摘要：為探究不同土壤類(lèi)型對(duì)煙草黑脛病發(fā)生的響應(yīng)差異，明確與黑脛病發(fā)病程度相關(guān)的因素，通過(guò)田間調(diào)查，收集黃壤土、水稻土煙草黑脛病不發(fā)病、中度發(fā)病和重度發(fā)病煙株根際土壤，測(cè)定土壤化學(xué)指標(biāo)，并采用高通量測(cè)序技術(shù)分析不同發(fā)病程度下煙株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，黃壤土中隨黑脛病發(fā)病程度增加SOM和NO-3-N含量逐漸增加，AP含量中度發(fā)病最高。而在水稻土中，土壤NO-3-N和AP含量升高，SOM和AN含量呈先減后增的變化趨勢(shì)。黃壤土中Chao1、ACE指數(shù)隨發(fā)病程度增加呈增加趨勢(shì)且顯著高于不發(fā)病和中度發(fā)病土壤，水稻土中細(xì)菌Shannon和Simpson指數(shù)隨發(fā)病程度增加呈下降趨勢(shì)。芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬和苔蘚桿菌屬在中度發(fā)病土壤中富集。2種土壤類(lèi)型下有機(jī)質(zhì)含量和硝態(tài)氮含量對(duì)土壤細(xì)菌群落變化的貢獻(xiàn)率較大，是影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的重要非生物因素。綜上所述，不同土壤類(lèi)型細(xì)菌群落α多樣性變化不一致，芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、苔蘚桿菌屬相對(duì)豐度隨病害加重而增加；有機(jī)質(zhì)和硝態(tài)氮含量是影響黑脛病發(fā)生和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)改變的重要非生物因素。

關(guān)鍵詞：煙草；黑脛??；發(fā)病程度；細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；化學(xué)性狀

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）15-0255-07

收稿日期：2023-09-06

基金項(xiàng)目：貴州省煙草公司重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（編號(hào)：2021XM15）。

作者簡(jiǎn)介：高正鋒（1997—），男，云南祥云人，碩士研究生，研究方向?yàn)闊煵莶『?。E-mail：766799325@qq.com。

通信作者：呂 芬，碩士，副教授，主要從事煙草栽培及病害方面的研究。E-mail：lvfen18@163.com。

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，近年來(lái)由于集約化程度的提高，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)復(fù)種指數(shù)增加，造成植煙土壤養(yǎng)分失衡、土傳病害頻發(fā)［1］，嚴(yán)重制約著我國(guó)煙草產(chǎn)量及品質(zhì)的提升［2-3］。煙草黑脛病的病原菌在土壤中有著較強(qiáng)的生命力，在沒(méi)有寄主植物存在的情況下也能存活數(shù)年，且較難清除，因而成為對(duì)煙草危害較為嚴(yán)重的土傳病害之一［4］。目前，對(duì)于煙草黑脛病的防治主要有培育抗性品種、農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治等，但抗性品種受到煙草工業(yè)原料需求和地域差異的影響，推廣難度大，只依靠農(nóng)業(yè)防治措施的效果也十分有限，長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑防治極易影響土壤微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定，導(dǎo)致病原菌抗藥性增加，因此尋找本土的關(guān)鍵致病因子，從當(dāng)?shù)刂矡熗寥辣旧磉M(jìn)行改良和調(diào)控是煙草土傳病害防控的重要措施之一。

土傳病害的發(fā)生與土壤微生態(tài)環(huán)境的變化密不可分［5-7］。有研究表明，煙草黑脛病的發(fā)生與土壤理化性質(zhì)間有一定聯(lián)系［8］，其中pH值對(duì)黑脛病的發(fā)生影響較為顯著，當(dāng)植煙土壤pH值為酸性時(shí)黑脛病發(fā)病率較高［9］，還有研究指出健康土壤中的有機(jī)質(zhì)、堿解氮和有效磷含量低于患病土壤［10］。微生物參與了土壤生態(tài)系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)和植物發(fā)育獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的諸多關(guān)鍵過(guò)程，包括土壤質(zhì)量維持和毒素降解，營(yíng)養(yǎng)循環(huán)、有機(jī)質(zhì)周轉(zhuǎn)等，是植株健康成長(zhǎng)和保證土壤持續(xù)利用的重要組成部分之一，有研究指出土壤微生物的群落組成、結(jié)構(gòu)、多樣性及生態(tài)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系都與植物土傳病害的發(fā)生有關(guān)［11-13］。史普酉等發(fā)現(xiàn)，黑脛病不同發(fā)病程度煙株細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生趨向性改變，土壤微生物的多樣性降低［14］。前人通過(guò)研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是否會(huì)影響煙草青枯病的發(fā)生得出，相對(duì)復(fù)雜的土壤微生態(tài)系統(tǒng)可能有助于抑制病原菌的入侵［15］。感染煙草青枯病的根際土壤微生物與未染病的根際土壤微生物相比，其健康土壤微生物多樣性較低［16］。向立剛等研究發(fā)現(xiàn)，健康煙株根際土壤中細(xì)菌群落的α多樣性高于感青枯病和黑脛病煙株的根際土壤［17］。盡管如此，以往的研究更多偏向于發(fā)病土壤與健康土壤之間的比較［18-19］，對(duì)于不同類(lèi)型植煙土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的研究相對(duì)較少，這對(duì)于解釋在不同環(huán)境中煙草黑脛病菌對(duì)植煙土壤微生物的影響關(guān)系具有重要意義?；诖?，本研究在貴州安順煙區(qū)挑選了煙草黑脛病持續(xù)發(fā)生的地塊進(jìn)行試驗(yàn)，從而比較在2種類(lèi)型植煙土壤環(huán)境中，不同發(fā)病程度黑脛病煙株根際土壤的化學(xué)性狀和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間的差異，以期為豐富煙株感病機(jī)制和煙草黑脛病的防治提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)點(diǎn)概況

試驗(yàn)于2022年3—9月在貴州省楊武鎮(zhèn)（106°11′9.99″E，26°01′5.61″N，海拔1 162.54 m）和紫云縣干龍壩（106°10′58＂E，25°54′08″N，海拔為 1 183.8 m）進(jìn)行。種植品種均為云煙87，移栽方式為井窖式移栽。試驗(yàn)地基礎(chǔ)土壤理化性狀如表1所示。

1.2 土壤樣品采集

按照GB/T 23222—2008《煙草病蟲(chóng)害分級(jí)及調(diào)查方法》中煙草病蟲(chóng)害分級(jí)與調(diào)查的方法，對(duì)2種土壤類(lèi)型（黃壤土記為C，水稻土記為F）下的煙株進(jìn)行黑脛病等級(jí)劃分，并基于病情指數(shù)將煙株劃分為不同發(fā)病程度煙株（正常煙株：整株無(wú)病，編號(hào)為0；中度發(fā)?。簾熤昵o部莖圍 1/2 以上有病斑或煙株葉片中1/2～2/3凋萎，編號(hào)為1；重度發(fā)病：煙株莖部莖圍全部被病斑環(huán)繞，煙株葉片中2/3以上凋萎，編號(hào)為2）。待煙株病級(jí)確定后將其全部挖出，去除根部所有雜物后，將距離根部 2 mm 范圍內(nèi)的土壤抖落并收集，發(fā)病程度相同的煙株土壤不少于3株，待充分混勻后一部分儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱用于微生物群落測(cè)定，剩余土壤通過(guò)自然風(fēng)干后用于測(cè)定理化性狀［20］。

1.3 土壤理化性狀的測(cè)定

土壤懸浮液中的pH值采用電位法測(cè)定。參照鮑士旦的方法［21］測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷和速效鉀含量。硝態(tài)氮含量采用紫外分光光度法測(cè)定；銨態(tài)氮含量采用可見(jiàn)分光光度法測(cè)定。

1.4 土壤細(xì)菌的測(cè)定

土壤細(xì)菌：用HiPure Soil DNA Kits提取土壤中的DNA；利用341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′）對(duì)16S rDNA基因高變區(qū)V3～V4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的高通量測(cè)序在Illumina Hiseq平臺(tái)進(jìn)行，通過(guò)NanoDrop微量分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和完整性，將純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR驗(yàn)證文庫(kù)合格后，使用NovaSeq 6 000對(duì)DNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)Qiime V1.9.1去除平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)低（Q<20）和長(zhǎng)度短（<100 bp）的低質(zhì)量序列，使用Usearch軟件進(jìn)行聚類(lèi)，獲得OTU的豐度和OTU代表序列。基于OTU的序列、豐度數(shù)據(jù)，開(kāi)展物種注釋、物種組成分析、α多樣性分析、β多樣性分析、相關(guān)性分析等。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

利用Excel 2010和SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用LSD法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（α=0.05），利用R語(yǔ)言進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑脛病對(duì)不同類(lèi)型土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

黑脛病不同發(fā)病程度下土壤的化學(xué)性質(zhì)存在差異（表2）。黃壤土中隨發(fā)病程度變化pH值、堿解氮、速效鉀和銨態(tài)氮含量無(wú)顯著差異，有機(jī)質(zhì)和硝態(tài)氮含量逐漸增加且處理間差異顯著（P<0.05），有效磷含量中度發(fā)?。–1處理）最高，為771.16 mg/kg。水稻土中，隨發(fā)病程度變化pH值和銨態(tài)氮含量無(wú)顯著差異，有機(jī)質(zhì)含量先減少后增加，且各處理間達(dá)到顯著差異。堿解氮含量重度發(fā)病（F2處理）顯著高于其他處理，整體呈先減少后增加的變化趨勢(shì)。速效鉀和硝態(tài)氮含量呈增加趨勢(shì)，均為重度發(fā)?。‵2處理）最高，和正常煙株根際土壤（F0處理）達(dá)到顯著差異。

2.2 黑脛病對(duì)不同類(lèi)型土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化的影響

2.2.1 細(xì)菌α多樣性變化

由圖1可知，黃壤土的Chao1、ACE指數(shù)隨發(fā)病程度增加呈增加趨勢(shì)，且重度發(fā)病土壤顯著高于不發(fā)病和中度發(fā)病土壤，而細(xì)菌群落多樣性（Shannon、Simpson）指數(shù)在各發(fā)病程度間差異不顯著。水稻土中隨黑脛病發(fā)病程度加重豐富度（Chao1和ACE）指數(shù)變化不顯著，多樣性指數(shù)則逐漸下降，且Shannon指數(shù)重度發(fā)病土壤顯著低于不發(fā)病土壤，Simpson指數(shù)無(wú)顯著差異。

2.2.2 細(xì)菌β多樣性變化

主坐標(biāo)分析（PCoA，基于Bray-curtis距離）下的結(jié)果均有顯著差異（P<0.05）。由圖2可知，第1坐標(biāo)軸和第2坐標(biāo)軸共能解釋85.99%，黃壤土細(xì)菌群落主要分布在二、三象限，而水稻土細(xì)菌群落則主要分布在一、四象限。其次，隨發(fā)病程度增加，黃壤土和水稻土中沿PCo2軸重度發(fā)病土壤細(xì)菌群落與不發(fā)病土壤和土壤細(xì)菌群落顯著分開(kāi)，而中度發(fā)病土壤細(xì)菌群落和不發(fā)病土壤細(xì)菌群落未顯著分開(kāi)。以上結(jié)果表明，黃壤土和水稻土間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異，其次，重度發(fā)病煙株根際土壤細(xì)菌群落顯著區(qū)別于不發(fā)病和中度發(fā)病煙株根際土壤細(xì)菌群落。

2.2.3 細(xì)菌門(mén)、屬水平群落豐度變化

選取2種土壤細(xì)菌群落中豐度TOP10的門(mén)水平物種進(jìn)行比較分析，如圖3-A所示，在黃壤土中，隨發(fā)病程度增加，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）相對(duì)豐度降低，變形菌門(mén)（Proteobacteria）相對(duì)豐度增加，不發(fā)病土壤中放線菌門(mén)（Actinobacteria）和髕骨細(xì)菌門(mén)（Patescibacteria）豐度高于發(fā)病土壤。在水稻土中，隨發(fā)病程度增加厚壁菌門(mén)豐度逐漸升高，變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）相對(duì)豐度逐漸降低。

對(duì)細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度TOP10的物種進(jìn)行分析，如圖3-B所示，黃壤土和水稻土中共有的6個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）、Clostridium_sensu_stricto_10（未命名，屬于厚壁菌門(mén)）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、Clostridium_sensu_stricto_12（未命名 屬于厚壁菌門(mén)）、 芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、Clostridium_sensu_stricto_1（未命名，屬于厚壁菌門(mén)）。在黃壤土中，隨發(fā)病程度增加，芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬豐度升高。在水稻土中，隨發(fā)病程度增加，芽孢桿菌屬豐度升高，鞘氨醇單胞菌屬、苔蘚桿菌屬（Bryobacter）和芽單胞菌屬相對(duì)豐度先增后減。

2.2.4 土壤環(huán)境因子與微生物間的冗余分析和方差分解分析

土壤化學(xué)性狀指標(biāo)結(jié)合細(xì)菌OTU數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行冗余分析（RDA）和方差分解分析（variance partitioning analysis，簡(jiǎn)稱(chēng)VPA），結(jié)果見(jiàn)圖4。在黃壤土中（圖4-A-1），對(duì)細(xì)菌群落影響較大的土壤化學(xué)性狀指標(biāo)為有機(jī)質(zhì)含量、堿解氮含量和硝態(tài)氮含量，且方差分解分析（圖 4-A-2）表明，有機(jī)質(zhì)含量和硝態(tài)氮含量對(duì)土壤細(xì)菌群落變化的貢獻(xiàn)率較大，分別為1.73%和1.68%，從而說(shuō)明有機(jī)質(zhì)和硝態(tài)氮含量可能是影響黃壤土中土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)改變的重要非生物因素。在水稻土中（圖4-B-1）有機(jī)質(zhì)、堿解氮、硝態(tài)氮和速效鉀含量對(duì)細(xì)菌群落影響較大，VPA結(jié)果表明有機(jī)質(zhì)和硝態(tài)氮含量對(duì)土壤細(xì)菌群落發(fā)生變化的貢獻(xiàn)率較大，為影響水稻土中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)改變的主要非生物因素。

3 討論

土傳病害的發(fā)生往往導(dǎo)致土壤養(yǎng)分的不平衡，而土壤養(yǎng)分平衡是作物健康生長(zhǎng)的關(guān)鍵［22］。煙草黑脛病為典型的土傳病害，其發(fā)生與傳播主要受土壤溫度、濕度、酸堿度及土壤養(yǎng)分等環(huán)境因素的影響［23-25］。本研究結(jié)果表明，黃壤土中隨黑脛病發(fā)病程度增加，SOM和NO-3-N含量逐漸增加，AK含量中度發(fā)病最高。而在水稻土中，AP和NO-3-N含量總體呈增加趨勢(shì)，SOM及AN含量總體呈先減后增變化，這與方宇等的研究結(jié)果［10］基本一致。造成土壤速效養(yǎng)分含量積累的可能原因是，發(fā)病植株內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致植株?duì)I養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸受阻，對(duì)土壤養(yǎng)分吸收效率降低，造成土壤養(yǎng)分累積［26-27］。有研究表明，有機(jī)質(zhì)含量偏高可能會(huì)導(dǎo)致煙草青枯病更加嚴(yán)重［28-29］，本研究結(jié)果與之類(lèi)似。土壤中較高的硝態(tài)氮含量可以抑制土傳真菌病害的發(fā)生［30］，同時(shí)也有研究表明，硝態(tài)氮可以降低香蕉枯萎病和白菜斑點(diǎn)病的發(fā)生［31-32］，而在本研究中，2種類(lèi)型土壤中硝態(tài)氮含量均隨發(fā)病程度的加重呈增加的趨勢(shì)，可能原因是該環(huán)境下病原菌更易獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖對(duì)抗具有拮抗作用的根際微生物，加劇了煙株的病害程度，也可能是植株和土壤間相互作用，通過(guò)硝態(tài)氮累積來(lái)抵御病害發(fā)生，具體機(jī)制還需進(jìn)一步試驗(yàn)證明。此外，冗余分析和方差分解分析結(jié)果表明，在2種土壤類(lèi)型下有機(jī)質(zhì)和硝態(tài)氮含量對(duì)土壤細(xì)菌群落變化的貢獻(xiàn)率較大，可能是土壤中影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的主要因子。

越豐富的土壤微生物結(jié)構(gòu)，物種的均勻度越高，其擁有的生態(tài)系統(tǒng)也較為穩(wěn)定和平衡，有利于提高作物對(duì)病害的抵御［33-34］，而病原微生物的大量生長(zhǎng)和繁殖打破了種群平衡機(jī)制，導(dǎo)致作物病害的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，黃壤土中Chao1、ACE指數(shù)隨發(fā)病程度增加呈增加趨勢(shì)且重度發(fā)病土壤顯著高于不發(fā)病和中度發(fā)病土壤?？赡茉蚴遣『Πl(fā)生后，煙株的正常代謝受到干擾，煙株會(huì)通過(guò)內(nèi)生細(xì)菌或根系分泌物的改變來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)，故煙株根際土壤微生物的種類(lèi)會(huì)隨之發(fā)生改變［35］，也可能是增加了有害菌群數(shù)量和豐度，從而不利于抵抗病害的發(fā)生。水稻土中隨發(fā)病程度增加Shannon和Simpson指數(shù)呈下降趨勢(shì)，這與前人的研究結(jié)果［36］相同。此外，PCoA結(jié)果表明，2種類(lèi)型土壤間細(xì)菌群落存在差異，在相同土壤類(lèi)型下重度發(fā)病煙株根際土壤細(xì)菌群落顯著區(qū)別于不發(fā)病和中度發(fā)病煙株根際土壤細(xì)菌群落。以上結(jié)果表明，煙株發(fā)病會(huì)導(dǎo)致根際土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性發(fā)生改變，且不同土壤類(lèi)型細(xì)菌群落α多樣性變化不一致，煙株發(fā)病會(huì)顯著影響細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。2種土壤類(lèi)型的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成基本相似，但相對(duì)豐度存在差異，這與前人的研究結(jié)果一致，齊虹凌等的研究表明，不同土壤類(lèi)型下真菌、細(xì)菌、放線菌以及古菌等微生物的生長(zhǎng)發(fā)育和數(shù)量會(huì)受到影響［37-38］。本研究結(jié)果表明，在黃壤土中，隨黑脛病發(fā)病程度增加厚壁菌門(mén)豐度降低，變形桿菌門(mén)豐度增加，而在水稻土中，隨發(fā)病程度增加厚壁菌門(mén)豐度逐漸升高，變形桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和綠彎菌門(mén)豐度逐漸降低。前人研究表明，土壤細(xì)菌的變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)在土壤養(yǎng)分充足時(shí)表現(xiàn)出較快的生長(zhǎng)速度和更高的相對(duì)豐度［39-40］。在2種土壤類(lèi)型下有益菌屬芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、苔蘚桿菌屬［41-43］在中度發(fā)病土壤中富集，可能與煙草植株在受到病菌侵染后，為了抵抗這種侵染，在根際募集了大量能夠誘導(dǎo)抗病和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的微生物有關(guān)［44-45］，這與黎妍妍等對(duì)青枯病不同發(fā)病階段根際微生物群落變化的研究結(jié)果［41］類(lèi)似。而水稻土黑脛病重度發(fā)病土壤中，鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、苔蘚桿菌屬相對(duì)豐度有下降趨勢(shì)，可能是土壤類(lèi)型及煙株瀕死導(dǎo)致，具體原因還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

煙草黑脛病的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致根際土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性發(fā)生改變，且不同土壤類(lèi)型的細(xì)菌群落α多樣性變化不一致。與不發(fā)病土壤相比，芽胞桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、苔蘚桿菌屬等有益菌屬相對(duì)豐度在中度發(fā)病土壤中增加。2種土壤類(lèi)型下有機(jī)質(zhì)（SOM）和硝態(tài)氮（NO-3-N）含量是影響黑脛病發(fā)生和土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)改變的主要非生物因素。

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