摘要 為研究新型鵝星狀病毒（Novel goose astroviruses，N-GAstV）的遺傳進化特征，獲得了鵝星狀病毒安徽分離株AstV/AHHX的全長基因，為7 251 nt。測序分析顯示：AstV/AHHX具有典型的新型鵝星狀病毒基因組特征。AstV/AHHX與分離株GDZJ37以及山東分離株G538和G576的遺傳距離較近；同時與毒株GDZJ37、G538和G576的ORF2氨基酸序列同源性達100%，ORF1a和ORF1b的同源性也有99.6%以上，推測它們由同一毒株演化而來。ORF2氨基酸序列位點分析顯示有12高變異位點，分別是第36（Y/S/H）、60（V/I）、224（T/A）、228（A/S/T）、229（P/Q）、289（T/A）、376（T/A）、456（D/E）、540（Q/L）、608（S/T）、610（E/D/G）、614（N/A/T）位氨基酸。其中第224、228、229、608、614位的氨基酸突變可能導(dǎo)致病毒蛋白質(zhì)的構(gòu)象及功能發(fā)生變化，進而改變病毒的致病能力。

關(guān)鍵詞 新型鵝星狀病毒；全基因；序列分析；組織分布

中圖分類號 S 852.65 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）16-0087-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.16.018

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Whole Gene Sequence Analysis of a Novel Goose Astrovirus

ZHAO Rui-hong^1，2，HU Xiao-miao^1，2，HOU Hong-yan^1，2 et al

（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Anhui Academy of Agricultural Science/Livestock and Poultry Epidemic Diseases Research Center of Anhui Province，Hefei，Anhui 230031；2.Anhui Province Key Laboratory of Livestock and Poultry Product Safety Engineering，Hefei，Anhui 230031）

Abstract In order to study the genetic and evolutionary characteristics of a novel goose astrovirus（N-GAstV），the full-length genes of Anhui strain AstV/AHHX were cloned in this study，and it was 7 251 nt.Sequencing analysis showed that AstV/AHHX had typical characteristics of N-GAstV.The phylogenetic tree showed that AstV/AHHX was relatively close to GDZJ37 isolates from China，G538 and G576 isolates from Shandong Province in recent years.The homology of ORF2 with GDZJ37，G538 and G576 was 100%，and the homology of ORF1a and ORF1b was more than 99.6%.Presumably they evolved from the same strain.Amino acid sequence analysis of ORF2 revealed 12 highly variable sites.They were the amino acid sites，36（Y/S/H），60（V/I），224（T/A），228（A/S/T），229（P/Q），289（T/A），376（T/A），456（D/E），540（Q/L），608（S/T），610（E/D/G），614（N/A/T）.Amino acid mutations at position 224，228，229，608 and 614 may lead to changes in the conformation and function of viral proteins，then the pathogenic ability of the virus was altered.

Key words Novel goose astroviruses；Whole gene；Sequence analysis;Tissue distribution

基金項目 安徽省科技重大專項（ 202003a06020012）；安徽省家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（AHCYJSTX-06） 。

作者簡介 趙瑞宏（1973—），男，安徽巢湖人，副研究員，碩士，從事畜禽傳染學(xué)研究。

*通信作者，副研究員，博士，從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究。

收稿日期 2023-09-06

鵝星狀病毒（goose astroviruses，GAstV）是星狀病毒科禽星狀病毒屬成員，無囊膜，單股正鏈RNA病毒。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，我國流行的鵝星狀病毒分為2個基因型群組，以AHDY和FLX為代表毒株的GAstV-I基因型和以SD01、AHAU5毒株為代表的GAstV-II基因型^［1-3］。其中，GAstV-II基因型，又稱新型鵝星狀病毒（novel goose astroviruses，N-GAstV），主要引發(fā)以內(nèi)臟尿酸鹽沉積為癥狀的鵝痛風(fēng)病^［4］。該病主要發(fā)生在3～20日齡的雛鵝，不同品種的雛鵝均可發(fā)生，發(fā)病率在80%～90%，死亡率高達50%以上^［5］。病程可持續(xù)7～10 d，幸存的鵝生長緩慢，易發(fā)生繼發(fā)性細(xì)菌感染。

新型鵝星狀病毒基因組長約7 100 bp，包含3個連續(xù)開放性閱讀框ORF1a、ORF1b和ORF2，兩端含5′端非編碼區(qū)和3′端非編碼區(qū)以及含有3′端poly（A）結(jié)構(gòu)^［6-7］。其中ORF1a和ORF1b編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2則編碼病毒衣殼蛋白（Cap蛋白），Cap蛋白是星狀病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)^［8-10］。

近年我國許多養(yǎng)鵝地區(qū)暴發(fā)新型鵝星狀病毒病，給鵝養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失^［11-15］。目前預(yù)防該病尚無有效的疫苗，研究新型鵝星狀病毒的遺傳進化特征，有助于進一步研究其致病機制，為更好地防控該病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株。N-GAstV安徽分離株AstV/AHHX由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實驗室分離、鑒定并保存，毒株分離于安徽省馬鞍山地區(qū)。

1.1.2

主要工具酶和試劑。Taq酶、dNTP、cDNA第一鏈合成試劑盒等購自寶生物工程（大連）有限公司，DNA Marker、瓊脂糖（電泳純）等購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計。根據(jù)GenBanK已經(jīng)發(fā)表的N-GAstV基因序列，采用Primer 5.0 設(shè)計1對 RT-PCR 特異性擴增引物，P-1：5′-TCATTACGAGCAGGAGAA-3′，P-2：5′-CTGCACCGCAACTTTAAA-3′，預(yù)期擴增片段為460 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 RNA提取。使用Trizol試劑抽提取病毒液的總RNA。以提取的總RNA為模板合成cDNA，具體方法參照TaKaRa公司cDNA第一鏈合成試劑盒使用說明書。

1.2.3 PCR鑒定。采用設(shè)計的引物，以獲得的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 3.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，加雙蒸水補足60 μL。按以下程序進行擴增：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，送上海生工測序鑒定。

1.2.4 全基因測序和分析。將鑒定后的病毒cDNA樣品送至上海凌恩生物科技有限公司，采用NGS二代測序方法進行全基因測序。首先采用Clustal X 1.83軟件分析比對基因序列，再應(yīng)用DNAstar中的Megalign程序進行同源性分析，MEGA 5.0軟件Neighbor-joining方法構(gòu)建遺傳進化樹。基因片段拼接后獲得基因全長核苷酸序列，與GenBank中登錄的GAstV毒株相應(yīng)序列進行對比分析。參考毒株基因組GenBank登錄號及信息見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列特征

由序列分析可知，AstV/AHHX基因全長7 251 nt，包含2個非編碼區(qū)（5′UTR和3′UTR）和3個開放閱讀框（ORF1a、ORF1b和ORF2），GenBank登錄號為ON971223 。ORF1a、ORF1b和ORF2長度分別為3 255、1 551和2 115 nt，分別編碼1 084、516和704個氨基酸。將AstV/AHHX與GenBank登錄的24個水禽源的GAstV毒株相應(yīng)序列進行對比分析，顯示存在2種核苷酸序列差異顯著的基因型。AstV/AHHX與GAstV-I基因型AHDY棟和FLX株的核苷酸序列具有明顯區(qū)別，與其余N-GAstV毒株具有相似的序列特征。

2.2 全基因序列進化分析

采用MEGA分析軟件，將AstV/AHHX與其他N-GAstV基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結(jié)果表明，AstV/AHHX與2022年國內(nèi)分離株GDZJ37，以及2021年山東分離株G538和G576，聚集為同一組，尤其是毒株GDZJ37的遺傳距離較近。此外，與鴨源分離株SDXT和AstV/SDTA的遺傳距離較遠(yuǎn)，與2018年的安徽分離株AHAU5、AHAU3遺傳距離也相對較遠(yuǎn)。

2.3 氨基酸同源性分析

對2種基因型GAstV開放閱讀框編碼的氨基酸序列進行同源性比較。結(jié)果表明，不同N-GAstV毒株的ORF1a、ORF1b、ORF2同源性分別為93.4%～100%、98.3%～100%、96.8%～100.90%。進一步分析可知，安徽分離株AstV/AHHX與其他N-GAstV的ORF1a、ORF1b、ORF2同源性分別為94.0%～100%、99.0%～100%、97.60%～100.90%，其中ORF1a和ORF1b同源性最高的分別是分離株AHAU3、AAstV/Goose/CHN/2021/ZY02，ORF2同源性最高的毒株G538、G576、GDZJ37。AstV/AHHX與鴨源N-GAstV毒株SDXT、AstV/SDTA的ORF1a同源性稍低，分別為94.0%、94.6%；但ORF1b、ORF2同源性平均值高達99.50%、98.45%。與2個GAstV-I毒株ORF1a、ORF1b、ORF2的同源性較低，平均分別為46.0%、60.6%、38.6%（表2）。

2.4 ORF2氨基酸序列變異位點分析

對N-GAstV的ORF2氨基酸序列位點分析，顯示共有12氨基酸變異位點（同一位點大于兩個毒株發(fā)生變異），分別是第36（Y/S/H）、60（V/I）、224（T/A）、228（A/S/T）、229（P/Q）、289（T/A）、376（T/A）、456（D/E）、540（Q/L）、608（S/T）、610（E/D/G）、614（N/A/T）位氨基酸（表3），其中，第36、228、610、614位氨基酸變異程度較高，存在3種不同的氨基酸類型。

3 討論

近年來，新型鵝星狀病毒病給我國鵝養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，由于目前缺少商品化的疫苗，因此預(yù)防該病具有一定的難度。該研究獲得了安徽分離株AstV/AHHX的全長基因，序列分析顯示具有新型鵝星狀病毒基因結(jié)構(gòu)特征，結(jié)合前期AstV/AHHX引起病鵝的臨床癥狀、流行特點，以及剖檢可見雛鵝內(nèi)臟器官尿酸鹽大量沉積和明顯的關(guān)節(jié)腫脹等病變特點，可判斷AstV/AHHX是典型的新型鵝星狀病毒。進一步分析顯示，AstV/AHHX與2022年國內(nèi)的分離株GDZJ37以及2021年山東分離株G538和G576的遺傳距離較近；且與三者的ORF2氨基酸序列同源性也高達100%，ORF1a和ORF1b的同源性達99.6%以上。毒株AstV/AHHX分離于2021年，GDZJ37、G538和G576均為近兩年國內(nèi)的流行株^［16］，推測它們由同一毒株演化而來。

ORF2基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白不僅可作為分型的主要依據(jù)，還與病毒的致病性密切相關(guān)^［17-18］。在外界環(huán)境的選擇壓力下，該區(qū)域氨基酸的突變可能有助于病毒適應(yīng)新的宿主。該研究對ORF2氨基酸序列的位點進行了分析，結(jié)果顯示共有12高變異位點，分別是第36（Y/S/H）、60（V/I）、224（T/A）、228（A/S/T）、229（P/Q）、289（T/A）、376（T/A）、456（D/E）、540（Q/L）、608（S/T）、610（E/D/G）、614（N/A/T）位氨基酸。有相關(guān)研究表明，在ORF2中第224、228、229、608、614位的氨基酸突變可能導(dǎo)致病毒蛋白質(zhì)的構(gòu)象及功能發(fā)生變化，進而改變病毒的致病能力^［19-20］，但這些高變異氨基酸位點的具體功能需開展進一步研究。

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