摘要：為篩選出具有抑菌性，且對抗菌藥物和水體消毒劑具有耐受性的優(yōu)良益生菌，通過牛津杯法測定了24株水源芽孢桿菌對常見6株水產(chǎn)病原菌［溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus） VA1株和VA2株，副溶血弧菌（V. parahaemolyticus，VP）、哈維氏弧菌（V. harveyi，VH）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，AH）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）］的抑菌活性；運用K-B紙片法探究了24株芽孢桿菌對6種常用水產(chǎn)抗菌藥物（多西環(huán)素、氟苯尼考、新霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和復(fù)方新諾明）的敏感性；并采用稀釋涂布法測試了24株芽孢桿菌對8種常用水產(chǎn)消毒劑（聚維酮碘溶液、戊二醛苯扎溴銨溶液、復(fù)合碘溶液、苯扎溴銨溶液、濃戊二醛溶液、過硫酸氫鉀、漂白粉和高錳酸鉀）的耐受性。結(jié)果表明：體外抑菌試驗中，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis） BV1、BV2、BV3對6種致病菌均表現(xiàn)出顯著的抑制作用；藥敏試驗中，10株芽孢桿菌（BV1、BT1、BS2、BS4、BS6、BS9、BS10、BH3、BC1和BA1）均對新霉素耐藥；消毒劑耐受性試驗中，大多數(shù)的菌株對特效改底王、漂白粉以及高錳酸鉀的常規(guī)消毒劑量顯示出耐受性，但是聚維酮碘、戊二醛苯扎溴銨、復(fù)合碘、苯扎溴銨以及濃戊二醛的常規(guī)消毒劑量對菌株都有一定的抑制效果。綜合以上試驗結(jié)果，選取BV1作為5種具有抑制效果的消毒產(chǎn)品的定量試驗菌株，結(jié)果顯示，高濃度的消毒劑會嚴重影響芽孢桿菌的活性，對于貝萊斯芽孢桿菌BV1來說，聚維酮碘、戊二醛和苯扎溴銨和濃戊二醛的消毒濃度不超過 2 mg/L；復(fù)合碘和苯扎溴銨的消毒濃度不超過1 mg/L。水產(chǎn)源的貝萊斯芽孢桿菌BV1有較強的抗病原菌能力，對抗菌藥物有一定耐藥性，對常見的消毒產(chǎn)品抗性較好，可以作為潛在益生菌株用于后續(xù)水產(chǎn)益生菌制劑的開發(fā)利用。此外，常用消毒劑用于水體潑灑的劑量最好不要超過建議使用劑量，以防影響益生菌的活性。

關(guān)鍵詞：水產(chǎn)動物；芽孢桿菌；病原菌；抗菌藥物；消毒產(chǎn)品；抗性

中圖分類號：S917.1；S182 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）15-0187-08

收稿日期：2023-08-23

基金項目：江蘇省政策引導(dǎo)類計劃（蘇北科技專項）（編號：SZ-LYG202133）；江蘇省高等學(xué)?；A(chǔ)科學(xué)（自然科學(xué)）研究面上項目（編號：22KJB240001）；江蘇省生物技術(shù)重點實驗室開放基金（編號：HS2020003）；江蘇省優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)項目。

作者簡介：孫云貴（1998—），男，山西晉中人，碩士研究生，從事水產(chǎn)動物病害與免疫研究。E-mail：Sunyungui@outlook.com。

通信作者：高迎莉，博士，講師，從事水產(chǎn)動物病害與免疫研究。E-mail：yingli.gao@jou.edu.cn。

我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在過去幾十年里取得了驚人的發(fā)展。1978—2021年間，中國的人工養(yǎng)殖水產(chǎn)品總產(chǎn)量從332.3萬t增長至5 394.1萬t，增長幅度巨大；2021年的養(yǎng)殖水產(chǎn)品總產(chǎn)量更是占據(jù)了全球水產(chǎn)品養(yǎng)殖總產(chǎn)量的60%以上，對全球水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)作出了巨大貢獻［1-2］。然而，隨著產(chǎn)量的增加，疾病防控和環(huán)保等方面也面臨著諸多挑戰(zhàn)。

目前，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖主要通過抗生素來預(yù)防和治療水產(chǎn)疾病。但抗生素的大量使用，會導(dǎo)致抗生素耐藥菌株的產(chǎn)生，這些抗生素耐藥菌還可能將耐藥質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移給有益菌和其他細菌，使其攜帶抗生素耐藥質(zhì)粒，致使抗生素抑菌和殺菌效果越來越弱的同時，還會對人類健康和環(huán)境安全產(chǎn)生不利的影響［3］。近年來，為了防止抗生素的濫用，我國對水產(chǎn)抗生素的使用要求變得愈發(fā)嚴格。2022年3月，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于做好2023年水產(chǎn)綠色健康養(yǎng)殖技術(shù)推廣“五大行動”工作的通知》中提到“骨干基地要實現(xiàn)用藥量、特別是抗生素使用量同比持續(xù)降低”。翌年6月，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部又發(fā)布《夏季水產(chǎn)技術(shù)指引》，規(guī)定“不得向池塘潑灑抗生素，不得低劑量內(nèi)服抗生素預(yù)防疾病，不得使用違禁藥物；嚴格遵循《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2022年1號、2號》中規(guī)定水產(chǎn)養(yǎng)殖藥物?！币虼耍瑸榱僳`行發(fā)展環(huán)境友好型水產(chǎn)養(yǎng)殖，尋找高效且綠色的抗生素替代品迫在眉睫。

益生菌作為水產(chǎn)病害防控管理中抗生素替代的策略之一，在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用中備受關(guān)注［4］。20世紀80年代，芽孢桿菌（Bacillus toyoi）始用于日本鰻鱺（Anguilla japonica）的養(yǎng)殖中，降低病原菌引起的死亡，開啟了益生菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的新局面［5］。益生菌能抑制病原菌、促進宿主生長，其環(huán)境友好、安全有效等優(yōu)點在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中已引起廣泛關(guān)注。然而，益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的實際使用狀況、存在的問題（如同時使用抗生素及化學(xué)消毒劑等）、面臨的挑戰(zhàn)以及今后的發(fā)展方向仍需要深入探究［6］。在生產(chǎn)中，養(yǎng)殖戶使用益生菌的方法主要依賴于經(jīng)銷商提供的指導(dǎo)或自身在養(yǎng)殖中積累的經(jīng)驗。有些養(yǎng)殖戶基于節(jié)約成本，減量使用益生菌，或擔心效力不足，同時使用抗生素及化學(xué)消毒劑，致使益生菌的施用效果不佳［7］。因此，測定益生菌對常用的養(yǎng)殖水體消毒劑以及已批準使用的用于病害防治的水產(chǎn)養(yǎng)殖獸藥（如多西環(huán)素、氟苯尼考、新霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和復(fù)方新諾明等）的耐受性，是選用益生菌菌株、水體消毒劑及抗菌藥物的重要參考。

本試驗選取前期從養(yǎng)殖蝦塘中分離的芽孢桿菌菌株，以期篩選出具有較強抑菌性、對抗菌藥物和水體消毒劑耐受較好的優(yōu)良益生菌，為養(yǎng)殖過程中的益生菌的選擇和使用，以及開發(fā)水產(chǎn)動物益生菌制劑提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 芽孢桿菌菌株 2021年5—8月，筆者所在實驗室從江蘇連云港養(yǎng)殖蝦塘的蝦體、底泥和水體中分離并鑒定24株芽孢桿菌（表1）。

1.1.2 病原菌菌株 實驗室保存的6株水產(chǎn)常見致病菌，見表2。

1.1.3 藥敏紙片 藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司，其含量以及藥物敏感性判斷標準見表3。根據(jù)《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2020年2號》名單，氟苯尼考粉（水產(chǎn)用）、恩諾沙星粉（水產(chǎn)用）、鹽酸多西環(huán)素粉（水產(chǎn)用）、硫酸新霉素粉（水產(chǎn)用）以及維生素C磷酸酯鎂鹽酸環(huán)丙沙星預(yù)混劑是已批準的水產(chǎn)養(yǎng)殖用的抗菌藥物。

1.1.4 消毒劑 本試驗所用水產(chǎn)養(yǎng)殖常用消毒劑分別是聚維酮碘溶液、戊二醛苯扎溴銨溶液、復(fù)合碘溶液、苯扎溴銨溶液、濃戊二醛溶液、過硫酸氫鉀、漂白粉和高錳酸鉀，詳見表4。根據(jù)《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2020年2號》名單，戊二醛苯扎溴銨溶液（水產(chǎn)用）、濃戊二醛溶液（水產(chǎn)用）、含氯石灰（水產(chǎn)用）、苯扎溴銨溶液（水產(chǎn)用）、復(fù)合碘溶液（水產(chǎn)用）、聚維酮碘溶液（水產(chǎn)用）、過硫酸氫鉀復(fù)合物粉是已批準的水產(chǎn)養(yǎng)殖用的消毒劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 體外抑菌試驗 采用牛津杯法［7］鑒定24株芽孢桿菌對水產(chǎn)常見致病菌的抑制效果，病原菌100 μL菌懸液（106 CFU/mL）涂布于TSB平板，牛津杯孔中加入40 μL的待測芽孢桿菌菌液，重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑（mm），觀察抑菌效果。

1.2.2 抗菌藥物耐受性試驗 采用紙片擴散法（K-B 法）［8］確定芽孢桿菌對藥物的敏感性，根據(jù)藥敏紙片抑菌直徑范圍進行藥物敏感性判定。待測芽孢桿菌活化后，制備108 CFU/mL菌懸液，吸取100 μL菌液涂布于平板上，每個平板貼附4個藥敏紙片，重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。

1.2.3 消毒劑耐受性試驗 通過不同消毒劑對芽孢桿菌的抑菌作用，判斷芽孢桿菌對消毒劑的耐受性。芽孢桿菌活化后，分別制備106 CFU/mL菌懸液，在TSB平板上均勻涂布；在牛津杯孔中加入 40 μL 消毒劑（聚維酮碘溶液20 mg/L、戊二醛苯扎溴銨溶液20 mg/L、復(fù)合碘溶液20 mg/L、苯扎溴銨溶液20 mg/L、濃戊二醛溶液20 mg/L、過硫酸氫鉀20 mg/L、漂白粉20 mg/L、高錳酸鉀20 mg/L），28 ℃ 培養(yǎng)12～18 h，觀察芽孢桿菌對消毒劑的耐受性，重復(fù)3次。試驗結(jié)果判定標準：抑菌圈直徑在 8 mm 以下無抑菌作用，在8～10 mm之間為低敏感，＞10～15 mm為中度敏感，在15 mm以上為高敏感度。

進一步探究不同濃度的敏感的消毒劑對芽孢桿菌存活的影響。芽孢桿菌活化后，制備106 CFU/mL菌懸液，不同消毒劑濃度設(shè)為0 （對照組，未添加消毒劑）、1、2、4、8、16 mg/L，分別添加到制備好的菌懸液中，重復(fù)3次。28 ℃ 60 r/min振蕩培養(yǎng)；并分別在0、1、2、4、6、8、12、24 h取100 μL培養(yǎng)液于TSB平板涂布，每個時間點重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)24 h，計數(shù)單菌落數(shù)量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 所得數(shù)據(jù)用Excel、SPSS 19.0進行圖表繪制及分析，所得數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌試驗結(jié)果

在體外抑菌試驗中，不同芽孢桿菌對不同病原菌的抑制效果不同（圖1）。貝萊斯芽孢桿菌BV1、BV2和BV3對6種水產(chǎn)常見致病菌均具有明顯的抑制作用（圖2）；東洋芽孢桿菌BT1對6株常見的病原菌無抑制效果，僅對銅綠假單胞菌具有不明顯的抑制效果；不同的枯草芽孢桿菌對病原菌的抑制效果不一樣，其中BS3株的抑菌效果較好，可以抑制溶藻弧菌、哈維氏弧菌和嗜水氣單胞菌的生長，而BS6株無法抑制6株病原菌的生長；4株地衣芽孢桿菌BL1～BL4、2株海內(nèi)氏芽孢桿菌BH1和BH2以及?？谘挎邨U菌BH3均對6株病原菌無抑制效果；蠟樣芽孢桿菌BC1僅對1株溶藻弧菌和哈維氏弧菌具有不明顯的抑制效果；2株海水芽孢桿菌BA1和BA2的抑菌效果不如枯草芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌。

2.2 抗菌藥物耐受性試驗結(jié)果

由圖3可知，24株芽孢桿菌對多西環(huán)素與氟苯尼考均具有高度或中度敏感性；新霉素藥敏結(jié)果顯示，有10株芽孢桿菌（BV3、BT1、BS2、BS4、BS6、BS9、BS10、BH3、BC1和BA1）具有耐藥性，其他14株均具有中度敏感性；環(huán)丙沙星與恩諾沙星的藥敏結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌BS6對這2種藥顯示耐藥性，?？谘挎邨U菌BH3對環(huán)丙沙星具有中度敏感性，其他菌株都顯示出對環(huán)丙沙星的高度藥物敏感性；復(fù)方新諾明藥敏試驗表明，除了東洋芽孢桿菌BT1與蠟樣芽孢桿菌BC1菌株顯示耐藥性外，其他菌株對該藥都具有高度敏感性。

2.3 消毒劑耐受性試驗結(jié)果

2.3.1 24株菌對消毒劑耐受結(jié)果 由圖4可知，過硫酸氫鉀、漂白粉以及高錳酸鉀對大多數(shù)的芽孢桿菌無抑制作用，除了漂白粉對東洋芽孢桿菌BT1、地衣芽孢桿菌BL2和BL4的抑制作用明顯，過硫酸氫鉀對3種貝萊斯芽孢桿菌BV1～BV3有中度的抑制作用。但是聚維酮碘、戊二醛苯扎溴銨、復(fù)合碘、苯扎溴銨以及濃戊二醛的高消毒劑量對芽孢桿菌都有一定的抑制效果。

2.3.2 菌株BV1對5種消毒劑耐受結(jié)果 挑選抑菌效果、耐藥性以及對消毒劑耐受性較好的菌株BV1進一步探究不同濃度的聚維酮碘、戊二醛苯扎溴銨、復(fù)合碘、苯扎溴銨以及濃戊二醛對存活率的影響。由圖5-a可知BV1在未添加聚維酮碘消毒液的對照組（0 mg/L）中有自然消亡的過程，24 h活菌數(shù)量下降2個數(shù)量級。添加不同濃度的聚維酮碘后，試驗組BV1菌數(shù)隨著時間推移均呈先線性減少而后再略回升趨勢，其中在1 h除 16 mg/L 試驗組BV1數(shù)量表現(xiàn)出急劇下降趨勢外，其他各濃度組的活菌數(shù)下降趨勢均較緩，但下降程度大體高于對照組。4 mg/L試驗組BV1數(shù)量介于8 mg/L和 16 mg/L 試驗組間。12 h后，對照組和各試驗組的活菌數(shù)量有所升高。

BV1對不同濃度戊二醛苯扎溴銨的耐受性試驗結(jié)果（圖5-b）表明，在各個時間點，未添加消毒劑的對照組（0 mg/L）活菌數(shù)均大于添加消毒劑組；不同消毒劑濃度試驗組的BV1活菌數(shù)隨著時間推移均呈線性減少，且戊二醛苯扎溴銨的濃度越高，BV1活菌數(shù)量下降越快，其中4、8、16 mg/L試驗組的活菌數(shù)量分別在24、8、1 h降為0。

BV1對不同濃度復(fù)合碘的耐受性試驗結(jié)果見圖5-c，在各個時間點未添加消毒劑組（0 mg/L）活菌數(shù)均大于添加消毒劑組；不同消毒劑濃度試驗組的BV1活菌數(shù)隨著時間推移均減少，其中，前6 h內(nèi)，1 mg/L與2 mg/L試驗組的活菌數(shù)降低趨勢一致，且各個時間點活菌計數(shù)差異較小；4 mg/L試驗組的活菌數(shù)在前2 h時間點內(nèi)活菌數(shù)無差異，且無降低趨勢，但在2 h后活菌數(shù)急劇降低。8 mg/L與16 mg/L試驗組的活菌數(shù)下降較快。

BV1對不同濃度苯扎溴銨的耐受性結(jié)果如圖 5-d 所示，在各個時間點，未添加消毒劑對照組（0 mg/L）活菌數(shù)均大于添加消毒劑組，不同消毒劑濃度試驗組的BV1活菌數(shù)隨著時間推移均減少，且苯扎溴銨的濃度越高，BV1活菌數(shù)量下降越快。4、8、16 mg/L試驗組的BV1活菌數(shù)量均在1 h內(nèi)迅速下降2個數(shù)量級。

BV1對不同濃度濃戊二醛的耐受性試驗結(jié)果見圖5-e，在各個時間點，未添加消毒劑對照組（0 mg/L）活菌數(shù)均大于添加消毒劑組，不同消毒劑

濃度試驗組的BV1活菌數(shù)隨著時間推移均減少，且濃戊二醛的濃度越高，活菌數(shù)量下降越快。8 mg/L和16 mg/L試驗組的活菌數(shù)量均在12 h迅速下降2個數(shù)量級。

3 討論與結(jié)論

本試驗比較了水產(chǎn)源芽孢桿菌對常見病原菌的抑菌能力，并進一步檢測了芽孢桿菌對抗菌藥物和消毒劑的耐受性，將抑菌能力強、對抗菌藥物以及對常見消毒劑耐受性好的芽孢桿菌菌株篩選出來作為潛在益生菌，進而篩選出最適合實際應(yīng)用的潛在益生菌菌株。

3.1 芽孢桿菌抑菌株的篩選

芽孢桿菌作為益生菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中由來已久。芽孢桿菌廣泛存在于水生環(huán)境中，常作為益生菌制劑的主要成分改善水體和維持養(yǎng)殖水環(huán)境微生物穩(wěn)態(tài)，抑制病原菌的生長［8］；芽孢桿菌還可以刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生信號分子，使宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生具有殺菌活性的有效分子，上調(diào)宿主免疫系統(tǒng)的活性，增強其對病原體的殺菌能力［9］。

對病原體的拮抗作用是益生菌篩選的一項重要指標［10］。在益生菌初篩過程中，由于時限或效益的考慮，往往以單種或少量細菌作為指示菌進行篩選［11-13］。然而，水產(chǎn)養(yǎng)殖中的細菌病原體種類繁多，諸如弧菌（Vibrio spp.）、氣單胞菌（Aeromonas spp.）、愛德華氏菌（Edwardsiella spp.）、黃桿菌（Flavobacterium spp.）、假單胞菌（Pseudomonas spp.）和微球菌（Pseudomonas spp.）等［14］。其中，弧菌和氣單胞菌較為常見。

貝萊斯芽孢桿菌對養(yǎng)殖水體、魚類的生長性能以及減少動物疾病方面具有良好的效果［15］。Li等的研究表明，從健康的日本沼蝦體內(nèi)分離出的貝萊斯芽孢桿菌CPA1-1，在濃度達到104 CFU/mL時，對維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌等具有良好的抑菌效果［16］。本研究中，貝萊斯芽孢桿菌BV1、 BV2和BV3對選定的6種病原菌均具有中等程度以上的抑菌效果，與Li等的結(jié)果［16］相似，進一步證明了貝萊斯芽孢桿菌對弧菌屬和氣單胞菌屬細菌具有良好的抑制效果。

枯草芽孢桿菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中研究最多且應(yīng)用最廣泛的益生菌，在改善水生動物的生長、營養(yǎng)、免疫和抗病能力等方面有顯著的效果［17］。研究發(fā)現(xiàn)，隨著接種枯草芽孢桿菌濃度的提高，枯草芽孢桿菌對溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌的拮抗作用越明顯［18］。趙倩等的研究表明，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對嗜水氣單胞菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、維氏氣單胞菌均具有較強抑菌作用［19］。本研究中，枯草芽孢桿菌BS1、BS2、BS10對溶藻弧菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌和銅綠假單胞菌均具有一定程度的抑菌效果，抑菌效果比貝萊斯芽孢桿菌稍差。

3.2 芽孢桿菌耐藥菌株的篩選

芽孢桿菌對大多數(shù)的抗生素是敏感的［20］，為了避免使用抗生素時將水體或魚體中的益生菌殺死，所以在使用抗生素前進行抗菌藥物敏感性測試非常必要。本次抗菌藥物耐藥試驗中，所有芽孢桿菌對多西環(huán)素和氟苯尼考均具敏感性，敏感率比較高的還有環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明和恩諾沙星，這與目前已有關(guān)于枯草桿菌藥敏結(jié)果［21］類似。本試驗的所有菌株對新霉素表現(xiàn)出耐藥或者中度敏感，這與豬源腸道益生菌的篩選試驗中的新霉素耐藥研究結(jié)果［22］表現(xiàn)一致。

迄今為止，對于各種致病細菌引起的水產(chǎn)動物的傳染性疾病的控制，抗菌藥物無疑仍然是首選藥物［23］，但是還未對這些菌是否具有新霉素抗性基因進行鑒定，并且該基因是否存在于質(zhì)粒上仍有待于后續(xù)研究。就目前結(jié)果來看，如果這些潛在益生菌的耐藥基因是內(nèi)在的，不可轉(zhuǎn)移的，那么在使用芽孢桿菌抑制細菌的同時，配合新霉素可能會達到更好的抑菌效果。

3.3 芽孢桿菌消毒劑耐受株的篩選

芽孢桿菌消毒劑耐受性試驗結(jié)果顯示，硫酸氫鉀、漂白粉以及高錳酸鉀對大多數(shù)的芽孢桿菌無抑制作用，但是聚維酮碘、戊二醛苯扎溴銨、復(fù)合碘、苯扎溴銨以及濃戊二醛對芽孢桿菌都有一定的抑制作用。因此，結(jié)合病原菌的抑菌結(jié)果、抗菌藥物的藥敏結(jié)果以及消毒劑的定性耐受性結(jié)果，選取貝萊斯芽孢桿菌BV1進一步研究對聚維酮碘、戊二醛苯扎溴銨、復(fù)合碘、苯扎溴銨以及濃戊二醛5種不同濃度消毒劑的耐受性。

聚維酮碘又名乙烯吡咯烷酮碘，為廣譜、高效消毒劑，對細菌、真菌、病毒等都具有抑制或殺滅作用［24］。高曉華等的研究結(jié)果表明，水產(chǎn)用聚維酮碘對解淀粉芽孢桿菌G1（Bacillus amyloliquefaciens strain G1）、凝結(jié)芽孢桿菌92（Bacillus coagulans strain 92）、短小芽孢桿菌95（Bacillus pumilus strain 95）和乳酸芽孢桿菌H3（Lactobacillus sp.strain H3）的最小抑菌濃度為128～512 mg/L［25］。本試驗結(jié)果顯示，貝萊斯芽孢桿菌BV1對聚維酮碘的耐受性具有一定的濃度相關(guān)性，當聚維酮碘使用濃度達到 16 mg/L 時，會嚴重影響貝萊斯芽孢桿菌BV1的活性。與高曉華等的研究結(jié)果相比較，推測貝萊斯芽孢桿菌對聚維酮碘的耐受性可能更差，因此，如果使用聚維酮碘消毒水體，濃度不應(yīng)大于2 mg/L。

濃戊二醛是新一代醛類消毒劑，具有很強的廣譜殺菌能力，是當前醛類消毒劑中應(yīng)用較廣的一種消毒劑。張峰峰等的研究表明，戊二醛的濃度在低于0.5 mg/L時，對芽孢桿菌的生長和亞硝酸鹽的去除率無顯著影響［26］。本試驗結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌BV1對濃戊二醛的抗性具有濃度相關(guān)性，混合液濃度升高時，BV1活菌數(shù)量減少，因此平時如果使用濃戊二醛消毒水體，濃度不應(yīng)大于2 mg/L，這樣不會影響B(tài)V1的活性，與張峰峰的試驗結(jié)果一致。

戊二醛和苯扎溴銨均可作為水產(chǎn)養(yǎng)殖用殺菌消毒制劑，是水產(chǎn)動物病害防治生產(chǎn)中的常用漁藥，被用來防治車輪蟲、聚縮蟲等纖毛蟲病及細菌性疾病等，苯扎溴銨和戊二醛配合使用效果更加顯著，生產(chǎn)中常將二者合用［27-28］。貝萊斯芽孢桿菌BV1對戊二醛和苯扎溴銨的抗性具有濃度相關(guān)性，混合液濃度升高時，BV1活菌數(shù)量減少。因此，建議使用戊二醛和苯扎溴銨混合液消毒水體，濃度不應(yīng)大于2 mg/L，這樣不會影響B(tài)V1的活性。

水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的復(fù)合碘為碘酸混合液，是將碘、碘化物、鹽酸及磷酸混合制成的水溶液，具有更好的消毒效果；苯扎溴銨別名新潔爾滅，是一種季銨鹽類陽離子表面活性消毒劑，可高濃度聚集于菌體表面，影響細菌的新陳代謝，由此其抑菌濃度較低，效果較好［27］。貝萊斯芽孢桿菌BV1對復(fù)合碘和苯扎溴銨的抗性較差，當兩者使用濃度超過 2 mg/L 時，BV1的活菌數(shù)量會隨著時間迅速減少，因此為了達到水體消毒效果，同時不影響B(tài)V1的活性，復(fù)合碘和苯扎溴銨的濃度不應(yīng)超過1 mg/L。

養(yǎng)殖過程中不可避免地會使用消毒產(chǎn)品，從本試驗可知，如果水體中殘留超過閾值濃度的消毒劑會對益生菌的活性產(chǎn)生影響，因此合理選擇消毒產(chǎn)品的濃度對保持益生菌的活性非常重要。其次，益生菌對生態(tài)環(huán)境的安全性研究也需要進一步深入。

綜上所述，貝萊斯芽孢桿菌BV1可以作為潛在益生菌株用于后續(xù)水產(chǎn)益生菌制劑的開發(fā)利用；同時，在益生菌的篩選過程中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌BS10除抑菌效果較差外，在抗菌藥物耐藥性試驗和消毒劑耐受性試驗中均表現(xiàn)良好，可以考慮作為復(fù)合益生菌的備選。

3.4 結(jié)論

通過體外抑菌試驗、藥敏試驗和消毒劑耐受性試驗，從24株芽孢桿菌中篩選出1株具有強抑菌性、對抗菌藥物和消毒劑耐受性較好的貝萊斯芽孢桿菌（BV1），并且本試驗探究出的適配抗菌藥物和消毒劑濃度可作為實際養(yǎng)殖或科研的參考，以期為水產(chǎn)疫病的防控作出貢獻。

參考文獻：

［1］中華人民共和國統(tǒng)計局. 中國統(tǒng)計年鑒［M］. 北京：中國統(tǒng)計出版社，2022.

［2］農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局. 第四屆全球水產(chǎn)養(yǎng)殖大會討論通過《上海宣言》［J］. 水產(chǎn)科技情報，2021，48（6）：355.

［3］朱利霞，王洪彬，史秋梅，等. 細菌耐藥質(zhì)粒消除方法研究進展［J］. 動物醫(yī)學(xué)進展，2019，40（5）：90-93.

［4］Wang A R，Ran C，Wang Y B，et al. Use of probiotics in aquaculture of China-a review of the past decade［J］. Fish & Shellfish Immunology，2019，86：734-755.

［5］Kozasa M. Toyocerin （Bacillus toyoi） as growth promotor for animal feeding［J］. Microbiol Aliment Nutrition，1986（4）：121-135.

［6］張美玲，單承杰，杜震宇. 益生菌與魚類腸道健康研究進展［J］. 水產(chǎn)學(xué)報，2021，45（1）：147-157.

［7］俞 勇，李會榮，李 筠，等. 益生菌制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用［J］. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2001，8（2）：92-96.

［8］Olmos J，Acosta M，Mendoza G，et al. Bacillus subtilis，an ideal probiotic bacterium to shrimp and fish aquaculture that increase feed digestibility，prevent microbial diseases，and avoid water pollution［J］. Archives of Microbiology，2020，202（3）：427-435.

［9］Ofir G，Herbst E，Baroz M，et al. Antiviral activity of bacterial TIR domains via immune signalling molecules［J］. Nature，2021，600（7887）：116-120.

［10］Chauhan A，Singh R. Probiotics in aquaculture：a promising emerging alternative approach［J］. Symbiosis，2019，77（2）：99-113.

［11］Foysal M J，Lisa A K. Isolation and characterization of Bacillus sp.strain BC01 from soil displaying potent antagonistic activity against plant and fish pathogenic fungi and bacteria［J］. Journal，Genetic Engineering & Biotechnology，2018，16（2）：387-392.

［12］Wang X H，Onchari M M，Yang X T，et al. Genome analysis of Bacillus subtilis JCL16 and the synergistic relationship among its metabolites reveal its potential for biocontrol of Nocardia seriolae［J］. Biological Control，2022，167：104855.

［13］Feng Z F，Song X J，Zhao L T，et al. Isolation of probiotics and their effects on growth，antioxidant and non-specific immunity of sea cucumber Apostichopus japonicus［J］. Fish & Shellfish Immunology，2020，106：1087-1094.

［14］Guo S Y，Zhang Z Y，Guo L. Antibacterial molecules from marine microorganisms against aquatic pathogens：a concise review［J］. Marine Drugs，2022，20（4）：230.

［15］江宇琪，李仲玄，溫雪瓶，等. 貝萊斯芽孢桿菌在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究進展［J］. 飼料研究，2022（24）：142-146.

［16］Li X X，Gao X J，Zhang S M，et al. Characterization of a Bacillus velezensis with antibacterial activity and inhibitory effect on common aquatic pathogens［J］. Aquaculture，2020，523：735165.

［17］Nayak S K. Multifaceted applications of probiotic Bacillus species in aquaculture with special reference to Bacillus subtilis［J］. Reviews in Aquaculture，2021，13（2）：862-906.

［18］羅 璋，賈文平，白曉慧，等. 枯草芽孢桿菌對三種水產(chǎn)動物病原菌體外拮抗作用的研究［J］. 中國飼料，2010（14）：18-19.

［19］趙 倩，高緒娜，徐海燕，等. 1株水產(chǎn)用抑菌菌株的篩選鑒定及性質(zhì)研究［J］. 飼料研究，2022，45（10）：66-70.

［20］瞿 彬，徐文昌，宋雪琳，等. 益生菌制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用［J］. 飼料工業(yè)，2023，44（16）：62-70.

［21］楊坤明，任 航，蘇雅婷，等. 幾種商用益生芽孢桿菌特性的比較研究［J］. 中國畜牧獸醫(yī)，2018，45（5）：1241-1250.

［22］朱佳文，劉瀚揚，肖 冉，等. 乳酸菌LE-Z的篩選鑒定及其益生性的初步評價［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2021（11）：109-113，154.

［23］Pandiyan P，Balaraman D，Thirunavukkarasu R，et al. Probiotics in aquaculture［J］. Drug Invention Today，2013，5：55-59.

［24］戴瑜來，王宇希，潘彬斌，等. 幾種常用水產(chǎn)藥物對大鱗副泥鰍苗種的急性毒性試驗［J］. 淡水漁業(yè)，2015，45（4）：104-107.

［25］高曉華，曹海鵬，侯三玲，等. 水產(chǎn)用聚維酮碘對異育銀鯽養(yǎng)殖的安全性評價［J］. 動物學(xué)雜志，2013，48（2）：261-268.

［26］張峰峰，謝鳳行，周 可，等. 常見水產(chǎn)藥物對兩種水產(chǎn)益生菌活性的影響［J］. 水產(chǎn)科學(xué)，2013，32（10）：567-572.

［27］農(nóng)業(yè)部《新編漁藥手冊》委員會. 新編漁藥手冊［M］. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：428-430.

［28］聶紹發(fā)，朱桂寶，林天暉，等. 新潔爾滅與戊二醛協(xié)同殺菌作用的實驗研究［J］. 同濟醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2001（1）：50-52.