齡出現(xiàn)發(fā)病癥狀，連續(xù)發(fā)病近30 d，雞群不斷死亡，經(jīng)臨床癥狀、剖檢變化、分子生物學診斷等方法將該病例確診為禽白血病與馬立克氏病混合感染，筆者對此進行了診斷與分析。

1 材料與方法

1.1 臨床癥狀 發(fā)病雞食欲不振，精神沉郁，被毛凌亂，閉眼，消瘦，3月齡5 000只每天死亡10只左右。

1.2 剖檢病變 對病重和病死雞進行剖檢，肝臟和脾臟腫大，表面有灰白色腫瘤樣壞死灶，心臟表面見灰白色腫瘤壞死灶，見圖1、圖2。綜合流行病學特點、臨床癥狀及剖檢病變判為疑似腫瘤性疾病，具體確診通過實驗室診斷來確定。

1.3 實驗室診斷 分子生物學診斷。

1.3.1 引物合成。根據(jù)GenBank上收錄的ALV env基因、MDV meq基因設計引物序列，禽白血病F：CTTTCTCTCGGGTCGACTTC，R：GTAAGCAGTCCAAGGGTCAC，預擴增條帶大小為592 bp，馬立克F：TCGGTGAGTCTTCTCTC，R：TTCAGCTGCTCCCTAATTC，預擴增條帶大小為348 bp。

1.3.2 目的基因擴增。取2 μL核酸配制PCR檢測體系，分別添加ALV-env基因、MDV-meq基因擴增引物進行基因擴增。PCＲ反應體系（ 20 μL）：2×Taq DNA聚合酶Mixture 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，加雙蒸水7 μL。PCR反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.3.3 PCR產(chǎn)物的電泳分析及測序。

取5 μL PCR產(chǎn)物擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外凝膠成像儀上觀察結(jié)果，確定為目的條帶后送上海生工生物工程有限公司測序。

1.3.4 序列分析。

對測序公司獲得的序列在NCBI網(wǎng)站上對所測毒株進行BLAST比對，同時利用MEGA 7.0、MegAlign進行基因序列同源性分析并繪制進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒鑒定結(jié)果

經(jīng)檢測，馬立克氏病、禽白血病核酸檢測為陽性，結(jié)果見圖3。將馬立克毒株命名為NKY-A，禽白血病毒株命名為 NKY-2022。

2.2 基因序列特征

將分離鑒定的ALV毒株命名為NKY2022株，其env基因與GenBank中13株ALV毒株進行序列比對分析，結(jié)果顯示，NKY2022株

與國內(nèi)分離的ALV-J亞群（如KX077613.seq）同處一個分支，親緣關系最近（圖4）。同源性分析結(jié)果顯示，NKY2022株與ALV-J亞群的核苷酸同源性為96.2%～100%，與其他亞型的同源性為54.7%～55.7%（圖5）。

將分離鑒定的MDV毒株命名為NKY-A株，其meq基因與GenBank中15株MDV毒株進行序列比對分析，結(jié)果顯示，NKY-A株與國內(nèi)外MDV毒株（如LC385872.1）不在同一分支（圖6），同源性結(jié)果顯示，NKY-A株與參考強毒株的核苷酸同源性為97.6%～99.0%（圖7）。

3 討論

近年來雖然國內(nèi)出現(xiàn)接種疫苗，但是雞群依然發(fā)病的情況時有發(fā)生，尤其多病原的混合感染造成雞生長抑制，產(chǎn)蛋性能下降，出現(xiàn)免疫抑制現(xiàn)象，甚至引發(fā)雞群產(chǎn)生腫瘤和死亡等，給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大損失［8-10］。該研究通過對發(fā)病雞進行病原核酸檢測，結(jié)果表明，發(fā)病雞存在ALV-J與MDV的混合感染。土雞是肉蛋兼用型雞，深受群眾喜愛，如果存在這2種疫病的混合感染，將會對家禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。安徽省是土雞養(yǎng)殖大省，土雞品種豐富，擁有眾多的國家級或省級土雞保種場，土雞免疫抑制病的防控對土雞品種的保護和鄉(xiāng)村振興具有重要意義。

ALV缺乏可供使用的疫苗，也沒有特效的治療藥物，只能靠凈化。在生產(chǎn)中，禽群中一旦發(fā)生ALV，一般只能作淘汰處理。MD是唯一可以用疫苗進行防治的腫瘤性疾病。雖然MD有可供使用的疫苗，但由于雞群存在垂直傳播性疾病，影響雞群免疫系統(tǒng)免疫應答，疫苗難以產(chǎn)生足夠抗體抵抗野毒株感染而導致免疫失敗。ALV和 MDV都能使雞群機體產(chǎn)生免疫抑制，共同感染2種病毒可加重發(fā)病嚴重程度，還能引起其他疫病混合感染［11］，故應引起足夠的重視。

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