摘要：目的 探討穿心蓮內酯對胃癌細胞鐵死亡的影響及作用機制。方法 將胃癌細胞株AGS分為陰性對照兩組（NC兩組）和穿心蓮內酯處理兩組（AG兩組），分別用含0 μm、20 μm AG的DMSO處理細胞24 h。通過CCK-8檢測分析藥物對細胞活力的影響，通過Fe2+檢測法、丙二醛測定、還原型谷胱甘肽和活性氧檢測評估胃癌細胞鐵死亡水平。通過蛋白質免疫印跡實驗評估胃癌細胞鐵死亡相關蛋白GPX4、SLC7A11表達水平。 結果 經(jīng)過AG處理后，胃癌細胞活力明顯下降，F(xiàn)e2+、MDA和ROS水平明顯升高，GSH含量明顯降低，GPX4和SCL7A11表達水平明顯下降（P＜0.05）。結論 穿心蓮內酯可通過影響鐵死亡相關蛋白GPX4和SLC7A11表達誘導胃癌細胞鐵死亡的發(fā)生。

關鍵詞：穿心蓮內酯；胃癌；鐵死亡；GPX4；SLC7A11

胃癌（gastric cancer）是常見的惡性腫瘤之一[1]。胃癌的發(fā)病機制尚不清楚，但普遍認為幽門螺旋桿菌感染、吸煙、高鹽飲食、飲酒等是主要的危險因素。目前手術是胃癌主要的治療手段，聯(lián)合應用放療、化療及靶向治療效果更佳。因此，研究分子機制途徑，gFJgGKjslonwD44g5N3T7g==開發(fā)新的胃癌治療用藥對提高胃癌生存獲益至關重要。鐵死亡（ferroptosis）是一種新的非凋亡細胞死亡模式，是多種途徑導致細胞內氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡的結果[2]。鐵死亡的基本特征包括：谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）活性喪失，導致脂質過氧化修復機制缺陷，引起脂質活性氧（reactive oxygen species，ROS）的累積。越來越多的研究報道了鐵死亡與胃癌之間的相關性，如胃癌細胞鐵死亡水平降低導致的腫瘤耐藥性[3]。穿心蓮內酯（andrographolide，AG）是從天然植物穿心蓮中萃取的二萜類內酯活性化合物。研究表明，AG具有抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤和調節(jié)免疫等功能，而AG的抗腫瘤功能更是近年來的研究熱點[4]。本研究通過觀察AG在體外實驗中對胃癌細胞鐵死亡的影響，進一步探討AG作為抗癌藥物與聯(lián)合藥物的潛能，為尋找新的抗腫瘤活性藥提供理論參考。

1材料與方法

1.1 主要材料和試劑

胃癌細胞株AGS購自普諾賽生物有限公司。穿心蓮內酯購自默克科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青-鏈霉素混合液、PBS緩沖液購自上海源培生物科技股份有限公司。胎牛血清購自賽默飛世爾科技有限公司。CCK-8試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物有限公司。鐵離子檢測試劑盒購自北京普利萊科技有限公司。丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。C11 BODIPY581/591脂質過氧化探針購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。GPX4抗體、SLC7A11抗體購自上海艾博抗有限公司。TBST緩沖液、30%丙烯酰胺、過硫酸銨（ammonium persulphate，APS）等購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將胃癌細胞株AGS在DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清及1%青-鏈霉素混合液）37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞復蘇、細胞傳代均在生物安全柜中進行，細胞凍存于-80℃冰箱。胃癌AGS細胞分為陰性對照兩組（NC兩組）和穿心蓮內酯藥物處理兩組（AG兩組）。

1.2.2 CCK-8檢測

細胞種板、加藥處理后，棄掉含有藥物的舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL新培養(yǎng)基，每孔再加入10 μL的CCK-8檢測液，在37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h。酶標儀測定450 nm處的吸光度。

1.2.3 鐵離子檢測

向樣本中加入500 μL裂解液，搖床裂解2 h。每份樣品中添加30 μL鐵離子檢測試劑，37 ℃孵育30 min。酶標儀選用550 nm波長測定吸光度。根據(jù)繪制的鐵離子檢測標準曲線及樣品蛋白濃度計算細胞內Fe2+水平。

1.2.4 丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測

細胞種板、加藥處理后，根據(jù)MDA試劑盒使用說明書，裂解液充分裂解細胞后，離心10 min后取上清液，加入TBA溶液混勻，95 ℃孵育60 min。取200 μL樣品加入96孔板中，酶標儀選用532 nm波長測定吸光度。依據(jù)繪制的MDA標準曲線及樣品蛋白濃度計算細胞內MDA水平。

1.2.5 GSH測定

細胞種板、加藥處理后，細胞刮刮下細胞，加入5 mL的PBS緩沖液，離心10 min收集細胞，按照每106個細胞加入300 μL勻漿介質，進行超聲破壁，離心后取上清置于冰上待測。根據(jù)產(chǎn)品說明書添加相關試劑，酶標儀在405 nm波長測定吸光度。依據(jù)繪制的GSH標準曲線計算細胞內GSH水平。

1.2.6 ROS檢測

細胞種板、加藥處理后，應用脂質過氧化熒光探針C11 BODIPY581/591、流式細胞儀評估細胞內ROS的水平。向待測細胞添加脂質過氧化熒光探針，在37 ℃、避光環(huán)境轉給你孵育1 h。通過流式細胞儀檢測細胞ROS水平。

1.2.7 蛋白質免疫印跡（western blot，WB）實驗

使用RIPA裂解細胞20 min后，用細胞刮刮下細胞，轉移至1.5 mL樣品管中。4 ℃離心機12 000 r/min離心15 min后取上清并提取蛋白。測定細胞蛋白濃度后，按照1：4體積添加蛋白上樣緩沖液，充分混勻后在95 ℃金屬浴中孵育5 min，在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ?5 μg蛋白樣品進行電泳、轉膜后，脫脂牛奶封閉2 h。將蛋白條帶用TBST緩沖液清洗，一抗孵育過夜。二抗室溫下孵育1 h。加入顯影液，在暗室中使用顯影儀顯影。

1.2.8 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，使用未配對t檢驗分析兩組間的差異，使用單因素方差（ANOVA）分析多組間的差異，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 穿心蓮內酯對胃癌細胞活力的影響

CCK-8實驗結果顯示：加入穿心蓮內酯后，胃癌細胞的活力明顯下降（P＜0.05）。

2.2 穿心蓮內酯對胃癌細胞鐵死亡的影響

鐵死亡相關指標檢測發(fā)現(xiàn)：加入穿心蓮內酯后，細胞Fe2+濃度、MDA水平明顯升高，GSH水平明顯下降（P＜0.05）；流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，AGS細胞發(fā)生鐵死亡而累積的ROS水平明顯升高（P＜0.05）。

2.3 穿心蓮內酯對鐵死亡相關蛋白表達水平的影響

通過提取細胞蛋白并進行WB實驗發(fā)現(xiàn)：加入穿心蓮內酯后，鐵死亡相關蛋白GPX4、SLC7A11表達水平明顯下降，鐵死亡激活。見圖6。

3討論

胃癌早期癥狀不明顯，且缺乏特異性診斷標志物，臨床上大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已處于進展期或晚期階段。鐵死亡是一種以脂質過氧化物、鐵離子累積為主要特征的程序性死亡。研究顯示，miR-375在體內外均可降低胃癌細胞的干性，直接靶向SLC7A11，并且觸發(fā)SLC7A11依賴的鐵死亡來減弱胃癌細胞的干性[5]。因此，鐵死亡作為一個潛在的腫瘤治療機制，在解決腫瘤耐藥、抑制腫瘤生長方面有廣泛的應用前景。

現(xiàn)代腫瘤治療中，天然中草藥單體因其產(chǎn)量大而穩(wěn)定、副作用少等優(yōu)點逐漸成為抗癌藥及聯(lián)合用藥的最佳來源之一。以穿心蓮內酯為代表yGeJPiSOPdLnTS3QNEyfr6Cw1AUHrZKug5aYNyG8QFo=的二萜類化合物，因其具有抗炎、調節(jié)免疫系統(tǒng)、抗腫瘤等藥理作用，為穿心蓮的藥理活性提供了廣泛的物質基礎。研究表明，穿心蓮內酯在胃癌[10]、肝癌等多種體內外腫瘤模型中具有不同的治療功效。

本研究應用胃癌細胞AGS加入穿心蓮內酯進行藥物處理細胞后開展研究。通過細胞活力和鐵死亡相關指標檢測發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內酯對AGS細胞活力具有明顯的抑制作用，能夠明顯誘導胃癌細胞鐵死亡的發(fā)生。既往研究表明，鐵死亡激活劑（如索拉非尼，埃拉斯汀等）通過直接或間接途徑靶向核心分子GPX4，從而阻斷其對復雜脂質氫過氧化反應的抑制作用，進而誘發(fā)鐵死亡[6]。本研究通過WB實驗證實，加入穿心蓮內酯處理后，胃癌細胞鐵死亡相關蛋白GPX4、SLC7A11出現(xiàn)了明顯降低，鐵死亡激活。

綜上所述，穿心蓮內酯可通過影響GPX4和SLC7A11蛋白的表達水平誘導胃癌細胞鐵死亡的發(fā)生。但是對于穿心蓮內酯影響胃癌細胞鐵死亡具體靶向的作用機制有待進一步研究，以期為胃癌綜合治療提供更加充分的用藥方案和治療靶點參考。

參考文獻

[1]閆丹措，陶嘉楠，馬秀雯，等.TRIM蛋白家族在胃癌中作用的研究進展[J].山東醫(yī)藥，2024，64（1）：102-106.

[2]賴學倩，劉俊宏，王淼蕾，等.鐵死亡與胃癌相關分子的關系及其臨床應用研究進展[J].胃腸病學和肝病學雜志，2023，32（11）：1294-1298.

[3]榮耀，董鳳源，唐明政，等.鐵死亡在胃癌發(fā)生及治療中的研究進展[J].腫瘤學雜志，2023，29（6）：470-478.

[4]王舟，汪文杰，徐偉，等.胃癌靶向治療及其耐藥機制的研究進展[J].山東醫(yī)藥，2024，64（1）：106-110.

[5]劉奇章，龔興國.穿心蓮內酯誘導胃癌細胞周期抑制和內源性凋亡[J].浙江大學學報（理學版），2017，44（4）：456-463.

[6]亓翠玲，王麗京，周鑫磊.穿心蓮內酯抗腫瘤作用機制的研究進展[J].中國中藥雜志，2007（20）：2095-2097.