摘要：建立高效液相色譜法測定桃膠中3種主要類黃酮物質(zhì)含量的分析方法，并用于比較3省份桃膠中類黃酮含量差異。取0.5 g桃膠經(jīng)10 mL 80%甲醇水超聲提取30 min，于6 500 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，采用SunFire C18色譜柱，以乙腈-甲酸水（體積比40 ∶60）做流動相，在287 nm波長下進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，3種類黃酮物質(zhì)在0.5～100.0 mg/L范圍內(nèi)線性良好，決定系數(shù)大于0.999，添加回收率范圍分別是92.3%～105.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.3%～7.2%之間，方法定量限為1 mg/kg。3省份桃膠樣品中，圣草酚、柚皮素、橙皮素濃度范圍分別是1.8～63.8、35.1～156.5、3.8～192.9 mg/kg，平均濃度分別是17.7、82.0、86.4 mg/kg。云南桃膠中橙皮素含量明顯低于其余2個省份，湖北桃膠中柚皮素含量比較低，而江蘇桃膠中圣草酚含量約是另外2個省份的2倍?？梢?，高效液相色譜法可用于測定桃膠中類黃酮物質(zhì)含量，不同省份桃膠類黃酮含量存在差異。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；桃膠；類黃酮；柚皮素；橙皮素；圣草酚

中圖分類號：R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）15-0203-05

收稿日期：2024-05-18

基金項目：云南省重大科技專項計劃（編號：202102AE090051-1-01）。

作者簡介：余檸未（2003—），男，江蘇南京人，主要從事園藝園林植物研究。E-mail：1941162677@qq.com。

通信作者：劉振環(huán)，碩士，正高級工程師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究。E-mail：29021781@qq.com。

桃膠是桃或山桃等薔薇科植物樹干受機(jī)械傷或致病后分泌出的半透明膠質(zhì)，采摘干燥后未經(jīng)其他加工處理的桃膠為原桃膠［1］。作為桃園的重要副產(chǎn)品，桃膠在我國長江流域及以南桃產(chǎn)區(qū)資源豐富，1棵成年桃樹年產(chǎn)桃膠300～1 200 g，每667 m2桃園年產(chǎn)桃膠25～55 kg［2］。桃膠味苦、性平、益氣、和血、止渴、活血消腫、通淋止痛［3-5］，可入藥，在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)臨床上用于治療石淋、血淋、痢疾、糖尿病病癥、燒傷創(chuàng)面［6-8］。此外，桃膠在醫(yī)藥、美術(shù)染料、印刷及食品加工領(lǐng)域都有所應(yīng)用［9］。工業(yè)上已將原桃膠作為黏合劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑等［10-12］。

近年來，桃膠活性成分分析一直是研究熱點［13-15］。研究發(fā)現(xiàn)，桃膠富含多糖類高分子物質(zhì)［16］，桃膠多糖具有美容養(yǎng)顏、醫(yī)療及保健等多方面的功效，相比燕窩價格低廉，桃膠常被稱為“土燕窩”［17-18］。前期研究基于液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法，發(fā)現(xiàn)桃膠中富含類黃酮組分，其中橙皮素、柚皮素、圣草酚含量最高［19］，且桃膠顏色越深，黃酮類物質(zhì)含量越高［20］。黃酮類化合物作為植物次級代謝物，是2個苯環(huán)通過3個碳原子相互連接而成的一系列化合物，具有抗氧化活性，適量攝入黃酮類化合物能減少人體心血管疾病、脂質(zhì)過氧化以及骨質(zhì)疏松等疾病的發(fā)病率［21-24］，還具有抗炎抑菌活性、抗腫瘤活性、調(diào)節(jié)腸道菌群活性、預(yù)防心血管疾病及預(yù)防老年癡呆等功效，已廣泛應(yīng)用于藥品及保健品等領(lǐng)域［25-27］。因此，類黃酮化合物作為桃膠中重要的功能活性成分有望用于指導(dǎo)桃膠采收、質(zhì)量評價和監(jiān)管。

常見植物源農(nóng)產(chǎn)品中類黃酮檢測方法包括光譜法（如紫外分光光度法、紅外光譜法、熒光光譜法）和色譜法（如高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法）等［26-30］。光譜法一般操作方便、成本低，但易受到其他物質(zhì)光譜干擾，因此適合類黃酮物質(zhì)含量的初步測定。色譜法是現(xiàn)代實驗室一種重要的分析手段，它以液體為流動相，通過色譜柱對待測樣品中目標(biāo)物進(jìn)行洗脫分離，進(jìn)一步基于紫外檢測器或是質(zhì)譜檢測器對目標(biāo)物質(zhì)含量進(jìn)行測定［31］。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相較于高效液相色譜法具有更高的靈敏度和選擇性，適用于殘量分析，但植物源農(nóng)產(chǎn)品中類黃酮含量較為豐富，提取后的含量常會超過質(zhì)譜儀器的線性范圍，而高效液相色譜法的檢測上限更加寬泛，更適合植物源農(nóng)產(chǎn)品中類黃酮檢測［32］。因此，本研究開發(fā)基于高效液相色譜法優(yōu)化桃膠中類黃酮物質(zhì)定量分析方法，測定并比較桃膠主產(chǎn)區(qū)云南、湖北、江蘇3省份樣品中類黃酮成分含量差異，以期為桃膠中類黃酮物質(zhì)的提取以及質(zhì)量監(jiān)測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

無水乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，德國默克公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；甲酸（分析純，天津福晨公司）；圣草酚（純度98%，上海源葉生物科技有限公司）；柚皮素（純度98%，上海源葉生物科技有限公司）；橙皮素（純度98%，上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

KDC-220HR高速冷凍離心機(jī)（中國安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；10DT超聲波恒溫清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Direct-Q5 UV超純水（美國Millipore公司）；Waters e2695-2998 PDA高效液相色譜儀（美國沃特世科技有限公司）；SunFire C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國沃特世科技有限公司）；AUW220D 型萬分之一電子天平（日本島津公司）； 0.22 μm有機(jī)濾膜（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg（精確至0.1 mg）柚皮素、橙皮素、圣草酚標(biāo)準(zhǔn)品于 100 mL 燒杯中，加入乙腈溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中并用乙腈定容，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 000 mg/L）。配制不同體積比的甲醇水溶液。

1.3.2 色譜條件 色譜柱為SunFire C18，流動相為乙腈-甲酸水（體積比40 ∶60），柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速為1.5 mL/min，紫外檢測器檢測波長為287 nm。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將各標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈用稀釋劑配制成質(zhì)量濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、50.0、100.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以目標(biāo)化合物的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 樣品處理 2020年7月份，采集江蘇、云南、湖北各省份桃膠樣品20份，后經(jīng)自然晾干，貯藏于4 ℃冰箱備用。研磨桃膠樣品至粉末狀后過60目篩，收集樣品。稱取一定桃膠樣品，于50 mL離心管中，加入10.0 mL不同體積比的甲醇水溶液或乙醇水溶液，通過超聲提取或渦旋的方式對桃膠樣品進(jìn)行提取，于6 500 r/min離心10 min，取上清液過濾膜，上機(jī)待測。每個處理5個平行。

1.3.5 加標(biāo)回收試驗 分別向桃膠樣品中添加6.0、20.0、200.0 mg/kg 3個濃度的柚皮素、橙皮素、圣草酚，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，每個濃度5個平行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

基于Waters液相配套的empower軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和積分，利用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，每次試驗重復(fù)5次，利用t檢驗（α=0.05）比較不同樣品中類黃酮物質(zhì)含量差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

因為3種類黃酮物質(zhì)在桃膠中含量較高，選擇高效液相色譜紫外檢測器來建立檢測方法。紫外檢測器選擇掃描波長范圍為220～400 nm，對圣草酚、柚皮素、橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液（10 mg/L）分別進(jìn)行光譜掃描，3個物質(zhì)均在287 nm處有最大吸收峰，因此選擇287 nm作為3種物質(zhì)的檢測波長。進(jìn)一步對流動相體系進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，采用乙腈-甲酸水（體積比60 ∶40）等度洗脫，流速為 1.5 mL/min 時，3個物質(zhì)出峰效果最好，并且與背景基質(zhì)峰無干擾（圖1）。

2.2 樣品前處理優(yōu)化

類黃酮物質(zhì)在結(jié)構(gòu)中都含有羥基，具有一定極性，根據(jù)相似相溶的原理可選擇甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等作為提取溶劑。乙醇、甲醇極性強(qiáng)，對類黃酮物質(zhì)有較好的溶解性，一般使用水、甲醇、乙醇或有機(jī)溶劑與水的復(fù)合體系提取。參照文獻(xiàn)［33］，并結(jié)合儀器色譜條件篩選出甲醇水與乙醇水溶液作為提取劑。測定不同配比的甲醇水與乙醇水對3種物質(zhì)提取效率的影響。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同體積比的甲醇水溶液對類黃酮物質(zhì)的測定有較大影響，有機(jī)相占比為70%～90%時提取效率高（圖2）。當(dāng)提取液中水的比例加大時，各類黃酮物質(zhì)提取效率顯著降低，可能是水相比例加大后導(dǎo)致桃膠中多糖物質(zhì)泡發(fā)，減少了類黃酮物質(zhì)的溶出。當(dāng)甲醇水（體積比80 ∶20）溶液提取桃膠中類黃酮物質(zhì)時，提取效率最高，因此，確定甲醇水（體積比80 ∶20）溶液為提取溶劑。

本研究選擇超聲和渦旋2種方式，進(jìn)一步探究不同提取方式對3種類黃酮物質(zhì)提取效率的影響。試驗結(jié)果表明，超聲方式好于渦旋。超聲時間為30、60、120 min的提取效率無顯著性差異（P>0.05），并優(yōu)于10 min的提取效率，為縮短試驗過程，選取30 min超聲作為提取方式（圖3）。

在確定提取劑和提取方式的條件下，測定不同稱樣量對提取效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在稱樣量為0.2～2.0 g時，圣草酚添加回收率為92%～104%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.5%～1.6%；柚皮素添加回收率為56%～91%，RSD為1.8%～10.9%；橙皮素添加回收率為 50%～82%，RSD為1.6%～9.5%（圖4）。稱樣量0.5 g時，3種物質(zhì)的提取效率最高，而稱樣量為 1.5 g 和2.0 g時，提取效率不好。因此，確定稱樣量為0.5 g。

通過以上優(yōu)化提取試驗，最終確定液相色譜方法中樣品前處理條件：準(zhǔn)確稱取桃膠樣品0.5 g于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇水（體積比 80 ∶20），充分振搖混勻，超聲提取30 min后，于 6 500 r/min 離心10 min 上清液過0.22 μm濾膜，待液相色譜分析。

2.3 方法評價

配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用液相色譜儀進(jìn)行檢測。以標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.5～100.0 mg/L 范圍內(nèi)，3個物質(zhì)的r2>0.999。連續(xù)6次測定3種物質(zhì)混合溶液（10.0 mg/L），儀器響應(yīng)值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%，顯示建立方法的隨機(jī)誤差小，具有較好的精密度。

鑒于方法優(yōu)化過程中桃膠中3種類黃酮含量范圍為10.0～100.0 mg/kg，因此向桃膠樣品中添加6.0、20.0、200.0 mg/kg 3個濃度，通過優(yōu)化后的檢測方法對3種類黃酮物質(zhì)進(jìn)行檢測。圣草酚、柚皮素、橙皮素的回收率范圍分別為92.3%～101.6%、96.7%～105.2%、97.8%～103.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.3%～7.2%之間（圖5），由此可以說明，所建立的桃膠中類黃酮化合物的液相色譜測定方法能滿足分析檢測的要求。取儲備液逐級稀釋，以信噪比S/N=3計算3種類黃酮的檢出限（limit of detection，LOD），以信噪比S/N=10計算其定量限（limit of quantification，LOQ） 最終確定本方法的LOD為0.4 mg/kg，LOQ為1.0 mg/kg。

2.4 不同產(chǎn)地桃膠中各類黃酮含量差異

利用已建立的檢測方法對云南、湖北、江蘇3省份桃膠樣品進(jìn)行檢測，試驗結(jié)果表明，圣草酚、柚皮素、橙皮素濃度范圍分別是1.8～63.8、35.1～156.5、3.8～192.9 mg/kg，平均濃度分別是17.7、82.0、86.4 mg/kg（圖6），橙皮素的平均濃度最高，其次是柚皮素和圣草酚?；诮y(tǒng)計分析，本研究發(fā)現(xiàn)不同省份桃膠成分中類黃酮含量存在一定差異，其中江蘇省桃膠中圣草酚含量明顯高于湖北及云南地區(qū)（P<0.05），約多1倍。湖北省桃膠中柚皮素含量明顯低于其他2個省份，而云南省桃膠中橙皮素中含量明顯低于其余2個省份（P<0.05）。江蘇地區(qū)桃膠樣品中3種類黃酮含量加和（224.9 mg/kg）高于湖北（179.0 mg/kg）及云南（183.7 mg/kg）的。以上結(jié)果表明，不同省份桃膠中類黃酮含量存在明顯差異。桃樹流膠實際是桃樹自我保護(hù)的一種手段，當(dāng)桃樹受到機(jī)械損傷或病菌侵染時會產(chǎn)生活性氧自由基，桃膠中類黃酮可以消除這些活性氧自由基，類黃酮含量也可以反映桃樹的生理狀態(tài)。不同產(chǎn)地桃膠中類黃酮差異可能與桃樹品種、流膠方式、產(chǎn)地環(huán)境（溫濕度、降水量）有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

本研究采用高效液相色譜法對桃膠中柚皮素、橙皮素、圣草酚3種類黃酮物質(zhì)進(jìn)行定量分析，考察了不同提取劑、提取方式、稱樣量對提取效率的影響。試驗結(jié)果表明，0.5 g桃膠經(jīng)10 mL 80%甲醇水超聲提取30 min條件下3種類黃酮物質(zhì)的得率最高。柚皮素、橙皮素、圣草酚在0.5～100.0 mg/L范圍內(nèi)線性良好，r2大于0.999，圣草酚、柚皮素、橙皮素的加標(biāo)回收率分別為92.3%～101.6%、96.7%～105.2%、97.8%～103.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.3%～7.2%之間，方法LOD為 0.4 mg/kg，LOQ為 1.0 mg/kg。利用建立的分析方法測定云南、湖北、江蘇3省份桃膠樣品，圣草酚、柚皮素、橙皮素濃度范圍分別是1.8～63.8、35.1～156.5、3.8～192.9 mg/kg，平均濃度分別是17.7、82.0、86.4 mg/kg。但不同省份桃膠中各類黃酮組分含量存在一定差異，其中云南桃膠中橙皮素含量明顯低于其余2個省份，湖北桃膠中柚皮素含量比較低，而江蘇桃膠中圣草酚含量約是另外2個產(chǎn)地的2倍。研究結(jié)果將為桃膠中黃酮類物質(zhì)的提取以及質(zhì)量監(jiān)測提供技術(shù)支撐。

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