摘要 中國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國，然而由于病毒病的存在，嚴(yán)重制約了甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，建立通用的脫毒組培體系、高靈敏度的檢測體系及高效的種薯（苗）繁育體系對(duì)甘薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。對(duì)12個(gè)主栽品種進(jìn)行莖尖脫毒處理，建立了通用的脫毒組培體系MS+2 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，大多數(shù)品種的再生率在58%以上；獲得SPFMV、SPCSV、SPLV、SPCFV和SPVG這5種病毒的特異性引物，該引物對(duì)病毒檢測極限依次為10^-6、10^-1、10^-4、10^-3和10^-3，具有較高的靈敏性；對(duì)脫毒品系進(jìn)行篩選，獲得優(yōu)良脫毒株系甘12和粉薯2-2；建立脫毒種薯（苗）的三級(jí)繁育體系，即組培苗（一級(jí)）擴(kuò)繁，溫網(wǎng)室基質(zhì)苗（二級(jí)）扦插擴(kuò)繁和網(wǎng)棚大田苗（三級(jí)）繁育生產(chǎn)用種；進(jìn)行洗苗速率（帶根和不帶根）對(duì)比試驗(yàn)，移栽方式（帶根和不帶根）與每孔移栽棵數(shù)（1～3棵）的雙因素試驗(yàn)，結(jié)果表明不帶根處理可顯著提升洗苗速率，育苗前期每孔移栽棵數(shù)（1～3棵）在株高、莖粗、節(jié)間數(shù)方面無顯著差異，帶根處理前期生長具有優(yōu)勢，但二者成活率無顯著差異，并不影響育苗結(jié)果。因此，該研究有利于甘薯病毒病防治、脫毒種薯（苗）推廣和育苗成本的降低。

關(guān)鍵詞 甘薯；莖尖脫毒；病毒檢測；脫毒繁育體系；組培苗移栽方式

中圖分類號(hào) S 531 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）16-0033-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.16.007

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Virus-free and Seedling Propagation Techniques of Sweet Potato

QU Yu-yang¹，LIU Xun-long¹，YAO Feng² et al

（1. College of Horticulture and Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University Key Laboratory of Potato Biology and Biotechnology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Wuhan， Hubei 430000;2. Hongan County Ruifeng Breeding Specialized Cooperative， Huanggang， Hubei 438000）

Abstract China is the largest sweet potato producer in the world. However， the development of the sweet potato industry is severely constrained by viral diseases. The establishment of a universal virus-free tissue culture system， a highly sensitive detection system， and an efficient seed potato （seedling） breeding system are of great significance for the development of the sweet potato industry. A total of 12 main cultivars were subjected to shoot-tip virus elimination treatment using a universal tissue culture system MS+2 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA， with regeneration rates of over 58% for most cultivars. Specific primers for five viruses， namely SPFMV， SPCSV， SPLV， SPCFV and SPVG， were obtained. The detection limits of these primers for the viruses were 10^-6， 10^-1， 10^-4， 10^-3 and 10^-3， respectively， indicating high sensitivity. Virus-free lines were selected， and excellent virus-free strains Gan 12 and Fenshu 2-2 were obtained. A three-tier breeding system for virus-free seed potatoes was established， including tissue culture seedlings （first tier）， temperature-controlled greenhouse substrate seedlings （second tier） and field seedlings （third tier） for seed production. In addition， a comparison trial was conducted to evaluate the washing rate of seedlings （with roots and without roots）， as well as a dual-factor experiment to assess transplanting methods （with roots and without roots） and the number of transplanted seedlings per hole （1-3 plants）. Results showed that the treatment without roots significantly increased the washing rate of seedlings. There were no significant differences in plant height， stem thickness， and internode number among groups with different numbers of transplanted seedlings （1-3 plants） during the early stage of seedling growth. The treatment with roots had advantages in early growth， but did not significantly affect the survival rate or the final result of seedling growth. Therefore， this study was beneficial for the prevention and control of sweet potato viral diseases， the promotion of virus-free seed potatoes， and the reduction of seedling production costs.

Key words Sweet potatoes;Stem tip detoxification;Virus detection;Virus-free breeding system;Transplantation method of tissue culture seedlings

基金項(xiàng)目 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)橫向項(xiàng)目“紅安苕脫毒種苗生產(chǎn)、病毒檢測和繁育技術(shù)體系研究”。

作者簡介 曲玉陽（1997—），男，山東煙臺(tái)人，碩士研究生，研究方向：甘薯脫毒組培快繁及栽培模式。*通信作者，副教授，博士，從事馬鈴薯種薯繁育與農(nóng)機(jī)農(nóng)藝融合研究。

收稿日期 2023-09-01

甘薯（Ipomoea batatas L.）是世界范圍內(nèi)一種重要的糧食作物，在全球糧食作物生產(chǎn)中，總產(chǎn)量排名第7位^［1］，其中中國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國^［2］。因甘薯具有高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、耐熱抗旱、適應(yīng)性強(qiáng)及營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)^［3］，在保障我國糧食安全方面發(fā)揮了重要的作用^［4］。紅安苕是全國第一個(gè)授權(quán)的地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，因適宜紅安縣獨(dú)特的環(huán)境和氣候條件，已成為革命老區(qū)紅安“1+X”的農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)。紅安縣甘薯種植面積有1萬hm²，年產(chǎn)量達(dá)37萬t^［5］。由于長期無性繁殖，導(dǎo)致品質(zhì)退化、產(chǎn)量降低^［6］，嚴(yán)重制約了紅安苕產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。

據(jù)報(bào)道，在全世界有30多種病毒侵染甘薯^［7］，我國報(bào)告了20種甘薯病毒^［8］，主要有甘薯羽狀斑駁病毒（sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯褪綠矮化病毒（sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）、甘薯潛隱病毒（sweet potato latent virus，SPLV）、甘薯褪綠斑病毒（sweet potato chlorotic fleck virus，SPCFV）和甘薯G病毒（sweet potato virus G，SPVG）等^［9］。盡早發(fā)現(xiàn)這些病毒并采取積極有效的防治措施是非常必要的，目前甘薯莖尖脫毒是防治病毒病最有效的方法^［10-11］。其原理是利用植物莖尖頂端分生組織中不含有病毒的特性，剝離莖尖，離體培養(yǎng)，再生出無病毒侵染的健康植株^［12］。

許多學(xué)者對(duì)甘薯脫毒進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)甘薯莖尖分生組織的再生效果受萘乙酸（1-Naphthaleneaceticacid，NAA）、6-芐基氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）等激素的影響較大^［13］，適合的激素濃度配比才能獲得最佳效果^［14］；脫毒后的再生苗需要檢測，PCR技術(shù)可以檢測到微量的病毒樣本，其靈敏性是傳統(tǒng)ELISA方法的1 000倍以上，具有簡單、穩(wěn)定，不受環(huán)境影響的優(yōu)勢^［15］；傳統(tǒng)的甘薯組培苗移栽采用的是帶根移栽的方式，需要進(jìn)行洗根等處理，費(fèi)時(shí)費(fèi)工，而不帶根移栽可以有效規(guī)避上述問題，并且該方法已經(jīng)在馬鈴薯上有成熟的應(yīng)用^［16］。鑒于此，筆者以紅安主栽品種為試驗(yàn)材料，研究適合的甘薯組培脫毒及病毒檢測體系，篩選優(yōu)良株系和改進(jìn)組培苗移栽方式，以期在源頭上為紅安縣的甘薯優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

該研究用于莖尖脫毒的材料由湖北黃安苕生物科技有限公司和紅安縣瑞灃種植養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供，分別為紫檀紅、姜牌紅、騎龍紅、西瓜紅、龍薯9號(hào)、商薯19號(hào)、煙薯25號(hào)、鄂薯6號(hào)、瑞薯4號(hào)、粉薯、紫薯1和紫薯2。

SPFMV、SPCSV、SPCFV、SPLV、SPVG 5種病毒的甘薯陽性對(duì)照毒源植株，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院張振臣研究員惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 莖尖脫毒及培養(yǎng)。

選取擬脫毒主栽品種具有典型性狀、完好、無病蟲害的薯塊，催芽后取莖尖部，在40倍解剖顯微鏡下剝?nèi)?.2～0.4 mm的莖尖分生組織，放在含有0.2 mg/L NAA（萘乙酸）和1.0 mg/L 6-BA（6-芐氨基嘌呤）的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，置于20 ℃，相對(duì)濕度70%，光照時(shí)間16 h/d，光照強(qiáng)度2 000 lx條件下，誘導(dǎo)芽的分化。觀察莖尖膨大和再生出芽情況，從而對(duì)比不同品種在分化培養(yǎng)基上的再生效果。

1.2.2 病毒檢測。

采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行病毒檢測，具體方法參照劉訓(xùn)龍^［17］報(bào)道的方法進(jìn)行。引物序列如表1所示。

PCR具體的反應(yīng)體系為：樣本cDNA 1 μL，病毒的上、下游引物各0.5 μL，Mix 5 μL，用ddHO補(bǔ)足至總體積10 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，54～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35次循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取8 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電壓150 V，電泳后將膠塊放置在凝膠成像儀上觀察拍照，將呈陽性的樣品測序，測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，判斷引物特異性擴(kuò)增出的產(chǎn)物是否為目標(biāo)片段。

為了進(jìn)一步檢測引物對(duì)SPFMV、SPCSV、SPLV、SPCFV和SPVG這5種病毒的靈敏性，尋找病毒檢測的極限，對(duì)cDNA模板原液進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋，稀釋后分別為原液濃度的10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6倍，將稀釋液作為擴(kuò)增模板，在相同反應(yīng)體系及反應(yīng)條件下再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3 脫毒品系田間比較試驗(yàn)。

將獲得的檢測無病毒株系移栽到大田，栽培地點(diǎn)在湖北紅安縣龍?zhí)端麓澹N植方式如下：100 cm壟距、埋5節(jié)、6萬棵/hm²的密度、33.35 cm株距，每壟雙行種植，每小區(qū)重復(fù)4次，田間種植120 d后進(jìn)行測產(chǎn)。甘薯根據(jù)不同用途，對(duì)商品薯大小的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)也不同，鮮食蒸煮精品薯質(zhì)量需控制在100～250 g、烘烤精品薯質(zhì)量需控制在250～500 g，淀粉加工精品薯質(zhì)量需控制在500 g以上。收獲時(shí)測量各分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)下的產(chǎn)量，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為<100 g、>100～250 g、>250～500 g、>500 g，最終保留符合原品種的典型性狀且商品率高的株系。

1.2.4 脫毒種薯（苗）的繁育。

將篩選出的優(yōu)良株系對(duì)應(yīng)的組培苗進(jìn)行組培擴(kuò)繁，于3月上旬，在大棚基質(zhì)槽中按12 cm×12 cm的株行距移栽，待苗長至45 cm以上時(shí)剪取4～5節(jié)莖段再擴(kuò)繁，按15 cm×15 cm的株行距在基質(zhì)大棚內(nèi)扦插擴(kuò)繁，擴(kuò)繁的苗于6月中旬后剪取節(jié)段用于田間生產(chǎn)。9月中下旬，剪取棚苗4～5節(jié)莖段生產(chǎn)微型薯，11月下旬可采收薯塊。

1.2.5 組培苗不同洗苗和移栽方式對(duì)比試驗(yàn)。

組培苗的移栽設(shè)置了帶根移栽和不帶根移栽2種方式。帶根處理，進(jìn)行洗根和修根（留1 cm根）操作；不帶根處理，直接從培養(yǎng)基上部約0.5 cm處剪斷植株，并將苗子簡單沖洗一下。試驗(yàn)設(shè)置5次重復(fù)，每重復(fù)100瓶，每瓶2棵苗子，記錄用時(shí)。

采用穴盤移栽，穴盤規(guī)格為27.5 cm × 35.00 cm。帶根移栽處理A1，不帶根移栽處理A2；每孔移栽棵數(shù)包括B1處理（1棵）、B2處理（2棵）、B3處理（3棵）。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，每重復(fù)3盤，每盤30棵苗子。B1處理株行距為4.58 cm × 5.00 cm，B2處理株行距為5.83 cm × 6.88 cm，B3處理株行距為13.75 cm × 6.88 cm。28 d后統(tǒng)計(jì)成活率、株高、莖粗和節(jié)間數(shù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析方法。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先采用Excel 2021軟件初步統(tǒng)計(jì)分析；百分?jǐn)?shù)采用“百分?jǐn)?shù)反正弦（sin^-1y）轉(zhuǎn)換表”轉(zhuǎn)換后再分析；采用DPS 5.0軟件進(jìn)行Duncan’s新復(fù)極差法顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種甘薯莖尖分化效果

將剝離的甘薯莖尖放置在上述莖尖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，7 d左右的時(shí)間，莖尖有明顯變化，開始膨大、變綠，30 d左右誘導(dǎo)出大量愈傷組織，2～3個(gè)月開始由愈傷組織分化成植株。

由表2可知，在莖尖培養(yǎng)基下，愈傷率較高的是紫檀紅、紫薯2、西瓜紅、龍薯9號(hào)、煙薯25號(hào)、濟(jì)薯25號(hào)、商薯19號(hào)，為100%，最低的是粉薯，為40.00%；植株率最高的是煙薯25號(hào)，為100%，最低的是紫薯1，為5.26%。從愈傷率和植株率來看，該莖尖培養(yǎng)基利于大部分品種成愈傷和成植株。

2.2 脫毒甘薯主要病毒檢測

以張振臣教授惠贈(zèng)的甘薯陽性毒源植株為模板，利用設(shè)計(jì)好的特異性引物（表1）進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)了預(yù)期特異目標(biāo)帶，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物測序，產(chǎn)物序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，結(jié)果見圖1～5。同源性結(jié)果顯示，SPFMV為98.72%，SPCSV為99.37%，SPLV為98.19%，SPCFV為93.78%，SPGV為94.82%。

在相同反應(yīng)體系及反應(yīng)條件下再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，SPFMV、SPCSV、SPLV、SPCFV和SPVG這5種病毒的檢測極限依次為10^-6、10^-1、10^-4、10^-3和10^-3（圖6）。

2.3 脫毒品系比較試驗(yàn)

紫檀紅屬于鮮食蒸煮型品種，100～250 g為其商品薯重范圍。120 d后收獲“紫檀紅”薯塊，分級(jí)結(jié)果見表3。由表3可知，甘12品系在該范圍內(nèi)優(yōu)于其他品系，且在其他分級(jí)范圍內(nèi)也是最優(yōu)品系。

粉薯為淀粉加工型品種，>500 g為其商品薯重范圍，120 d后收獲粉薯薯塊，分級(jí)結(jié)果見表4。由表4可知，粉薯2-2品系在該范圍內(nèi)明顯優(yōu)于其他品系，且在其他分級(jí)范圍內(nèi)也是較優(yōu)品系。

2.4 紅安主栽甘薯品種三級(jí)苗繁育體系的建立

將組培苗與扦插擴(kuò)繁苗的結(jié)薯情況對(duì)比發(fā)現(xiàn)，由組培苗發(fā)育長成的薯塊小而癟，有的甚至沒有發(fā)育出薯塊（圖7）。

結(jié)合上述特征進(jìn)行甘薯脫毒種薯繁育體系的探究，建立紅安主栽甘薯品種三級(jí)苗繁育體系（圖8）：一級(jí)苗為脫毒組培苗，是脫毒甘薯繁育體系的源頭，直接影響種薯增產(chǎn)提質(zhì)的效果，關(guān)系到脫毒甘薯能否可持續(xù)健康發(fā)展下去；二級(jí)苗為溫網(wǎng)室基質(zhì)苗，這一級(jí)苗主要是脫毒組培苗在基質(zhì)苗床中進(jìn)行大量擴(kuò)繁，用作大田生產(chǎn)繁育種苗，其繁殖系數(shù)比組培條件下大大提高，二級(jí)苗可直接生產(chǎn)微型薯（原原種），從組培苗到生產(chǎn)用種可以在1年內(nèi)完成；三級(jí)苗為網(wǎng)棚大田苗，微型薯（原原種）在溫室網(wǎng)棚中催芽，為三級(jí)苗，然后移栽在大田里繁育生產(chǎn)用種（原種和良種）。

2.5 組培苗不同洗苗和移栽方式對(duì)比試驗(yàn)分析

由表5可知，組培苗不同洗苗方式在洗苗速率方面差異顯著，不帶根處理的速率要顯著快于帶根處理，采用不帶根處理可提升生產(chǎn)效率。

移栽28 d后測量各指標(biāo)結(jié)果見表6。由表6可知，在成活率方面，各個(gè)處理間無顯著差異；在株高方面，A1B1、A1B2和A1B3處理顯著優(yōu)于其他處理組合；在莖粗方面，A1B1、A1B2和A1B3處理間無顯著差異，且A1B1和A1B3處理顯著優(yōu)于其他3個(gè)處理；在節(jié)間數(shù)方面，A1B1、A1B2和A1B3處理間無顯著差異，且A1B1處理顯著優(yōu)于其他3個(gè)處理。

3 結(jié)論與討論

莖尖脫毒是目前防治甘薯病毒病最有效的措施^［18］，而合適的激素配比是脫毒成功的重要因素之一。董芳等^［19］發(fā)現(xiàn)，將湘薯15號(hào)和湘薯19號(hào)的莖尖外植體培養(yǎng)在不同6-BA和NAA組合下，植株率最高的植物激素配比為MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NNA和MS+2.0 mg/L 6-BA+0.67 mg/L NNA，分別為40.7%和57.8%。阮先樂等^［20］發(fā)現(xiàn)，豫薯12植株率最高的植物激素配比為MS+0.3 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NNA，植株率為72.3%。該研究以紅安12個(gè)主栽品種為試驗(yàn)材料，對(duì)比不同品種在分化培養(yǎng)基上的再生效果，從成愈傷率和成植株率的結(jié)果來看，不同的甘薯品之間存在差異，這與胡琳琳等^［9］的研究結(jié)果一致。除粉薯愈傷率較低，僅40%外，其他品種的愈傷率均在70%以上，紫檀紅、粉薯、紫薯2、西瓜紅、龍薯9號(hào)、煙薯25號(hào)和騎龍紅的植株率均在58%以上，說明該莖尖培養(yǎng)基利于大部分品種成愈傷和成植株。

采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行病毒檢測，關(guān)鍵是獲得特異性引物。趙冬蘭等^［21］設(shè)計(jì)了SPFMV特異性引物，進(jìn)行RT-PCR檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果與報(bào)道序列同源性達(dá)98.6%，可以確定擴(kuò)增產(chǎn)物為SPFMV病毒基因片段；該試驗(yàn)針對(duì)5種主要病毒設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增條帶符合預(yù)期，擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果與報(bào)道序列同源性均在93%以上，表明所得引物可靠。

該試驗(yàn)將SPFMV、SPCSV、SPLV、SPCFV和SPVG這5種病毒的cDNA模板進(jìn)行10倍梯度濃度稀釋，最終結(jié)果顯示5種病毒的檢測極限依次為10^-6、10^-1、10^-4、10^-3和10^-3。說明在病毒濃度較低時(shí)，該方法也可以檢測出病毒，這與薛超^［22］的研究結(jié)果一致，但是對(duì)于SPCSV的引物設(shè)計(jì)可做進(jìn)一步優(yōu)化。

在優(yōu)良株系篩選方面，主要目的是淘汰地上部生長異樣、產(chǎn)量低及結(jié)薯性狀不佳的株系^［23］，保留符合原品種的典型性狀且商品率高的株系，但是由于各品種的脫毒時(shí)間和脫毒后的成苗時(shí)間不同，該試驗(yàn)?zāi)壳爸煌瓿闪俗咸醇t“紫檀紅”和“粉薯”的篩選，后續(xù)將完成剩下幾個(gè)品種的評(píng)比篩選試驗(yàn)。

在繁育體系方面，組培苗的薯塊小而癟，有的甚至沒有發(fā)育成薯塊，可能是由于前期組培苗不適應(yīng)由組培環(huán)境換至大田環(huán)境，主要進(jìn)行營養(yǎng)生長，根系深扎，汲取營養(yǎng)，所以不宜用組培苗直接生產(chǎn)種薯。甘薯是通過塊根催芽和藤蔓扦插進(jìn)行繁殖的，但整個(gè)繁殖期間容易遭受病毒侵染。該研究的三級(jí)繁育體系可在1年內(nèi)獲得微型薯（原原種），省去了微型薯繁育原種的中間環(huán)節(jié)，節(jié)省了成本，減少了病毒侵染的機(jī)會(huì)。

在組培苗移栽方式方面，主要目的是提升移栽效率，優(yōu)化繁育體系。試驗(yàn)結(jié)果顯示，不帶根處理的洗苗速率是帶根處理的近3倍；每孔移栽棵并不影響苗子生長；帶根移栽處理雖在前期生長具有優(yōu)勢，但是二者在成活率方面無顯著差異，因育苗階段只要苗子健壯就可移栽。因此，可采用不帶根、每孔種2顆或者3棵的方式育苗，降本增效。

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