摘要：冷脅迫會直接影響植物的生長和發(fā)育，并在植物體內不斷累積有害物質。谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST）是一種對細胞保護至關重要的抗氧化酶，通過減少活性氧引起的生理性損傷，在生物和非生物應激反應中發(fā)揮重要作用。藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）中富含蛋白質、氨基酸等對人體有益的物質，但藜麥苗期易受冷空氣侵襲而導致減產。因此，鑒定藜麥耐寒相關基因是必要的，為此鑒定藜麥GST基因家族成員，并分析藜麥GST基因在冷脅迫下不同組織中的表達模式。結果表明，在藜麥基因組中共鑒定出59個藜麥GST基因成員，其氨基酸長度范圍為199～416 aa，分子量在22.72～47.45 ku范圍內，隨機分布在14條染色體上，通過系統(tǒng)發(fā)育分析將其分為8個亞家族，在啟動子區(qū)域中分析發(fā)現多個低溫順式作用元件（LTR）和多種生長發(fā)育及代謝相關的元件。在藜麥GST基因家族中共發(fā)現11對串聯重復基因和11對片段重復基因，表明基因復制事件是該物種GST基因家族進化的主要驅動力?；虻慕M織特異性表達分析結果顯示，大多數藜麥GST基因在不同持續(xù)時間的冷脅迫下可以作出響應，特別是在葉片上高表達。結果可為進一步研究藜麥GST基因功能提供基礎，為藜麥耐寒品種選育提供候選基因。

關鍵詞：藜麥；GST基因家族；冷脅迫；表達分析；基因鑒定

中圖分類號：S519.01 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）15-0033-11

收稿日期：2023-09-12

基金項目：國家自然科學基金（編號：32260481）；莧菜育種科技合作項目（編號：H2022230）；貴州現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設雜糧特色項目（編號：黔財農［2019］15號）。

作者簡介：周光怡（1999—），女，貴州遵義人，碩士研究生，研究方向為作物遺傳育種。E-mail：zgy22118@163.com。

通信作者：任明見，碩士，教授，博士生導師，研究方向為作物遺傳育種。E-mail：rmj72@163.com。

低溫脅迫是限制植物生長的主要環(huán)境因素之一［1-2］。當植物受到冷空氣侵襲時，植物體內會積累大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）等有害物質，這些物質的積累會破壞植物細胞中的各個細胞器、蛋白質、細胞膜脂質等，從而破壞膜的完整性和功能，影響植物的正常生理代謝［3］。

谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST）屬于抗氧化酶，谷胱甘肽（GSH）在谷胱甘肽S-轉移酶的催化下能將有毒物質轉化為無害或低毒物質，利用谷胱甘肽作為共底物或輔酶來發(fā)揮一系列的功能作用，在植物的生長發(fā)育和非生物脅迫中起著至關重要的作用［4-5］。Booth等于1961年在大鼠肝臟上首次發(fā)現谷胱甘肽S-轉移酶［6］；1970年，Shimabukuro等在研究玉米除草劑解毒機制時，第一次在植物上發(fā)現谷胱甘肽S-轉移酶［7］。GST基因家族在植物中起著非常廣泛的作用。Tzafestas等發(fā)現，AtGSTU24和AtGSTU25可以催化擬南芥2-谷胱甘肽-4，6-二硝基甲苯的形成，該物質是一種生物降解型化合物，可以減少環(huán)境中有害物質的含量，從而起到植物性修復功能［8］。此外，谷胱甘肽S-轉移酶參與次生代謝物的運輸和儲存，特別在花青素方面的報道最多，研究發(fā)現，MdGSTF6的沉默可以影響蘋果果實中花青素的積累［9］；在日本龍膽花花瓣中也有相關研究，通過CRISPR/Cas9技術證實了GST1對花色素沉著的貢獻［10］。除此之外，GST基因家族成員在植物抗性方面也具有重要作用。Hao等通過轉錄組分析證明，GST家族基因在小麥受到高濃度鹽脅迫時表達量升高［11］。Srivastava等研究發(fā)現，過表達OsGSTU30的水稻植株，對重金屬和干旱脅迫的耐受性均有提高［12］。Song等通過研究哈密瓜的GST基因家族特征，擴展了關于哈密瓜中GST基因介導應激反應機制的認識［13］。在玉米［14］、水稻［15］、南瓜［16］和油菜［17］中也有大量關于植物抗逆性的報道，特別是一些屬于Tau、Phi和DHAR亞家族的成員基因在逆境脅迫中發(fā)揮著顯著作用，將它們視為進一步研究的候選基因。

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）是一種富含蛋白質、氨基酸等對人體有益物質的作物，具有耐旱、耐鹽等特點，起源于安迪斯山脈地區(qū)，目前在我國也被廣泛種植［18-20］。長時間的低溫脅迫會直接影響藜麥苗期幼苗的成活率以及成熟期的結實率，因此研究藜麥苗期在冷脅迫下的基因表達是有必要的。本研究對藜麥GST家族進行全基因組鑒定，并對鑒定出的CqGST基因進行生物信息學分析，同時分析CqGST基因在不同冷脅迫持續(xù)時間下不同組織中的表達情況，旨在為進一步研究CqGST基因的功能提供理論基礎，并為高海拔寒冷地區(qū)藜麥品種的選育提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 藜麥GST基因家族成員的鑒定

從藜麥基因組網站（https：//www.cbrc.kaust.edu.sa/chenopodiumdb/）獲取藜麥（C. quinoa V1 pseudomolecule）的全基因組信息，同時在PFAM蛋白數據庫（http：//pfam.xfam.org/）中下載GST基因結構域（GST-C：PF00043和GST-N：PF02798），利用Perl腳本對藜麥全基因組進行GST結構域檢索，篩選范圍為e-value≤1×10-5，將已篩選得到的候選基因導入SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進行GST結構域的再次確定，同時將篩選得到的蛋白序列提交至ExPasy website （http：//web.expasy.org/protparam/），計算該基因的氨基酸長度、分子量大小和等電點。

1.2 進化樹的構建和基因結構分析

使用ClustalW對鑒定出的CqGST與擬南芥AtGST、水稻OsGST進行多序列比對，并使用MEGA 11中的鄰接（neighbor joining，MJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap重復值為1 000，最后利用Evolview在線網站（https：//www.evolgenius.info/）對進化樹進行美化。利用MEME（https：//meme-suite.org/）鑒定CqGST的保守基序motif，并使用TBtools繪制家族成員的基因結構［21］，提交CqGST蛋白序列至蛋白質三級結構在線預測網站SwissModel（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）進行模型構建。

1.3 染色體定位與基因復制

6個物種（擬南芥、菠菜、馬鈴薯、水稻、谷子和二穗短柄草）的基因組信息來源于Ensembl基因組數據庫（http：//ensemblgenomes.org/）。在藜麥基因注釋文件中得到染色體位置信息，并利用TBtools進行分析與作圖。使用MCScan X軟件分析CqGST的基因復制事件，同時將篩選得到的CqGST家族成員分別與3種雙子葉植物（擬南芥、菠菜、馬鈴薯）和3種單子葉植物（水稻、谷子、二穗短柄草）進行共線性分析［22］。使用MEGA軟件對59個基因進行比對，并進行Ka/Ks分析，通過Ka/Ks值確定重復基因間的選擇方式，Ka/Ks<1、Ka/Ks=1和Ka/Ks>1的含義分別是純化選擇、中性選擇和正向選擇。

1.4 啟動子區(qū)順式作用元件分析

為進一步研究藜麥GST基因家族的功能，使用在線軟件PlantCare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對家族成員啟動子上游2 000 bp區(qū)域進行順式作用元件分析，并使用TBtools進行圖形可視化。

1.5 CqGST基因在冷脅迫下的表達模式分析

1.5.1 試驗材料及處理

以青藜1號為試驗材料，試驗于2023年5月在貴州大學農學院人工氣候室完成。選擇飽滿一致的種子進行催芽，待長出4張真葉后移植于長、寬均為8 cm，高為12 cm的盆中，土壤基質選用土和蛭石（重量比為1 ∶1）的混合物，并置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為白天16 h/25 ℃，夜間8 h/18 ℃，空氣相對濕度為75%，光照度為 15 000 lx。培養(yǎng) 10 d 后，將長勢一致的幼苗放入提前4 ℃預冷的人工氣候箱中，分別于處理0、3、12、24、48 h時取樣，包括幼苗的根、莖、葉，每個處理取3個重復，取樣后迅速在液氮中冷凍并轉移至 -80 ℃ 條件下進行保存。

1.5.2 實時熒光定量PCR

采用天根生化科技（北京）有限公司的RNA Easy Fast Plant Tissue Kit試劑盒和cDNA第一鏈合成預混試劑對所取樣品的RNA進行提取，并反轉錄合成cDNA。將基因序列提交至生工生物工程（上海）股份有限公司在線網站（https：//www.sangon.com/）進行引物設計并合成（表1），根據Talent q-PCR PreMix（SYBR Green）試劑盒說明書配制反應體系，設置3個技術重復。擴增程序：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性10 s，59 ℃ 退火30 s，40個循環(huán)。以CqEF1α基因為內參基因，使用2-ΔΔCT法分析目標基因的相對表達量，并使用SPSS軟件對獲得的數據進行ANOVA分析，使用Origin 8.0軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 藜麥GST基因家族的鑒定

使用隱馬爾科夫模型在藜麥基因組中共鑒定出59個GST基因家族成員，這些基因都含有GST-C或GST-N結構域，通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹，將59個基因聚類為8個亞家族，并為基因成員進行重新命名。理化性質分析結果（表2）表明，59個藜麥GST基因的蛋白長度在199 aa（CqGSTZ2）至 416 aa（CqEF1Bγ1、CqEF1Bγ2）之間，分子量在 22.72 ku（CqGSTZ2）至47.45 ku（CqEF1Bγ3）之間，等電點位于4.58（CqGSTU3）至9.62（CqTCHQD）之間。

2.2 藜麥GST基因家族的系統(tǒng)進化樹分析

為明確藜麥GST基因家族成員的系統(tǒng)進化關系，將獲得的59個藜麥GST蛋白與已知的48個擬南芥和82個水稻GST蛋白進行多序列比對，最終將59個藜麥GST基因家族成員劃分為8個亞家族。從圖1可以看出，Tau是最大的亞家族，有31個家族成員，占比52.54%；其次是Phi亞家族，有12（20.34%）個家族成員；有5個成員屬于GHR分支，EF1B、Zeta和Lambda亞家族均有3個成員，而DHAR和TCHQD亞家族均僅有1個成員。藜麥中沒有發(fā)現聚類在Theta、Hemerythrin、Iota等亞家族上的成員基因。

2.3 藜麥GST基因家族的保守基序和基因結構分析

為更直觀地了解藜麥GST基因家族的結構及多樣性，本研究對59個CqGST基因序列進行對比分析，得到保守基序圖和基因結構圖。如圖2所示，共鑒定出10個保守基序，幾乎所有成員中都可以觀察到3～6個motif，且大部分基因成員含有motif 3，說明motif 3在藜麥GST基因家族中較為保守。Tau、Phi和Lambda亞家族中均含有motif 1、motif 3、motif 4、motif 5 且排列順序一致，Phi亞家族中還含有獨有的motif 7。各亞家族成員間的motif排列相似，表明保守基序可能在特定過程中發(fā)揮關鍵作用。59個藜麥GST基因家族成員都含有內含子，說明藜麥GST家族成員可能含有多種進化方向，并且具有一定的亞家族特異性，其中Lambda亞家族的成員（CqGSTL1～CqGSTL3）內含子最多，有9個；而Tau亞家族的成員內含子數量均僅有1個，除CqGSTU31外，成員的內含子基因長度都短；Phi亞家族普遍有2個內含子，其余家族成員的內含子數量在2～8個之間。

2.4 藜麥GST基因家族蛋白三級結構預測

利用在線網站SwissModel對藜麥GST蛋白進行三級結構預測，每個亞家族展示1個蛋白，結果如圖3所示。模型的GMQE評分大于0.80，表明模型預測具有較高的可靠性。從圖3可以看出，藜麥GST蛋白的三級結構主要包括α-螺旋與無規(guī)則卷曲，除Lambda和DHAR亞家族的單體結構外，其余亞家族成員都是同源二聚體結構，說明藜麥GST蛋白結構穩(wěn)定且富有彈性。藜麥GST蛋白的C端結構域主要由α-螺旋組成，螺旋結構有助于h位點的形成以及逆境下的特異性結合，而N端結構域主要由α-螺旋和β-折疊共同組成。

2.5 藜麥GST基因家族染色體定位與基因復制

如圖4所示，59個藜麥GST基因不均勻地分布在14條染色體中，包括01、02、03、05、06、07、08、10、11、12、14、16、17、18號染色體，而在00、04、09、13、15號染色體上未發(fā)現存在藜麥GST基因，推測GST家族基因在長期進化過程中發(fā)生了片段丟失或染色體移位。Chr07號染色體上分布的基因成員最多（11個，18.64%），其次是Chr17號染色體（9個，15.25%）和Chr10號染色體（7個，11.86%）。

2.6 藜麥GST基因家族的物種間共線性分析

為進一步探究藜麥GST家族基因與其他物種的系統(tǒng)發(fā)育關系，對藜麥59個GST基因家族成員與3種雙子葉植物（擬南芥、菠菜、馬鈴薯）和3種單子葉植物（水稻、谷子、二穗短柄草）進行同源性分析，通過TBtools軟件構建6個物種的共線性圖譜，不同物種以不同顏色區(qū)分。結果（圖5）表明，藜麥與雙子葉植物的親緣關系更近，其中與同屬藜科的菠菜關系更密切，共有12個藜麥GST基因與菠菜中的基因同源，其次是擬南芥（11個）和馬鈴薯（7個）；與單子葉植物的親緣關系較遠，只有2個藜麥GST基因（CqGSTF4、CqGSTF9）與水稻有同源關系，與二穗短柄草只有1個同源基因（CqGSTF1），與谷子沒有同源基因，且僅有的3個同源基因都屬于Phi亞家族。

2.7 藜麥GST基因家族的串聯重復與片段重復

在同一染色體上100 kb區(qū)域內的同源基因對被認為是串聯重復基因，而位于100 kb區(qū)域以外或定位在不同染色體上的同源基因對被認為是片段重復基因。對全部家族成員進行串聯重復分析，結果（圖4）顯示，共包括11對串聯重復基因，其中在06、08、16、17號染色體上各有2對，在01、03、18號染色體上各有1對，但沒有在家族成員最多的Chr07號染色體上發(fā)現基因串聯重復現象。除基因串聯重復分析外，本研究通過Circos圖清晰地展示了發(fā)生在藜麥不同染色體間的11對片段重復（圖 5-a），與串聯重復不同的是，大多數片段重復發(fā)生在Chr07號染色體上（6對，54.55%）。其中，Tau亞家族基因中存在著最多的串聯重復和基因復制現象。進一步分析發(fā)現，CqGSTU13、CqGHR3和CqEF1Bγ1既存在串聯重復現象又存在片段重復現象，在藜麥染色體上22對CqGSTs復制基因對中，有19對（8636%）復制基因對的Ka/Ks<1（表3），說明大多數重復基因是處于純化選擇壓力下進化的，主動消除了有害的重復，增加了新的重復基因的融合可能性。上述結果表明，CqGST基因家族的進化模式相對保守。

2.8 藜麥GST基因家族啟動子順勢元件分析

啟動子水平上的基因表達主要由轉錄起始位點上游的順式元件控制，啟動子區(qū)域的順式作用元件通過與轉錄因子結合作為分子開關，與基因轉錄起始和活性有關，這為理解基因功能和空間特異性表達提供了方便。為探究藜麥GST基因的功能，利用PlantCARE在線網站檢測轉錄起始位點上游 2 000 bp 的序列，并鑒定順式元件，使用TBtools軟件對鑒定出的部分元件進行可視化，結果如圖6所示。其中，與光響應相關的順式作用元件數量最多，還有與生長和發(fā)育相關的CAT-box、circadian以及與激素反應相關的ABRE （ABA激素響應元件）、CGTCA-motif （茉莉酸甲酯響應元件）和TGA-element （生長素響應元件）。需要特別關注的是，59個藜麥GST基因均至少含有1個與逆境脅迫有關的元件，這說明藜麥GST基因家族在逆境下可以及時作出響應，其中有24個基因都含有LTR（冷脅迫響應元件）。

2.9 藜麥GST基因家族的表達模式分析

藜麥GST基因家族在冷脅迫下的組織特異性表達結果如圖7所示，可以看出，8個藜麥GST基因成員的相對表達量均出現顯著性差異。CqGSTU18、CqGSTF2、CqEF1Bγ2和CqGSTL2在葉片上的相對表達量明顯高于根和莖，均在冷脅迫24 h后達到峰值，其中，CqGSTU18和CqGSTF2在冷脅迫24 h時葉片上的相對表達量分別是對照的120倍和70倍。CqGSTZ1、CqDHAR和CqGHR1在冷脅迫處理后的相對表達量總體上低于對照，根和莖上的CqTCHQD在冷脅迫12 h后相對表達量最高，葉片上在冷脅迫24 h后相對表達量最高，且表達量隨冷脅迫時間的延長呈先上升后下降的趨勢。

3 討論與結論

谷胱甘肽S-轉移酶家族基因已經在擬南芥［23］、小麥［24］、蘋果［25］、楊樹［26］等植物中被證實有重要的生物學意義，研究不同物種的GST家族成員具有必要性，不同物種間的基因成員數量差異較大，說明在物種的進化過程中，GST家族基因復制事件的發(fā)生率較高。本研究通過生物信息學分析的方法對藜麥谷胱甘肽S-轉移酶基因家族進行系統(tǒng)分析，共鑒定出59個藜麥GST基因，根據其基因結構和保守基序的相似性，將這些成員分為8個亞家族，這與在小麥上的研究結果［24］相似。蛋白質的功能與基因結構相關，從基因結構與motif分析結果來看，同一亞家族內基因成員的結構相似，說明亞家族不同可能存在不同功能。藜麥GST基因家族分類結果顯示，Tau亞家族中的基因所占比例最大，說明Tau亞家族基因可能在植株響應逆境時發(fā)揮重要作用。此外，Jeffares等報道，內含子可以延遲調控反應，內含子數量越少越可以對外界脅迫及時作出反應［27］。通過基因結構分析發(fā)現，59個藜麥GST基因至少含有1個內含子，表明藜麥GST基因在進化過程中基因結構發(fā)生變異，而內含子、外顯子結構的差異往往可以推動多基因家族的進化［28］，因此，推斷內含子較少的Tau、Phi、DHAR和TCHQD亞家族成員可以在非生物脅迫中作出快速反應。GST基因家族在藜麥中的廣泛分布導致該基因家族具有多樣性和復雜性，這可能是其在多種非生物脅迫下發(fā)揮作用的關鍵因素之一［13］。大多數藜麥GST家族成員擁有較高穩(wěn)定性的二聚體結構，該結構可以催化多種外來物質的結合，從而發(fā)揮更多功能［29］。

片段重復在基因家族的產生中起著重要的作用，可能會導致染色體重排，進而促進基因功能的多樣化［30］。從藜麥的串聯復制來看，藜麥GST基因家族的擴增主要是因為Tau和Phi亞家族的擴增，其中，Tau亞家族中存在著12對基因對串聯重復和基因復制現象，占比是全部基因復制的54.55%，這也是Tau亞家族成員最多的原因，在擬南芥［31］、馬鈴薯［32］、辣椒［33］等植物的基因組中也發(fā)現過類似的結果?；虼搹椭婆c片段重復事件主要發(fā)生在Tau和Phi亞家族中，推測這些基因可能與植株應對生物與非生物脅迫的能力有關，包括耐鹽性、耐旱性以及對金屬離子的耐受性和花青素積累［31，34-36］。藜麥與擬南芥、水稻、菠菜、馬鈴薯和二穗短柄草等物種間的共線性分析結果表明，藜麥GST家族中大多數成員基因是在雙子葉植物和單子葉植物分化后形成的，但Phi亞家族與單子葉植物也存在著少量共線性關系，這些復制基因對可證實它們存在于雙子葉植物和單子葉植物分化以前。順式元件分析結果顯示，大部分GST基因均在ABRE、MBS和LTR順式元件中富集，說明這些基因可能參與非生物、生物脅迫響應以及植物激素轉導途徑的調控。

根據藜麥GST基因在不同冷脅迫持續(xù)時間下不同組織中的特異性表達結果發(fā)現，大部分基因在冷脅迫誘導下能作出響應并顯著高表達，特別是在冷處理24 h的葉片上，在其他植物中也有類似的結論［13，17，25，34］，因此可以將高表達的基因作為候選基因進行下一步的研究。本研究結果可為藜麥耐寒品種選育提供候選基因，也為GST基因家族功能的研究提供新思路。

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