摘要：為了解枳（Poncirus trifoliata）DREB基因家族參與非生物脅迫的調(diào)控機(jī)制，基于枳基因組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法對枳DREB基因家族成員（PtrDREB）進(jìn)行全基因組鑒定，討論P(yáng)trDREB各基因的物種進(jìn)化關(guān)系及各基因在不同組織中的表達(dá)模式，并用 qRT-PCR 技術(shù)檢測9個(gè)PtrDREB家族成員在非生物脅迫處理下的相對表達(dá)量。結(jié)果表明，從枳基因組中共鑒定出48個(gè)DREB成員，不均勻地分布在9條染色體上，這些DREB成員編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列長度范圍為144～639 aa，相對分子量范圍為15 638.35～76 776.34 u，等電點(diǎn)的范圍為4.72～9.62，均為親水性蛋白；34個(gè)PtrDREB亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核中；48個(gè)PtrDREB基因分為5個(gè)亞族；DREB基因的啟動(dòng)子順式作用元件含有大量光響應(yīng)、植物激素、非生物脅迫及植物生長發(fā)育響應(yīng)元件；DREB基因家族在不同組織中的表達(dá)具有明顯差異，在根、果實(shí)、葉片、胚珠、種子和幼芽中高表達(dá)的基因數(shù)目分別為17、13、4、4、6、8個(gè)；qRT-PCR數(shù)據(jù)表明，在經(jīng)過低溫、高溫和干旱處理后，9個(gè)PtrDREB基因中分別有8、6、1個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，上調(diào)幅度分別為1.27～5.85、1.44～2.05、2.06倍，因此推測PtrDREB家族成員在非生物脅迫中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：枳；DREB基因家族；生物信息學(xué)；非生物脅迫

中圖分類號：S184；S666.401 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）15-0053-11

收稿日期：2023-09-27

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：32160731）；江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號：GJJ2201233）；贛南師范大學(xué)研究生創(chuàng)新基金（編號：YCX23A038）。

作者簡介：范麗珍（1995—），女，江西九江人，碩士研究生，主要從事柑橘功能基因挖掘與驗(yàn)證方面的研究。E-mail：1035934736@qq.com。

通信作者：李興濤，博士，副教授，主要從事果樹逆境植物生理方面的研究。E-mail：lixt.gnnu@qq.com。

脫水反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（dehydration responsive element binding protein，DREB）屬于AP2/ERF家族，是一類存在于植物中的轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)構(gòu)域由60～70個(gè)氨基酸組成，能特異性結(jié)合DRE/CRT元件，由此調(diào)控下游含DRE/CRT元件的抗逆性基因［1］。DREB家族蛋白在植物中廣泛存在，目前人們已經(jīng)分別在擬南芥［2］、水稻［2］、玉米［3］、大豆［4］和甘藍(lán)［5］中鑒定到57、57、49、73、91個(gè)DREB基因成員。Nakano等將擬南芥DREB基因家族分為A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6等6個(gè)亞族，每個(gè)亞族的DREB基因發(fā)揮不同的生理功能［1］。

研究發(fā)現(xiàn)，DREB轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對干旱、低溫及高鹽等脅迫的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在擬南芥中過表達(dá)小麥TaDREB3基因，能夠提高小麥對高溫、鹽的耐受性，在鹽、高溫處理下，分別有83%、55% TaDREB3-AI轉(zhuǎn)基因擬南芥存活，而在相同條件下，野生型擬南芥分別僅有20%、21%存活［6］。在擬南芥中超表達(dá)結(jié)縷草ZjDREB1.4基因可以顯著增強(qiáng)擬南芥對低溫、高溫的耐性［7］，在水稻中過表達(dá)擬南芥AtDREB1A基因可以增強(qiáng)水稻對干旱和低溫的脅迫［8］。Shi等研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過表達(dá)AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3能夠提高擬南芥對鹽、干旱和低溫脅迫的耐受性以及對丁香假單胞菌的抗性［9］。在菊花中過表達(dá)CmDREB6基因后，提高了菊花的耐熱性，2種轉(zhuǎn)基因菊花株系的存活率分別為85%和50%，而野生型菊花僅有3.8%的存活率［10］；在菊花中過表達(dá)擬南芥AtDREB1A基因也可以增強(qiáng)菊花對熱脅迫的耐受性，在高溫處理下有70.8%的轉(zhuǎn)基因植株存活，而野生型植株僅有16.3%存活［11］。對黃瓜進(jìn)行鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)CsDREB07、CsDREB33、CsDREB41基因的相對表達(dá)量與對照相比分別上調(diào)了2.95、2.37、2.06倍［12］。目前，對DREB基因的研究主要集中于擬南芥和其他植物，關(guān)于多年生果樹的研究較少。

本研究擬用生物信息學(xué)方法對枳（Poncirus trifoliata）PtrDREB基因家族成員進(jìn)行鑒定和系統(tǒng)性分析，用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR技術(shù)分析PtrDREB基因家族成員在低溫、高溫及干旱這3個(gè)非生物脅迫下的表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步研究PtrDREB基因家族的生物學(xué)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2022年6月至2023年8月在贛南師范大學(xué)國家臍橙工程研究中心進(jìn)行。以枳橙品種作為研究試樣。待枳苗生長1年時(shí)，選擇生長良好的植株分別進(jìn)行低溫［（0±0.5） ℃］、高溫［（38.0±0.5） ℃］和干旱（15%PEG-6000）逆境脅迫處理。收集處理0、3、6、12 h后的葉片，經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃低溫保存待用，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 枳DREB基因家族的鑒定及理化性質(zhì)分析 從CPBD（http：//citrus.hzau.edu.cn/index.php）中下載枳的全基因組數(shù)據(jù)。在UniProt數(shù)據(jù)庫中下載57個(gè)擬南芥DREB基因家族的氨基酸序列，并將其作為參考序列，對枳蛋白序列進(jìn)行本地BLAST搜索，閾值設(shè)置為e×10-5。從Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org）中下載DREB基因的隱馬爾科夫模型（PF00847），用HMMER軟件對枳蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，獲取PtrDREB家族成員，對BLAST、HMMER的結(jié)果進(jìn)行合并分析。通過CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/term）、SMART（https：//smart.embl.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1）和PfamScan（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/pfamscan/）等工具進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的驗(yàn)證，僅保留含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，且第14位氨基酸為纈氨酸（V）、第19位氨基酸為谷氨酸（E）的蛋白序列，刪除沒有AP2結(jié)構(gòu)域及含有2個(gè)AP2及AP2-B3結(jié)構(gòu)域的序列［13］。根據(jù)枳DREB基因家族成員在染色體上的分布，對其進(jìn)行命名。用在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）對PtrDREB家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)分析。通過Wolf Psorf（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位的預(yù)測。

1.2.2 枳DREB基因家族成員的染色體定位、二級結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 使用TBtools獲取枳染色體長度和PtrDREB基因在染色體上的位置信息，將染色體長度和PtrDREB基因位置信息上傳至M2G2（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0），繪制PtrDREB基因的染色體位置圖。用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa%20_sopma.html）對PtrDREB蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析?；跀M南芥的57個(gè)AtDREB蛋白序列與鑒定的枳PtrDREB蛋白序列，使用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 枳DREB基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)motif分析 將PtrDREB家族成員的基因序列和編碼序列（CDS）提交至GSDS（http：//gsds.gao-lab.org/）進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)的可視化分析。通過MEME（http：//meme-suite.org）分析PtrDREB蛋白的motif，數(shù)量設(shè)置為10，用在線網(wǎng)站iTOL（https：//itol.embl.de/itol.cgi）進(jìn)行可視化分析。

1.2.4 枳DREB基因家族成員的共線性分析和順式作用元件預(yù)測 用TBtools進(jìn)行枳基因組的共線性分析，獲得PtrDREB基因家族的共線性關(guān)系。用TBtool軟件提取PtrDREB基因的啟動(dòng)子上游 2 000 bp 的序列，將其提交至PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行順式作用元件的預(yù)測。

1.2.5 枳DREB基因家族成員在不同組織的表達(dá)從CPBD中下載枳根、葉片、果實(shí)、芽和種子等組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲取PtrDREB家族成員相應(yīng)的表達(dá)量，使用R中的pheatmap包繪制PtrDREB表達(dá)量熱圖，基因相對表達(dá)量的上調(diào)、下調(diào)表示分別用紅色、藍(lán)色表示。

1.2.6 枳DREB基因家族成員在不同脅迫處理下的qRT-PCR分析 結(jié)合PtrDREB的組織表達(dá)分析和啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測結(jié)果，選擇9個(gè)成員，利用Premier 5設(shè)計(jì)PtrDREB基因的 qRT-PCR 引物（表1）。總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成及qRT-PCR反應(yīng)體系試驗(yàn)均用杭州新景生物試劑盒（SIMGEN）完成，以柑橘ACTB［14］基因作為內(nèi)參基因，在Light-Cycler 480（Roche，Basel，瑞士）儀器上進(jìn)行PCR，流程如下：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，52 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，基因的相對表達(dá)量用 法［15］計(jì)算，在DPS軟件中用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析，最后用Sigmaplot 14.0軟件繪制相對表達(dá)量圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 枳DREB基因家族的鑒定和結(jié)構(gòu)分析

通過對枳基因組的分析，共鑒定到48個(gè)PtrDREB基因家族成員，將其命名為PtrDREB1～PtrDREB48（表2）。枳PtrDREB基因的蛋白質(zhì)編碼氨基酸數(shù)量在144～639 aa之間，相對分子量最大的為76 776.34 u，最小的為15 638.35 u，平均相對分子量為28 059.64 u。48個(gè)PtrDREB基因的等電點(diǎn)范圍為4.72～9.62，其中21個(gè)（占比為43.75%）成員呈堿性（pH值>7），27個(gè)（占比為56.25%）成員呈酸性（pH值<7）。在48個(gè)PtrDREB蛋白中，大部分都是不穩(wěn)定蛋白，僅PtrDREB12、PtrDREB28、PtrDREB37屬于穩(wěn)定蛋白。該基因家族的蛋白脂溶指數(shù)為51.57～79.24。蛋白質(zhì)的疏水性分析結(jié)果表明，48個(gè)PtrDREB蛋白具有高親水性，親水性指數(shù)（H）均小于0，屬于親水蛋白。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，37個(gè)PtrDREB蛋白定位在細(xì)胞核，其他蛋白分別定位于細(xì)胞質(zhì)（3個(gè)）、葉綠體（5個(gè)）及線粒體（3個(gè)）。

PtrDREB蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，PtrDREB蛋白中α-螺旋（AH）、延伸鏈（ES）、β-折疊（BT）、無規(guī)則卷曲（RC）的占比分別為 18.67%～45.05%、3.74%～23.08%、1.65～8.33%、39.53%～69.35%，無規(guī)則卷曲的占比最高，是PtrDREB蛋白結(jié)構(gòu)的主要組成部分（表2）。

2.2 枳DREB基因家族成員在染色體定位分析

根據(jù)PtrDREB基因的位置信息，獲得其在染色體上的定位（圖1），48個(gè)DREB基因分布在枳的9條染色體上，3號染色體上分布的PtrDREB基因最多，有18個(gè)，2號染色體上分布8個(gè)PtrDREB基因，7、9號染色體上各分布5個(gè)PtrDREB基因，5號染色體上分布4個(gè)PtrDREB基因。Chr2、Chr4、Chr6和ChrUn均包含2個(gè)PtrDREB基因。

2.3 枳DREB基因家族成員系統(tǒng)發(fā)育樹分析

采用鄰接法生成擬南芥（57個(gè)DREB蛋白）和枳（48個(gè)DREB蛋白）的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。將枳的48個(gè)DREB基因分為A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6共6個(gè)亞族，枳最大的亞族為A-6，含有14個(gè)PtrDREB。在枳所有PtrDREB成員中，A-1、A-2、A-4、A-5亞族分別有4、10、12、8個(gè)成員；枳沒有A-3亞族成員，系統(tǒng)發(fā)育樹中A-3亞族僅含有擬南芥1個(gè)成員。

2.4 枳DREB基因家族成員基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

枳DREB基因內(nèi)含子、外顯子組成及PtrDREB蛋白的motif分析結(jié)果（圖3）顯示，34個(gè)（70.83%）PtrDREB基因不包含內(nèi)含子，12個(gè)PtrDREB基因（25%）包含1個(gè)內(nèi)含子，PtrDREB8基因含有3個(gè)內(nèi)含子，而PtrDREB22基因含有的內(nèi)含子最多，有5個(gè)，表明PtrDREB基因結(jié)構(gòu)相對保守。由圖3-B可以看出，motif 1存在于所有PtrDREB蛋白中，大多數(shù)PtrDREB蛋白都含有motif 2、motif 3和motif 4，motif 5存在于A-1、A-4亞族中，此外A-5亞族的PtrDREB6、PtrDREB21、PtrDREB33基因中也含有motif 5，motif 6僅在A-1亞族和PtrDREB13、PtrDREB45基因中發(fā)現(xiàn)，而motif 9是PtrDREB44、PtrDREB48基因所特有的。

2.5 枳DREB基因家族成員的共線性分析

從PtrDREB基因家族中共檢測到9對片段復(fù)制基因（圖4），其中A-1、A-5亞族各有1對，分別是PtrDREB14-PtrDREB46、PtrDREB32-PtrDREB41，A-2、A-4亞族各有2對，分別是PtrDREB2-PtrDREB39、PtrDREB4-PtrDREB39和PtrDREB3-PtrDREB40、PtrDREB5-PtrDREB40，而PtrDREB9-PtrDREB24、PtrDREB29-PtrDREB35、PtrDREB34-PtrDREB37共3對基因則屬于A-6亞族 另外在1號染色體上檢測到2對串聯(lián)重復(fù)基因PtrDREB4-PtrDREB2、PtrDREB3-PtrDREB5，在3號染色體上有1對串聯(lián)重復(fù)基因PtrDREB15-PtrDREB27。這些存在共線性關(guān)系的基因占PtrDREB基因的比例為37.5%。

本研究計(jì)算了PtrDREB串聯(lián)基因、片段重復(fù)基因的Ka/Ks（表3），以確定促進(jìn)PtrDREB家族進(jìn)化的選擇類型。9對片段重復(fù)基因?qū)Φ腒a/Ks為 0.11～0.26，4對串聯(lián)重復(fù)基因?qū)Φ腒a/Ks為0.14～0.25，所有基因?qū)Φ腒a/Ks均<1.00。上述結(jié)果表明 在PtrDREB基因的進(jìn)化過程中可能發(fā)生了純化選擇。

2.6 枳DREB基因家族成員的順式作用元件分析

用PlantCARE對PtrDREB上游的2 000 bp序列進(jìn)行分析，結(jié)果（圖5）表明，在48個(gè)PtrDREB基因中共預(yù)測到1 369個(gè)順式作用元件，主要包括植物激素響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件和植物生長發(fā)育元件。其中，417個(gè)（30.46%）元件參與對脫落酸、生長素、茉莉酸甲甲酯、赤霉素和水楊酸等激素的響應(yīng)。在1 369個(gè)元件中，有258個(gè)（18.85%）元件參與對低溫、干旱及防御與脅迫等逆境脅迫的響應(yīng)，19個(gè)PtrDREB含有1個(gè)或多個(gè)低溫響應(yīng)元件。44個(gè)PtrDREB包含1～13個(gè)脫落酸響應(yīng)元件，28個(gè)PtrDREB包含1～3個(gè)干旱響應(yīng)元件，24個(gè)PtrDREB包含1～3個(gè)防御與脅迫響應(yīng)元件。總之，順式元件分析結(jié)果表明，所有PtrDREB基因中都至少有1種參非生物脅迫的順式作用調(diào)控元件。

2.7 枳DREB基因在不同組織的表達(dá)分析

根據(jù)枳根、葉、芽等不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)繪制PtrDREB基因在組織中的相對表達(dá)量熱圖。圖6結(jié)果顯示，17個(gè)PtrDREB在根中高表達(dá)，13個(gè)PtrDREB在果實(shí)中高表達(dá)，PtrDREB基因在葉、胚珠中高表達(dá)的數(shù)量最少，都只有4個(gè)，相對表達(dá)量最高的分別是PtrDREB37、PtrDREB43；在枳種子、芽中高表達(dá)的基因分別有6、8個(gè)。

2.8 枳DREB基因家族在不同非生物脅迫處理下的表達(dá)分析

結(jié)合PtrDREB基因家族在不同組織中的表達(dá)熱圖及啟動(dòng)子順式作用元件的預(yù)測結(jié)果，在48個(gè)基因中選取9個(gè)成員，用qRT-PCR技術(shù)檢測低溫、高溫和干旱脅迫處理的PtrDREB相對表達(dá)量。由圖7可以看出，PtrDREB16、PtrDREB22、PtrDREB48的相對表達(dá)量在低溫處理6 h后分別上調(diào)了4.08、5.85、4.15倍，PtrDREB2、PtrDREB14、PtrDREB32、PtrDREB37和PtrDREB47的相對表達(dá)量在低溫處理12 h后達(dá)到峰值，上調(diào)幅度為1.94～3.26倍，僅PtrDREB38的相對表達(dá)量沒有上調(diào)。在高溫脅迫處理后，PtrDREB2、PtrDREB16、PtrDREB32的相對表達(dá)量分別上調(diào)了2.02、2.02、1.44倍，其他基因的表達(dá)水平總體變化不大。在干旱脅迫處理后，PtrDREB47的相對表達(dá)量在干旱處理3、12 h達(dá)到峰值，分別上調(diào)2.06、2.02倍，另外8個(gè)PtrDREB基因的相對表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢。

3 討論

Nakano等分別構(gòu)建了擬南芥、水稻ERF基因家族的無根系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)進(jìn)化關(guān)系，擬南芥、水稻DREB基因家族均被劃分為6個(gè)亞族［2］。在本研究中，系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果同樣為6個(gè)亞族，但是48個(gè)PtrDREB只有5個(gè)亞族，A-3亞族缺少枳DREB基因家族成員，在番茄與擬南芥的進(jìn)化樹中，同樣發(fā)現(xiàn)番茄也缺少A-3亞族的成員［16］，本研究結(jié)果與之一致。基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，少數(shù)PtrDREB基因含有1～5個(gè)內(nèi)含子，不含內(nèi)含子的PtrDREB基因占比高達(dá)70.83%，在其他物種中也發(fā)現(xiàn)DREB基因不含有內(nèi)含子的成員占比很高，如黃瓜（78.18%）［12］、大豆（68.3%）［4］、馬鈴薯（87.69%）［17］以及甘藍(lán)型油菜（79.8%）［18］。一個(gè)沒有內(nèi)含子或者內(nèi)含子數(shù)量少的基因，其轉(zhuǎn)錄速度比內(nèi)含子數(shù)多的基因快，沒有內(nèi)含子的基因無需進(jìn)行剪接，能夠更快地產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物［19］，70.83% PtrDREB基因不含有內(nèi)含子，可能是應(yīng)對快速響應(yīng)逆境脅迫的進(jìn)化行為。依據(jù)枳DREB基因的復(fù)制事件分析可知，PtrDREB家族成員中存在9對染色體片段復(fù)制和3對染色體串聯(lián)復(fù)制，說明在枳DREB基因進(jìn)化過程中，染色體片段復(fù)制是其進(jìn)化的一個(gè)重要過程。

大量研究發(fā)現(xiàn)，DREB基因在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。過表達(dá)DREB基因可以增強(qiáng)擬南芥［20-22］、水稻［23-24］、煙草［25-26］、馬鈴薯［27-28］等多種植物抗旱、耐低溫、抗凍和耐鹽的表達(dá)特性。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測3個(gè)逆境脅迫條件（分別是低溫、高溫和干旱脅迫）下9個(gè)PtrDREB基因的相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)與對照相比，PtrDREB2、PtrDREB14、PtrDREB16、PtrDREB22、PtrDREB32、PtrDREB37、PtrDREB47和PtrDREB48共8個(gè)基因響應(yīng)低溫脅迫，PtrDREB2、PtrDREB14、PtrDREB16、PtrDREB22、PtrDREB32和PtrDREB47共6個(gè)基因響應(yīng)高溫脅迫，僅PtrDREB47基因積極響應(yīng)干旱脅迫，進(jìn)一步說明枳PtrDREB基因家族參與非生物脅迫響應(yīng)。本研究對枳DREB基因家族進(jìn)行鑒定及其表達(dá)分析，為進(jìn)一步探索枳DREB基因參與逆境響應(yīng)的分子機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究基于枳基因組數(shù)據(jù)庫，用生物信息學(xué)對枳DREB基因家族進(jìn)行全基因組鑒定和分析，鑒定出48個(gè)DREB基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測其中9個(gè)基因響應(yīng)非生物脅迫的相對表達(dá)量。研究結(jié)果顯示，PtrDREB基因家族分布在9條染色體上，被劃分為5個(gè)亞族，18個(gè)基因發(fā)生了基因復(fù)制事件，qRT-PCR結(jié)果顯示，9個(gè)PtrDREB基因?qū)Φ蜏亍⒏邷睾透珊档让{迫都有響應(yīng)，推測枳DREB基因家族可能參與了非生物脅迫的應(yīng)答。

參考文獻(xiàn)：

［1］劉 坤，李國婧，楊 杞. 參與植物非生物逆境響應(yīng)的DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，2022，38（5）：201-214.

［2］Nakano T，Suzuki K，F(xiàn)ujimura T，et al. Genome-wide analysis of the ERF gene family in Arabidopsis and rice［J］. Plant Physiology，2006，140（2）：411-432.

［3］Zhuang J，Deng D X，Yao Q H，et al. Discovery，phylogeny and expression patterns of AP2-like genes in maize［J］. Plant Growth Regulation，2010，62（1）：51-58.

［4］Zhou Y X，Zhou W，Liu H，et al. Genome-wide analysis of the soybean DREB gene family：identification，genomic organization and expression profiles in response to drought stress［J］. Plant Breeding，2020，139（6）：1158-1167.

［5］Thamilarasan S K，Park J I，Jung H J，et al. Genome-wide analysis of the distribution of AP2/ERF transcription factors reveals duplication and CBFs genes elucidate their potential function in Brassica oleracea［J］. BMC Genomics，2014，15：422.

［6］Niu X，Luo T L，Zhao H，et al. Identification of wheat DREB genes and functional characterization of TaDREB3 in response to abiotic stresses［J］. Gene，2020，740：144514.

［7］Feng W Q，Li J，Long S X，et al. A DREB1 gene from zoysiagrass enhances Arabidopsis tolerance to temperature stresses without growth inhibition［J］. Plant Science：an International Journal of Experimental Plant Biology，2019，278：20-31.

［8］Latha G M，Raman K V，Lima J M，et al. Genetic engineering of indica rice with AtDREB1A gene for enhanced abiotic stress tolerance［J］. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2019，136（1）：173-188.

［9］Shi H T，Qian Y Q，Tan D X，et al. Melatonin induces the transcripts of CBF/DREB1s and their involvement in both abiotic and biotic stresses in Arabidopsis［J］. Journal of Pineal Research，2015，59（3）：334-342.

［10］Du X P，Li W Y，Sheng L P，et al. Over-expression of chrysanthemum CmDREB6 enhanced tolerance of chrysanthemum to heat stress［J］. BMC Plant Biology，2018，18（1）：178.

［11］Hong B，Ma C，Yang Y J，et al. Over-expression of AtDREB1A in chrysanthemum enhances tolerance to heat stress［J］. Plant Molecular Biology，2009，70（3）：231-240.

［12］王 燦. 黃瓜CsHSFA1功能鑒定及DREB家族生物信息學(xué)分析［D］. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2022：46-55.

［13］馮 軍，鄭彩霞. DREB轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫中的作用及應(yīng)用研究［J］. 植物生理學(xué)報(bào)，2011，47（5）：437-442.

［14］嚴(yán)佳文.柑橘內(nèi)參基因篩選及轉(zhuǎn)pthA基因甜橙的表達(dá)分析［D］. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010：31.

［15］Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method［J］. Methods，2001，25（4）：402-408.

［16］Maqsood H，Munir F，Amir R，et al. Genome-wide identification，comprehensive characterization of transcription factors，cis-regulatory elements，protein homology，and protein interaction network of DREB gene family in Solanum lycopersicum［J］. Frontiers in Plant Science，2022，13：1031679.

［17］Mushtaq N，Munir F，Gul A，et al. Genome-wide analysis，identification，evolution and genomic organization of dehydration responsive element-binding （DREB） gene family in Solanum tuberosum［J］. PeerJ，2021，9：e11647.

［18］Ghorbani R，Zakipour Z，Alemzadeh A，et al. Genome-wide analysis of AP2/ERF transcription factors family in Brassica napus［J］. Physiology and Molecular Biology of Plants，2020，26（7）：1463-1476.

［19］Ma L T，Zhu T，Wang H R，et al. Genome-wide identification，phylogenetic analysis and expression profiling of the late embryogenesis-abundant （LEA） gene family in Brachypodium distachyon［J］. Functional Plant Biology，2021，48（4）：386-401.

［20］Qin F，Kakimoto M，Sakuma Y，et al. Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat stresses in Zea mays L.［J］. The Plant Journal，2007，50（1）：54-69.

［21］Chen M，Xu Z S，Xia L Q，et al. Cold-induced modulation and functional analyses of the DRE-binding transcription factor gene，GmDREB3，in soybean （Glycine max L.）［J］. Journal of Experimental Botany，2009，60（1）：121-135.

［22］Chen M，Wang Q Y，Cheng X G，et al. GmDREB2，a soybean DRE-binding transcription factor，conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications，2007，353（2）：299-305.

［23］Oh S J，Song S I，Kim Y S，et al. Arabidopsis CBF3/DREB1A and ABF3 in transgenic rice increased tolerance to abiotic stress without stunting growth［J］. Plant Physiology，2005，138（1）：341-351.

［24］吳關(guān)庭，郎春秀，胡張華，等. 轉(zhuǎn)CBF1基因增強(qiáng)水稻的耐逆性［J］. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，20（3）：169-173.

［25］Liu X Q，Liu C Y，Guo Q，et al. Mulberry transcription factor MnDREB4A confers tolerance to multiple abiotic stresses in transgenic tobacco［J］. PLoS One，2015，10（12）：e0145619.

［26］孫瑞芬，張艷芳，聶利珍，等. 向日葵HaDREBA5基因克隆及其對生物和非生物脅迫的響應(yīng)［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2021，29（5）：900-914.

［27］Watanabe K N，Kikuchi A，Shimazaki T，et al. Salt and drought stress tolerances in transgenic potatoes and wild species［J］. Potato Research，2011，54（4）：319-324.

［28］Behnam B，Kikuchi A，Celebi-Toprak F，et al. Arabidopsis rd29A：：DREB1A enhances freezing tolerance in transgenic potato［J］. Plant Cell Reports，2007，26（8）：1275-1282.