［摘要］精原干細胞（SSC）是睪丸中最原始的生殖細胞，通過自我更新和連續(xù)分化最終成為成熟的精子，SSC對維持高效的精子發(fā)生起著至關重要的作用，與生精微環(huán)境（niche）之間復雜的分子和細胞相互作用構成了精子發(fā)生的基礎。以往認為niche主要由睪丸支持細胞構成，而新近研究表明，睪丸內(nèi)多種細胞、分子信號通路均參與調(diào)控SSC的自我更新及分化。本文就睪丸生精微環(huán)境調(diào)控SSC自我更新及分化的研究進展進行綜述。

［關鍵詞］成體生殖干細胞；細胞自我更新；細胞分化；精子發(fā)生；綜述

［中圖分類號］R321.1［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2024）03-0462-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.079［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網(wǎng)絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240521.1613.001;2024-05-2209：09：25

Research advances in the regulatory mechanism of self-renewal and differentiation of spermatogonial stem cellsPAN Yu， LI Wen-xin， ZHANG Yunchao， JING Tao（Department of Andrology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266000， China）

［Abstract］Spermatogonial stem cells （SSC） arethe most primitive germ cells in the testis and develop into mature sperms through self-renewal and continuous differentiation. SSC play an important role in maintaining efficient spermatogenesis， and the complex molecular and cellular interactions between SSC and microenvironment （also called niche） form the basis of spermatogenesis. Previous studies believed that the niche was mainly composed of Sertoli cells， but recent studies have shown that various types of cells and molecular signaling pathways in the testis are involved in the regulation of the self-renewal and differentiation of SSC. This article reviews the research advances in the microenvironment for spermatogenesis in the testis in regulating the self-renewal and differentiation of SSC.

［Key words］adult germline stem cells; cell self-renewal; cell differentiation; spermatogenesis; review

精原干細胞（SSC）是睪丸中最原始的生殖細胞，精子發(fā)生是一個需要SSC在自我更新和分化中達到平衡并最終源源不斷產(chǎn)生單倍體精子的過程。一方面，SSC自我更新可以維持干細胞池的細胞數(shù)量，從而確保男性在生命的大部分時間里可以持續(xù)生精；另一方面，SSC分化則是生成成熟精子所必經(jīng)的過程。睪丸內(nèi)生精微環(huán)境（niche）在調(diào)控SSC自我更新以及分化的過程中發(fā)揮重要作用，睪丸內(nèi)niche的形成不僅需要支持細胞、間質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、管周肌樣細胞（PMC）、巨噬細胞等多種細胞的相互支持，各種調(diào)節(jié)因子也在niche中發(fā)揮調(diào)控SSC自我更新和分化作用。近年來對SSC體外培養(yǎng)體系的探索帶動了niche的相關研究，新近研究報道體外培養(yǎng)的小鼠SSC可以保留自我更新能力，而且在移植入生精功能衰竭的小鼠睪丸后可以重新恢復持續(xù)的精子發(fā)生過程[1]。本文擬綜述睪丸內(nèi)niche對SSC自我更新和分化調(diào)控機制的研究進展，以期為改進SSC體外培養(yǎng)體系提供理論依據(jù)，有助于臨床診治因SSC功能受損而導致的男性不育疾病。

1參與睪丸內(nèi)niche的細胞類型及其作用

1.1睪丸支持細胞（SC）

通常認為SC是組成睪丸內(nèi)niche最重要的細胞，其主要作用是維持睪丸生精小管的管腔結構，維持血-睪屏障（BTB）的完整性。新近單細胞測序研究提示，SC可以分為a、b、c 3種亞群，除了管腔結構的支撐作用，各亞群SC還具有不同的調(diào)控生精功能：a亞群表現(xiàn)出干細胞的一些特征，b亞群主要參與調(diào)控代謝功能，c亞群主要功能是吞噬生殖細胞及其代謝廢物[2]。SC的3個亞群同時存在并在成人睪丸niche中保持穩(wěn)定狀態(tài)，從而維持生精小管的基本結構，也保障了睪丸內(nèi)niche穩(wěn)態(tài)。目前已認識到SC在生精過程中通過分泌多種細胞因子、調(diào)節(jié)BTB和吞噬凋亡的生精細胞等多種途徑發(fā)揮重要的支持和調(diào)控作用。

1.1.1分泌多種細胞因子SC能夠產(chǎn)生抗繆勒管激素（AMH），AMH參與決定性別分化并反向調(diào)節(jié)SC的發(fā)育；分布在SC表面的雄激素受體和轉(zhuǎn)鐵蛋白可協(xié)同促進精子發(fā)生過程；SC還可以產(chǎn)生雄激素結合蛋白，從而維持睪丸內(nèi)niche高水平的雄激素。此外，SC還被證實可以產(chǎn)生多種調(diào)控因子，其中研究較多的包括膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）[3]、A型血小板源性生長因子[4]、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）家族成員及其受體[5]、成纖維細胞生長因子2（FGF2）[6]、表皮生長因子[7]等，這些細胞因子均在精子發(fā)生的不同階段發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

新近研究發(fā)現(xiàn)，SC通過旁分泌作用產(chǎn)生的調(diào)控因子對于調(diào)控精子發(fā)生、維持SC自身功能穩(wěn)態(tài)亦有重要作用[8]。國內(nèi)研究提示，精漿中來源于SC的外泌體不僅可以作為精索靜脈曲張疾病造成SC功能損傷的標志物，還可以作為非梗阻性無精子癥病人的精子發(fā)生預測標志物[9]。除此以外，在小鼠動物實驗中還發(fā)現(xiàn)SC來源的外泌體通過調(diào)控多種miRNA分子，不僅可以與睪丸SC發(fā)生互動作用進而調(diào)控睪丸內(nèi)niche的雄激素水平[10]，還可以通過E3-Zeb2-MAPK信號通路調(diào)控SSC的增殖和分化[11]。在生精小管中，SC分泌的外泌體可促進SSC的分化，而未分化A型精原細胞分泌的外泌體則抑制SSC增殖。未成熟SC來源的外泌體可促進睪丸間質(zhì)細胞（LC）的存活并抑制其類固醇的合成。

1.1.2調(diào)節(jié)BTB相鄰SC之間建立的緊密連接、黏附連接和縫隙連接是構成BTB的結構基礎。Cldn11已被證實是BTB的重要成分，可以促進SSC穿過BTB結構并定植于野生型小鼠睪丸的生精小管基膜，而Cldn11的缺失可以導致SSC不能有效遷移和定植，進而引起不育[12]。

1.1.3吞噬凋亡的生精細胞SC還可以通過黏附和吞噬作用促進凋亡細胞的解體，當SC表達FasL，同時生精細胞表達Fas，二者相結合就會使生精細胞進入凋亡程序，這是精子發(fā)生過程中所必需的步驟。

1.2LC

睪丸生精小管之間分布的疏松結締組織即睪丸間質(zhì)，在睪丸間質(zhì)內(nèi)負責合成雄激素的內(nèi)分泌細胞即LC，LC常成群分布于睪丸間質(zhì)微血管的鄰近區(qū)域，新近報道顯示LC可能源自TCF21+間充質(zhì)細胞[13]。對人類睪丸組織進行單細胞測序分析，結果顯示睪丸LC與SC起源于同一個異質(zhì)祖細胞亞群，表明睪丸LC與SC具有同源性[14]。LC主要作用是分泌產(chǎn)生睪酮，除了睪酮，LC還生成一些在調(diào)控精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用的因子，例如白細胞介素1α[15]、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）[16]、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）[17]等，這些因子可以通過調(diào)控內(nèi)源性睪酮生成或LC代謝功能從而參與調(diào)控精子發(fā)生過程。SC所釋放的外泌體可以穿過BTB并顯著增加LC的Cc趨化因子配體20（Ccl20）表達水平，而Ccl20可以促進LC中蛋白激酶B的磷酸化，進而維持LC的功能穩(wěn)態(tài)。最新研究顯示，來自骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體，可以通過AMPK-mTOR信號通路增強LC的細胞自噬，從而改善環(huán)磷酰胺導致的LC合成睪酮能力下降，為環(huán)磷酰胺導致低睪酮血癥提供新的治療靶點[18]。

1.3PMC

PMC是一群平滑肌細胞，包裹著睪丸曲細精管，是曲細精管管壁的主要細胞成分，通過PMC節(jié)律性收縮可以推動管腔內(nèi)液體流向睪丸網(wǎng)，對于精子的睪丸內(nèi)運輸具有重要作用。PMC的節(jié)律性運動主要受LC分泌的抗利尿激素、縮宮素、前列腺素等調(diào)控，GATA4可以減弱PMC的收縮功能，PMC收縮功能降低與男性少/弱精子癥有關。另外，PMC還參與構成BTB，PMC的結構或功能發(fā)生改變時可出現(xiàn)細胞外基質(zhì)異常沉積或形態(tài)變化，進而影響正常的精子發(fā)生過程。新近研究顯示，褪黑素可以通過調(diào)控PMC的免疫反應、炎癥因子分泌以及細胞順應性等多種途徑，影響B(tài)TB維持正常生精過程的功能[19]。另有動物實驗證實，PMC可以表達雄激素受體，通過與LC的協(xié)同作用，調(diào)控睪丸內(nèi)niche的雄激素水平，從而確保正常的精子發(fā)生過程[20]。

1.4巨噬細胞

睪丸巨噬細胞分布于睪丸間質(zhì)內(nèi)和生精小管基底部，位于生精小管基底側的巨噬細胞數(shù)量可以隨著SSC的增加而增多，其可以分泌促進SSC增殖和誘導分化的細胞因子，例如集落刺激因子1（CSF1）、與合成維甲酸（RA）相關的酶等。既往研究顯示，生精小管管周巨噬細胞的缺失可以導致SSC分化進程中斷，目前發(fā)現(xiàn)從巨噬細胞分離所得的外泌體可以保護精原細胞免受輻射損傷，進而促進正常的生精過程。最新研究顯示，生精小管管周巨噬細胞在出生前已經(jīng)出現(xiàn)于胎兒睪丸內(nèi)，且胎兒睪丸間質(zhì)內(nèi)的巨噬細胞和生精小管管周巨噬細胞均主要來源于胎肝源性前體細胞，而在出生后睪丸發(fā)育過程中，骨髓源性細胞并未對睪丸巨噬細胞池的補給有實質(zhì)性作用[21]。

1.5睪丸內(nèi)皮細胞（TEC）

TEC是睪丸內(nèi)niche的重要組成部分，能夠分泌FGF2、基質(zhì)細胞衍生因子-1、巨噬細胞炎癥蛋白2、胰島素樣生長因子結合蛋白2以及一氧化氮（NO）等多種調(diào)節(jié)因子，其中NO可抑制睪丸LC產(chǎn)生雄激素，F(xiàn)GF2可促進TEC產(chǎn)生GDNF，而且TEC是睪丸內(nèi)GDNF的主要來源。新近研究證實，TEC能夠在沒有外源性GDNF的體外培養(yǎng)環(huán)境中維持SSC的正常增殖，而且TEC分泌產(chǎn)生的調(diào)節(jié)因子可以顯著促進細胞毒性損傷后生精上皮的再生[22]。另有研究顯示，人睪丸內(nèi)TEC的衍生外泌體可能在精子發(fā)生過程中作為潛在的效應因子發(fā)揮重要調(diào)控作用[23]。

1.6淋巴管內(nèi)皮細胞（LEC）

LEC位于生精小管和睪丸間質(zhì)交界處，覆蓋于淋巴管的表面?？拷芟到y(tǒng)的LEC可以產(chǎn)生多種FGF（例如FGF4、FGF5、FGF8等），從而進一步促進Gfrα1+的SSC持續(xù)自我更新，這對于維持SSC細胞池的細胞數(shù)量是非常重要的[24]。

2參與睪丸內(nèi)niche調(diào)節(jié)因子作用機制

睪丸內(nèi)niche存在大量各類調(diào)節(jié)因子，在不同年齡階段發(fā)揮不同的作用，調(diào)控SSC持續(xù)進行自我更新或啟動分化，從而維持SSC細胞池中足夠多的細胞數(shù)量和正常的男性生育力；而且，SSC還會根據(jù)niche中調(diào)節(jié)因子的變化，在自我更新狀態(tài)與分化狀態(tài)之間進行動態(tài)、可逆的轉(zhuǎn)換。

2.1與SSC自我更新相關的調(diào)節(jié)因子

2.1.1GDNFGDNF是已知參與調(diào)控SSC自我更新與分化的最重要的調(diào)節(jié)因子之一。GDNF家族成員通過結合未分化型SSC表面上的GFRα1/Ret受體復合物，激活PI3K/AKT、Ras-ERK、MAPK、SFK等信號途徑，進而激活SSC持續(xù)自我更新；與GDNF協(xié)同促進SSC自我更新的其他細胞因子包括FGF2、CXCL12、VEGFA等。如果未分化型SSC表面受體結構或組分發(fā)生變化，可導致SSC細胞池數(shù)量快速衰竭；而且隨著SSC進入分化過程，其細胞表面的GFRα受體表達水平也迅速降低[24]。

既往觀點認為GDNF主要來源于SC，GDNF在SC中受到內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌機制的綜合調(diào)節(jié)。XI等[25]的新近研究發(fā)現(xiàn)，卵泡刺激素可以通過激活PI3K/Akt/mTOR途徑抑制轉(zhuǎn)錄因子EB（TEEB）的核易位以減少溶酶體生物合成來抑制SC的自噬作用，從而增強SC表達GDNF并促進SSC的自我更新。另有研究顯示，腫瘤壞死因子α（TNF-α）通過核因子κB（NF-κB）依賴途徑誘導轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白（HES1）的表達從而抑制SC的GDNF表達水平[26]。國外學者SHARMA等[27]的新近研究認為，GDNF在SC中呈周期性表達，他們提出GDNF促進SSC持續(xù)自我更新的作用是通過抑制分化而不是通過促進增殖來實現(xiàn)的。還有研究顯示，GDNF的分泌和來源受到其他多種因素的調(diào)控，TEC表達GDNF的水平甚至要高于SC，而且PMC在雄激素刺激下也可以產(chǎn)生GDNF[22]。

2.1.2纖維母細胞生長因子家族（FGFs）FGFs（FGF2、FGF9等）對于維持未分化A型精原細胞的自我更新有重要作用，體外實驗已證實FGF2和GDNF可以協(xié)同促進未分化A型精原細胞的增殖，體內(nèi)過表達FGF2可以誘導未分化A型精原細胞的持續(xù)增多[22]。睪丸內(nèi)niche的FGFs來源尚存爭議，目前認為主要由SC、LEC和LC產(chǎn)生。

FGFs如何參與調(diào)控SSC自我更新和分化的分子機制目前仍不清楚。KITADATE等[28]提出SSC細胞池的細胞數(shù)量受到來自LEC的FGFs嚴密調(diào)控，認為睪丸內(nèi)niche的穩(wěn)態(tài)是通過競爭有限的FGFs來實現(xiàn)的。新近研究顯示，F(xiàn)GF2可以通過抑制RA的分解代謝進而誘導SSC的分化[29]。另有研究表明，F(xiàn)GF9也是SSC不斷增殖的重要調(diào)控因子，它通過誘導P38MAPK磷酸化、上調(diào)Etv5等靶基因進而促進SSC不斷增殖[30]，其中Etv5是ETS轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，Etv5-/-雄性小鼠可出現(xiàn)唯支持細胞綜合征的嚴重生精衰竭[31]。RAJACHANDRAN等[32]運用高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組學技術證明，LC和TEC可以分泌產(chǎn)生多效性生長因子（PTN），其在高濃度時可與FGF2競爭結合SDC受體，進而抑制FGF2介導的SSC自我更新功能。

2.1.3白血病抑制因子（LIF）LIF是髓系白血病M1細胞的分化誘導劑和增殖抑制因子，對細胞的存活、增殖和分化起著重要的調(diào)節(jié)作用。LIF在睪丸內(nèi)主要表達于PMC，其受體LIF-R主要表達于SSC。LIF在睪丸內(nèi)niche可能通過信號轉(zhuǎn)導途徑發(fā)揮生理作用，其與LIF-R/gp130受體復合物結合后，進一步激活STAT3，從而抑制SSC的分化程序；此外，LIF還可以通過激活PI3K、MEK/ERK等信號途徑，促進SSC的自我更新。新近研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)體系中加入LIF則可以促進具有高堿性磷酸酶活性的小鼠SSC細胞克隆生長，表明LIF可能在小鼠SSC體外培養(yǎng)體系中發(fā)揮重要作用[33]。

2.1.4干細胞因子（SCF）SCF廣泛表達于多種細胞，在調(diào)控細胞存活、增殖、干細胞維持、配子發(fā)生等方面均發(fā)揮重要作用，若SCF表達存在缺陷，則細胞有絲分裂、干細胞維持等生理進程都將受到破壞，甚至導致胚胎停止發(fā)育或流產(chǎn)。在生殖系統(tǒng)中，SCF主要來源于SC，并特異性作用于精原細胞，SCF通過結合其受體c-kit參與調(diào)控SSC的自我更新和分化。新近研究證實，MEK和PI3K在SCF與c-kit共同介導的細胞有絲分裂過程中都是必不可少的，在體外培養(yǎng)體系中加入MEK或PI3K抑制劑，均可以有效抑制SSC的體外增殖[34]。

2.2與SSC分化相關的調(diào)節(jié)因子

2.2.1RARA是維生素A的代謝中間產(chǎn)物，是一種誘導雄性生殖細胞分化的重要調(diào)節(jié)因子，主要由睪丸SC產(chǎn)生，缺乏RA或維生素A會導致未分化A型精原細胞的持續(xù)積累，一旦在生精上皮中重建正常的RA代謝途徑，未分化A型精原細胞即可轉(zhuǎn)變?yōu)榉只腁型精原細胞。

SSC受到RA信號途徑的調(diào)控進而啟動細胞的分化過程，是通過激活RA下游的mTORC1信號通路而實現(xiàn)的，mTORC1信號通路在 SSC中的激活可以導致未分化精原細胞的耗竭，并可上調(diào)啟動分化的相關基因（包括Ngn3、Sox3、Lin28a、Rarg等），同時維持自我更新的相關基因（包括Gfra1、Ret、Lhx1、Eomes、Pdx1等）則出現(xiàn)表達下調(diào)。新近研究顯示，Stra8在調(diào)節(jié)未分化精原細胞對RA的反應性中發(fā)揮重要作用[35]。

2.2.2Wnt/β-連環(huán)蛋白信號途徑Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑在調(diào)控SSC分化啟動過程中具有十分重要的作用。TOKUE等[36]證實，從未分化型精原細胞（Gfrα1+）到分化型精原細胞（Ngn3+）狀態(tài)的轉(zhuǎn)換即是由Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑所驅(qū)動，還發(fā)現(xiàn)SHISA6可以抑制未分化型精原細胞中的Wnt信號途徑，以維持SSC的自我更新狀態(tài)并阻止其過早進入分化進程，推測SHISA6可以作為Gfrα1+的未分化型精原細胞的新標記。

2.3睪丸內(nèi)niche的其他重要調(diào)節(jié)因子

2.3.1C-X-C趨化因子12（CXCL12）CXCL12是CXC趨化因子配體蛋白家族的一個亞型。免疫熒光染色結果顯示，CXCL12表達定位在SC，CXCL12/CXCR4信號途徑在SSC的自我更新、遷移和分化中均發(fā)揮重要作用[37]，特別是對于引導SSC正確遷徙并定植在生精小管基底側的niche至關重要。另有研究表明，CXCL12的調(diào)控機制可能與激活SSC表面的G蛋白/PI3K/AKT、G蛋白/PLC/MAPK等信號途徑有關[38]。

2.3.2CSF1CSF1是最常見的促炎細胞因子之一，與各種炎性疾病有關。CSF1在睪丸LC和部分生精小管管周細胞中都有表達，值得注意的是，CSF1受體在未分化型精原細胞中高度表達，雖然不影響未分化型精原細胞的增殖，卻增加了其干細胞特性。

3期潘瑜，等. 精原干細胞自我更新及分化的調(diào)控機制研究進展465

2.3.3Ets相關分子（ERM）已有研究證實ERM在SSC和SC中高表達，參與調(diào)控SSC的自我更新進程，過表達ERM可以增加SSC和SC中CXCL12的表達水平，進一步促進SSC的自我更新[39]；而ERM表達缺失則會導致SSC的自我更新失敗，最終產(chǎn)生唯支持細胞綜合征的病理表型。

2.3.4上游刺激因子 1（USF1）USF1是一種廣泛表達的轉(zhuǎn)錄因子，人類USF1與調(diào)節(jié)動脈血壓、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸可塑性和脂類代謝等均相關。新近研究發(fā)現(xiàn)，睪丸SSC和SC中均可檢測到USF1表達，Usf1-/-小鼠可以出現(xiàn)隨年齡增加的進行性生精功能下降，可能源于SSC無法維持穩(wěn)定的自我更新[40]。

2.3.5生殖細胞增殖相關蛋白NANOS2保守的RNA結合蛋白NANOS2是維持SSC自我更新所必需的，但其調(diào)控機制尚不完全清楚。新近研究顯示，NANOS2可與CCR4-NOT復合體相互作用，并直接結合到對SSC自我更新具有重要作用的mRNA上以調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性，進而參與調(diào)控SSC的自我更新[41]。

3總結與展望

隨著研究方法和理念不斷更新，研究者們對于睪丸內(nèi)niche調(diào)控精子發(fā)生的認知已有很大進步，除了SC，人們認識到睪丸內(nèi)的間質(zhì)細胞、PMC、LEC和上皮細胞等也具有十分重要的作用，而且某一特定的調(diào)節(jié)因子，例如GDNF或CSF1，并不能全面闡釋其在調(diào)控SSC自我更新和分化中的全部作用，因為睪丸內(nèi)niche中同一種調(diào)節(jié)因子并不全是由同一類型細胞分泌產(chǎn)生的，而且同一種調(diào)節(jié)因子在不同情形下亦可能發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用。另外，由于SSC體外培養(yǎng)體系的日益完善，新的基因檢測技術不斷涌現(xiàn)，使得我們可以檢測到SSC體外培養(yǎng)體系中更多重要的調(diào)節(jié)因子，探尋高效誘導SSC體外增殖、分化的分子機制是未來研究的熱點之一。

綜上所述，SSC的自我更新和分化受到睪丸內(nèi)niche的嚴密調(diào)控，niche的形成不僅需要特定類型細胞在結構上的支持，還需要niche中多種細胞所產(chǎn)生的特定調(diào)節(jié)因子，明確睪丸內(nèi)niche的構成對于研究精子發(fā)生至關重要，更有助于改進SSC的體外培養(yǎng)體系，從而為探尋SSC功能受損導致男性不育的發(fā)病機制提供研究基礎。

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（本文編輯劉寧）